CN114028619A - 一种双层人工骨膜及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明特别涉及一种双层人工骨膜及其制备方法和应用，属于生物医用材料技术领域，通过先制备致密层，再在致密层上制备疏松层。构建了双层结构的人工骨膜，将致密层和疏松层双层协同组合，致密层的表面光滑，使用时朝向软组织，能够很好地利用膜的物理屏障功能，有效阻止结缔组织长入骨缺损区，使特定组织的再生功能得到最大程度的发挥；粗糙的疏松层与自体骨成分和结构相一致，使用时朝向骨组织，能够与骨缺损面良好贴合，诱导新骨生成，并有效抑制骨肉瘤和治疗骨癌。本发明所得双层人工骨膜具有良好的力学性能和降解性能，同时还有良好的促进骨愈合，抑制骨肉瘤和治疗骨癌能力。

Description

一种双层人工骨膜及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物医用材料技术领域，特别涉及一种双层人工骨膜及其制备方法和应用。
背景技术
骨膜是被覆在除关节以外几乎所有骨表面上的致密结缔组织膜，由外部的纤维层和内部的形成层组成，在骨发育和骨折愈合中发挥着重要的作用。纤维层含有成纤维细胞、胶原和弹性纤维，神经和微血管网络，提供骨膜的机械稳定性。形成层则储存大量不同类型的细胞，为骨形成和修复提供细胞来源。骨膜可通过血管向骨组织提供营养物质，可诱导骨生长，控制骨生长方向等，在骨组织缺损的修复中起到至关重要的作用。众多研究都证明了骨膜在骨缺损修复中的重要性。相比于传统形式人工骨，骨膜还具有形成天然骨结构；在缺损处实现最佳骨整合，而不是直接逐层缝合肌肉和皮肤，使得植骨材料难以被很好的限制在缺损部位而产生脱出；能形成合适血管系统；能在缺损区形成屏障，降低异位骨化等作用。因此，有必要在骨修复过程中使用人工骨膜对植骨后的骨缺损部位进行包覆，以替代和诱导骨膜的重新形成，提升骨修复效果。
目前，临床上可使用的人工骨膜极为稀少，并且存在一定缺陷。主要为脱细胞基质膜、胶原及其矿化膜等，此类型膜存在机械性能差，湿润后力学性质会显著改变，存在围手术期破裂的风险及降解速率过快等问题。此外，还有部分骨膜以人工合成高分子聚乳酸等合成，其存在降解产物呈酸性对人体不利等问题。再者，这些人工骨膜材料为单层多孔结构，虽然能够对骨缺损部位进行修复，但是容易造成结缔组织的长入，不利于植入或植入后包覆骨缺损修复。
因此，现有技术中至少存在力学性能差，降解速率过快，与天然骨差别较大，单层多孔结构容易造成结缔组织的长入，不利于植入或植入后不能够与骨缺损面良好贴合并诱导新骨生成，不能有效抑制骨肉瘤和治疗骨癌等技术问题。
发明内容
本申请的目的在于提供一种双层人工骨膜及其制备方法和应用，以解决现有的骨膜不能有效抑制骨肉瘤和治疗骨癌的问题。
本发明实施例提供了一种双层人工骨膜的制备方法，所述方法包括：
将丝素蛋白溶解于第一溶剂中，得到丝素蛋白溶液；
将所述丝素蛋白溶液注入模具，后进行冷冻、干燥、模压和第一热交联，得到致密层；
将第一I型胶原蛋白溶解于第二溶剂中，得到第一I型胶原蛋白溶液；
将钙盐溶液加入所述第一I型胶原蛋白溶液，得到第一混合溶液；
将磷酸盐溶液加入所述第一混合溶液，得到第二混合溶液；
将亚硒酸盐溶液加入所述第二混合溶液，后进行pH调节和冷冻干燥，得到硒掺杂羟基磷灰石胶原颗粒；
将第二I型胶原蛋白溶解于第三溶剂中，得到第二I型胶原蛋白溶液；
将所述第二I型胶原蛋白溶液和所述硒掺杂羟基磷灰石胶原颗粒混合，得到硒掺杂羟基磷灰石胶原溶液；
将所述硒掺杂羟基磷灰石胶原溶液注入至所述致密层上，后进行冷冻、干燥和第二热交联，得到双层人工骨膜；
其中，所述亚硒酸盐溶液为亚硒酸钠溶液。
可选的，所述将丝素蛋白溶解于第一溶剂中，得到所述丝素蛋白溶液中；所述第一溶剂为溴化锂溶液或氯化钙三元体系溶液；所述丝素蛋白溶液质量分数为5％～20％；
所述将第一I型胶原蛋白溶解于第二溶剂中，得到所述第一I型胶原蛋白溶液中；所述第二溶剂为第一醋酸溶液；所述第一醋酸溶液的质量分数为0.3-6％；所述第一I型胶原蛋白溶液的质量分数为0.1％～2.5％；
所述将第二I型胶原蛋白溶解于第三溶剂中，得到所述第二I型胶原蛋白溶液中；所述第三溶剂为第二醋酸溶液；所述第二醋酸溶液的质量分数为0.3-6％；所述第二I型胶原蛋白溶液的质量分数为0.1％～2.5％。
可选的，所述将钙盐溶液加入所述第一I型胶原蛋白溶液中，钙离子加入的物质的量与所述I型胶原蛋白的质量比为0.002mol/g-0.02mol/g；
所述钙盐溶液包括四水硝酸钙溶液、氯化钙溶液和氢氧化钙溶液中的一种；
所述将磷酸盐溶液加入所述第一混合溶液中，磷酸根离子加入的物质的量与钙离子加入的物质的量的比值为0.667A-6A:10，其中，A为亚硒酸根离子与所述磷酸根离子的摩尔比，A的取值范围为0.03％-10％；所述pH调节的终点pH值为6-8，所述pH调节的调节剂为氨水溶液；
所述磷酸盐溶液包括磷酸氢二铵溶液、磷酸二氢铵溶液、磷酸氢二钠溶液和磷酸氢二钾溶液中的一种。
可选的，所述将所述第二I型胶原蛋白溶液和所述硒掺杂羟基磷灰石胶原颗粒混合中，所述硒掺杂羟基磷灰石胶原颗粒与I型胶原蛋白的质量比为2-4：1-3。
可选的，所述第一热交联的温度为105℃-120℃，所述第一热交联的时间为24h-48h；所述第二热交联的温度为105℃-120℃，所述第二热交联的时间为24h-48h。
基于同一发明构思，本发明实施例还提供了一种双层人工骨膜，所述双层人工骨膜包括：
致密层，所述致密层的制备材料为丝素蛋白；
疏松层，所述疏松层贴合于所述致密层一表面，所述疏松层的制备材料为硒掺杂羟基磷灰石和I型胶原蛋白的复合材料。
可选的，所述致密层的厚度为0.1mm-1.0mm；所述疏松层的厚度为0.1mm-2.0mm。
可选的，所述疏松层呈海绵状，所述疏松层的孔径为30～250μm，孔隙率为30％～80％；所述硒掺杂羟基磷灰石胶原颗粒的粒径为50nm-300nm。
基于同一发明构思，本发明实施例还提供了一种双层人工骨膜的应用，所述应用包括将双层人工骨膜用于包覆骨损伤部位；所述双层人工骨膜包括：致密层和疏松层，所述致密层的制备材料为丝素蛋白；所述疏松层贴合于所述致密层一表面，所述疏松层的制备材料为硒掺杂羟基磷灰石和I型胶原蛋白的复合材料；所述应用中，所述致密层朝向软组织，所述疏松层朝向所述骨损伤部位。
本发明实施例中的一个或多个技术方案，至少具有如下技术效果或优点：
本发明实施例提供的双层人工骨膜的制备方法，方法包括：将丝素蛋白溶解于第一溶剂中，得到丝素蛋白溶液；将所述丝素蛋白溶液注入模具，后进行冷冻、干燥、模压和第一热交联，得到致密层；将第一I型胶原蛋白溶解于第二溶剂中，得到第一I型胶原蛋白溶液；将钙盐溶液加入所述第一I型胶原蛋白溶液，得到第一混合溶液；将磷酸盐溶液加入所述第一混合溶液，得到第二混合溶液；将亚硒酸盐溶液加入所述第二混合溶液，后进行pH调节和冷冻干燥，得到硒掺杂羟基磷灰石胶原颗粒；将第二I型胶原蛋白溶解于第三溶剂中，得到第二I型胶原蛋白溶液；将所述第二I型胶原蛋白溶液和所述硒掺杂羟基磷灰石胶原颗粒混合，得到硒掺杂羟基磷灰石胶原溶液；将所述硒掺杂羟基磷灰石胶原溶液注入至所述致密层上，后进行冷冻、干燥和第二热交联，得到双层人工骨膜；其中，所述亚硒酸盐溶液为亚硒酸钠溶液；先制备致密层，再在致密层上制备疏松层。构建了双层结构的人工骨膜，将致密层和疏松层双层协同组合，致密层的表面光滑，使用时朝向软组织，能够很好地利用膜的物理屏障功能，有效阻止结缔组织长入骨缺损区，使特定组织的再生功能得到最大程度的发挥；粗糙的疏松层与自体骨成分和结构相一致，使用时朝向骨组织，能够与骨缺损面良好贴合，诱导新骨生成，并有效抑制骨肉瘤和治疗骨癌。本发明所得双层人工骨膜具有良好的力学性能和降解性能，同时还有良好的促进骨愈合，抑制骨肉瘤和治疗骨癌能力。
上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，而可依照说明书的内容予以实施，并且为了让本发明的上述和其它目的、特征和优点能够更明显易懂，以下特举本发明的具体实施方式。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。
图1是本发明实施例提供的方法的流程图；
图2是本发明实施例提供的双层人工骨膜中截面SEM结果图；
图3是本发明实施例提供的双层人工骨膜中致密层SEM结果图；
图4是本发明实施例提供的双层人工骨膜中疏松层SEM结果图；
图5是本发明实施例提供的双层人工骨膜红外图谱结果图；
图6是本发明实施例提供的双层人工骨膜对骨肉瘤细胞毒性结果图。
具体实施方式
下文将结合具体实施方式和实施例，具体阐述本发明，本发明的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方式和实施例是用于说明本发明，而非限制本发明。
在整个说明书中，除非另有特别说明，本文使用的术语应理解为如本领域中通常所使用的含义。因此，除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员的一般理解相同的含义。若存在矛盾，本说明书优先。
除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等，均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。
本申请实施例的技术方案为解决上述技术问题，总体思路如下：
现有技术中至少存在力学性能差，降解速率过快，单层多孔结构容易造成结缔组织的长入，不利于植入或植入后包覆骨缺损修复等技术问题。
本发明实施例的目的是提供一种双层人工骨膜及其制备方法，针对现有技术手段中的骨膜机械性能差，降解速率过快，单层多孔结构容易造成结缔组织的长入，不利于植入或植入后包覆骨缺损修复等技术问题。
根据本发明一种典型的实施方式，提供了一种双层人工骨膜的制备方法，所述方法包括：
S1、致密层的制备，具体包括：
S1-1、将丝素蛋白溶解于溴化锂溶液或氯化钙三元体系(氯化钙/水/乙醇摩尔比1:8:2)溶液中，获得质量分数为5％～20％的丝素蛋白溶液。
丝素蛋白选用蚕茧或蚕丝中提取的天然高分子纤维蛋白，所述丝素蛋白溶液中丝素蛋白的质量分数为5％～20％的原因：丝素蛋白质量分数过高不利于丝素蛋白溶解和使用时降解缓慢，质量分数过低影响膜力学性能和物理屏障功能；
S1-2、取步骤S1-1所得丝素蛋白溶液注入模具中，进行冷冻、干燥、模压和第一热交联，获得致密层；
所述步骤S1-2中，具体包括：
将所述丝素蛋白溶液注入模具中，在-20～-80℃条件下进行预冷冻3～24h，之后在温度-50～37℃，压强0.1～50Pa下进行冷冻体干燥24～72h，后在10～20MPa压力下模压30～60s获得致密层膜；
将所述致密层膜在真空干燥箱中于105～120℃下进行热交联24～48h得到致密层；
S2、硒掺杂羟基磷灰石胶原溶液的制备，具体包括：
S2-1、将I型胶原蛋白溶解于质量分数为0.3-6％的醋酸溶液中，其中I型胶原蛋白浓度为0.001～0.025g/ml；
相比水溶液，溶剂采用质量分数为0.3-6％的醋酸溶液有利于I型胶原蛋白的溶解，醋酸溶液浓度过低容易导致I型胶原蛋白分解变性；
胶原蛋白溶液中I型胶原蛋白浓度为0.001～0.025g/ml的原因：质量分数过高不利于胶原蛋白溶解及后续分离出沉淀并洗去杂质离子，质量分数过低形成膜力学性能差，降解速度快；
S2-2、在步骤S2-1所得I型胶原蛋白溶液中滴加钙盐溶液，其中钙离子的加入量与I型胶原蛋白的质量比为0.002～0.02mol/g；
该实施方式中，所述钙盐溶液包括四水硝酸钙溶液、氯化钙溶液和氢氧化钙溶液中的一种；
所述钙盐溶液中钙离子的摩尔量与所述胶原蛋白的质量比为0.002～0.02mol/g。钙元素添加过少，容易导致硒掺杂羟基磷灰石人工骨膜促骨组织生长及抑制骨肉瘤和治疗骨癌能力差，钙元素添加过多，容易导致钙盐的浪费或者材料中残留，羟基磷灰石不能很好的复合在膜上，使用时不能进行卷曲折叠；
S2-3、在步骤S2-2所得溶液中滴加磷酸盐溶液；
该实施方式中，所述磷酸盐溶液包括磷酸氢二铵溶液、磷酸二氢铵溶液、磷酸氢二钠溶液和磷酸氢二钾溶液中的一种；
S2-4、在步骤S2-3所得溶液中滴加亚硒酸盐溶液；
该实施方式中，所述亚硒酸盐溶液为亚硒酸钠溶液；
所述钙盐溶液中钙离子与所述磷酸盐溶液中磷酸根离子的摩尔比为10/(6～0.667A)，其中A为所述亚硒酸根离子与所述磷酸根离子的摩尔比，所述A＝0.03％～10％；
所述A＝0.03％～10％，表明所述硒掺杂羟基磷灰石中硒对磷的摩尔取代度为0.03％～10％，该范围有利于硒掺杂羟基磷灰石的形成，若A值过大，产物中容易出现水合亚硒酸钙，若A值过小，不利于硒掺杂羟基磷灰石的形成，不利于抑制骨肉瘤和治疗骨癌作用；
所述硒掺杂羟基磷灰石中硒的质量分数为0.03％～10％；是基于晶胞参数与生物学活性的考量，硒元素Se以亚硒酸根SeO3 2-的形式部分取代羟基磷灰石晶体中的磷酸根PO4 3-的位置，SeO4 4-四面体结构大于PO4 3-，在空间结构上对羟基磷灰石产生了一定影响；
所述钙元素与所述磷元素的摩尔比为10/(6～0.667A)的原因为：这是基于晶胞参数的考量，形成羟基磷灰石中钙元素与所述磷元素的摩尔比为10/6，硒元素Se以亚硒酸根SeO3 2-的形式部分取代羟基磷灰石晶体中的磷酸根PO4 3-的位置；Ca/P摩尔比过大，容易导致钙盐流失，生成产物中氧化钙比例高，影响羟基磷灰石晶体结构，过小容易导致磷盐流失，生成产物中磷酸三钙比例高，影响羟基磷灰石晶体结构；
S2-5、在步骤S2-4所得溶液中滴加氨水溶液至混合体系pH至6～8；
该实施方式中，所述混合体系pH控制在6～8是为了更好的矿化，若pH小于6容易导致羟基磷灰石矿化溶胶分解，若pH大于8容易导致胶原蛋白变性；
S2-6、将步骤S2-5所得溶液静置，分离出沉淀并洗去杂质离子，冷冻干燥得到硒掺杂羟基磷灰石胶原颗粒；
S2-7、将I型胶原蛋白溶解于质量分数为0.3-6％的醋酸溶液中，其中I型胶原蛋白质量浓度为0.1～2.5％；
S2-8、在步骤S2-7所得I型胶原蛋白溶液中加入步骤S2-6所得的硒掺杂羟基磷灰石胶原颗粒，其中加入的硒掺杂羟基磷灰石胶原颗粒与I型胶原蛋白的质量比为4:1～2:3，搅拌均匀得到硒掺杂羟基磷灰石胶原溶液；
S3、将步骤S2所述双层胶原溶液注入步骤S1所述丝素蛋白致密层模具中进行冷冻、干燥和第二热交联，获得双层双层人工骨膜。
所述步骤S3中，具体包括：
将所述步骤S2所得双层胶原蛋白溶液倒入步骤S1所得的致密层模具中，在-20～-80℃条件下进行预冷冻3～24h，之后在温度-50～37℃，压强0.1～50Pa下进行冷冻体干燥24～72h；在真空干燥箱中于105～120℃下进行热交联24～48h，依据需求进行切割、修剪，得到双层人工骨膜。
在-20～-80℃条件下进行预冷冻3～24h有利于双层人工骨膜最终成型，温度大于-20℃时冻干样品会导致骨膜最终形成后存在裂痕，低于-80℃温度条件难以满足。
在温度-50～37℃，压强0.1～50Pa下进行冷冻体干燥24～72h的原因和优点：保证冻干样品在共晶点温度下冰晶升华，保证冻干产品的结构和性能良好。
在真空干燥箱中于105～120℃下进行热交联24～48h，有利于提高骨膜力学性能和产品外观美观性。
根据本发明另一典型的实施方式，还提供了一种双层人工骨膜，双层人工骨膜包括：
致密层，由丝素蛋白制成；
疏松层，其位于所述致密层上，所述疏松层由硒掺杂羟基磷灰石和I型胶原蛋白复合制成。
作为一种可选的实施方式，所述致密层的厚度为0.1～1.0mm，所述疏松层的厚度为0.1～2.0mm。
若所述致密层的厚度小于0.1mm，一是工艺难以实现和有效控制厚度，二是难以发挥致密层膜的物理屏障功能，无法有效阻止结缔组织长入骨缺损区；若所述致密层的厚度大于1.0mm，力学性能好，但降解速度会变慢；致密层在制备过程中有压膜且控制冻干条件，按照本发明实施例提供的一种双层人工骨膜的制备方法中的操作即可使得所述致密层的厚度为0.1～1.0mm；
若所述疏松层的厚度小于0.1mm，工艺难以实现和有效控制厚度小于0.1mm；若所述疏松层的厚度大于2.0mm影响临床使用，临床使用操作不方便。
作为一种可选的实施方式，所述疏松层呈海绵状，所述疏松层的孔径为30～250um，孔隙率为30％～80％。孔径和孔隙率低，无法形成一个良好的成骨空间，影响具有成长潜力的的前体成骨细胞进入到骨缺损区，影响缺损区的骨修复效果。孔径和孔隙率过高，成骨空间好，但降解速度过快。疏松层在制备的过程中没有压膜，疏松层是溶液注入含致密层磨具中冻干的，按照本发明实施例提供的一种双层人工骨膜的制备方法中的操作即可使得所述疏松层的孔径为30～250um，孔隙率为30％～80％。
根据本发明另一典型的实施方式，还提供了一种双层人工骨膜的应用，所述应用包括将双层人工骨膜用于包覆骨损伤部位；所述双层人工骨膜包括：致密层和疏松层，所述致密层的制备材料为丝素蛋白；所述疏松层贴合于所述致密层一表面，所述疏松层的制备材料为硒掺杂羟基磷灰石和I型胶原蛋白的复合材料；所述应用中，所述致密层朝向软组织，所述疏松层朝向所述骨损伤部位。
采用以上设计，双层人工骨膜将致密层和疏松层双层协同组合，致密层的表面光滑，使用时朝向软组织，能够很好地利用膜的物理屏障功能，有效阻止结缔组织长入骨缺损区，使特定组织的再生功能得到最大程度的发挥；粗糙的疏松层与自体骨成分和结构相一致，使用时朝向骨组织，能够与骨缺损面良好贴合，诱导新骨生成，并有效抑制骨肉瘤和治疗骨癌。本发明所得双层人工骨膜具有良好的力学性能和降解性能，同时还有良好的促进骨愈合，抑制骨肉瘤和治疗骨癌能力。
采用本方法提供的骨膜具备抑制骨肉瘤和治疗骨癌能力的机理在于：硒掺杂羟基磷灰石可以在肿瘤和癌细胞酸性微环境下有效降解和释放出硒元素，从而减少肿瘤和癌组织血管生成，诱导肿瘤和癌细胞细胞凋亡，抑制肿瘤和癌细胞生长。
下面将结合实施例、对照例及实验数据对本申请的双层人工骨膜及其制备方法和应用进行详细说明。
实施例1
一种双层人工骨膜的制备方法，方法包括：
S1、致密层的制备，具体包括：
S1-1、将丝素蛋白溶解于溴化锂溶液或氯化钙三元体系(氯化钙/水/乙醇摩尔比1:8:2)溶液中，获得质量分数为5％的丝素蛋白溶液。
S1-2、取步骤S1-1所得丝素蛋白溶液注入模具中，在-60℃条件下进行预冷冻12h，之后在温度10℃，压强10Pa下进行冷冻体干燥48h，后在20MPa压力下模压60s获得致密层膜；
将所述致密层膜在真空干燥箱中于110℃下进行热交联24h得到致密层；
S2、硒掺杂羟基磷灰石胶原溶液的制备，具体包括：
S2-1、将I型胶原蛋白溶解于质量分数为5％的醋酸溶液中，其中I型胶原蛋白浓度为0.01g/ml；
S2-2、在步骤S2-1所得I型胶原蛋白溶液中滴加四水硝酸钙溶液，其中钙离子的加入量与I型胶原蛋白的质量比为0.01mol/g；
S2-3、在步骤S2-2所得溶液中滴加磷酸氢二铵溶液；
S2-4、在步骤S2-3所得溶液中滴加亚硒酸钠溶液；
所述亚硒酸根离子与所述磷酸根离子的摩尔比为0.3％；所述钙盐溶液中钙离子与所述磷酸盐溶液中磷酸根离子的摩尔比为1.667。
S2-5、在步骤S2-4所得溶液中滴加氨水溶液至混合体系pH至7；
S2-6、将步骤S2-5所得溶液静置，分离出沉淀并洗去杂质离子，冷冻干燥得到硒掺杂羟基磷灰石胶原颗粒；
S2-7、将I型胶原蛋白溶解于质量分数为5％的醋酸溶液中，其中I型胶原蛋白质量浓度为1％；
S2-8、在步骤S2-7所得I型胶原蛋白溶液中加入步骤S2-6所得的硒掺杂羟基磷灰石胶原颗粒，其中加入的硒掺杂羟基磷灰石胶原颗粒与I型胶原蛋白的质量比为3:1，搅拌均匀得到硒掺杂羟基磷灰石胶原溶液；
S3、将步骤S2所述矿化胶原溶液溶液注入步骤S1所述丝素蛋白致密层模具中，在-60℃条件下进行预冷冻12h，之后在温度10℃，压强10Pa下进行冷冻体干燥48h；在真空干燥箱中于110℃下进行热交联24h，依据需求进行切割、修剪，得到双层人工骨膜。
实施例2
一种双层人工骨膜的制备方法，方法包括：
S1、致密层的制备，具体包括：
S1-1、将丝素蛋白溶解于溴化锂溶液或氯化钙三元体系(氯化钙/水/乙醇摩尔比1:8:2)溶液中，获得质量分数为5％的丝素蛋白溶液。
S1-2、取步骤S1-1所得丝素蛋白溶液注入模具中，在-60℃条件下进行预冷冻12h，之后在温度10℃，压强10Pa下进行冷冻体干燥48h，后在20MPa压力下模压30s获得致密层膜；
将所述致密层膜在真空干燥箱中于110℃下进行热交联24h得到致密层；
S2、硒掺杂羟基磷灰石胶原溶液的制备，具体包括：
S2-1、将I型胶原蛋白溶解于质量分数为5％的醋酸溶液中，其中I型胶原蛋白浓度为0.015g/ml；
S2-2、在步骤S2-1所得I型胶原蛋白溶液中滴加四水硝酸钙溶液，其中钙离子的加入量与I型胶原蛋白的质量比为0.01mol/g；
S2-3、在步骤S2-2所得溶液中滴加磷酸氢二铵溶液；
S2-4、在步骤S2-3所得溶液中滴加亚硒酸钠溶液；
所述亚硒酸根离子与所述磷酸根离子的摩尔比为0.3％；所述钙盐溶液中钙离子与所述磷酸盐溶液中磷酸根离子的摩尔比为1.667。
S2-5、在步骤S2-4所得溶液中滴加氨水溶液至混合体系pH至7；
S2-6、将步骤S2-5所得溶液静置，分离出沉淀并洗去杂质离子，冷冻干燥得到硒掺杂羟基磷灰石胶原颗粒；
S2-7、将I型胶原蛋白溶解于质量分数为5％的醋酸溶液中，其中I型胶原蛋白质量浓度为1％；
S2-8、在步骤S2-7所得I型胶原蛋白溶液中加入步骤S2-6所得的硒掺杂羟基磷灰石胶原颗粒，其中加入的硒掺杂羟基磷灰石胶原颗粒与I型胶原蛋白的质量比为3:1，搅拌均匀得到硒掺杂羟基磷灰石胶原溶液；
S3、将步骤S2所述矿化胶原溶液溶液注入步骤S1所述丝素蛋白致密层模具中，在-60℃条件下进行预冷冻12h，之后在温度10℃，压强10Pa下进行冷冻体干燥48h；在真空干燥箱中于110℃下进行热交联24h，依据需求进行切割、修剪，得到双层人工骨膜。
实施例3
一种双层人工骨膜的制备方法，方法包括：
S1、致密层的制备，具体包括：
S1-1、将丝素蛋白溶解于溴化锂溶液或氯化钙三元体系(氯化钙/水/乙醇摩尔比1:8:2)溶液中，获得质量分数为7.5％的丝素蛋白溶液。
S1-2、取步骤S1-1所得丝素蛋白溶液注入模具中，在-60℃条件下进行预冷冻24h，之后在温度20℃，压强15Pa下进行冷冻体干燥48h，后在20MPa压力下模压30s获得致密层膜；
将所述致密层膜在真空干燥箱中于110℃下进行热交联24h得到致密层；
S2、硒掺杂羟基磷灰石胶原溶液的制备，具体包括：
S2-1、将I型胶原蛋白溶解于质量分数为5％的醋酸溶液中，其中I型胶原蛋白浓度为0.015g/ml；
S2-2、在步骤S2-1所得I型胶原蛋白溶液中滴加钙盐溶液，其中钙离子的加入量与I型胶原蛋白的质量比为0.015mol/g；
S2-3、在步骤S2-2所得溶液中滴加磷酸氢二铵溶液；
S2-4、在步骤S2-3所得溶液中滴加亚硒酸钠溶液；
所述亚硒酸根离子与所述磷酸根离子的摩尔比为5％；所述钙盐溶液中钙离子与所述磷酸盐溶液中磷酸根离子的摩尔比为1.676。
S2-5、在步骤S2-4所得溶液中滴加氨水溶液至混合体系pH至7；
S2-6、将步骤S2-5所得溶液静置，分离出沉淀并洗去杂质离子，冷冻干燥得到硒掺杂羟基磷灰石胶原颗粒；
S2-7、将I型胶原蛋白溶解于质量分数为5％的醋酸溶液中，其中I型胶原蛋白质量浓度为1.5％；
S2-8、在步骤S2-7所得I型胶原蛋白溶液中加入步骤S2-6所得的硒掺杂羟基磷灰石胶原颗粒，其中加入的硒掺杂羟基磷灰石胶原颗粒与I型胶原蛋白的质量比为3:2，搅拌均匀得到硒掺杂羟基磷灰石胶原溶液；
S3、将步骤S2所述矿化胶原溶液溶液注入步骤S1所述丝素蛋白致密层模具中，在-60℃条件下进行预冷冻12h，之后在温度20℃，压强10Pa下进行冷冻体干燥48h；在真空干燥箱中于110℃下进行热交联24h，依据需求进行切割、修剪，得到矿化人工骨膜。
实施例4
一种双层人工骨膜的制备方法，方法包括：
S1、致密层的制备，具体包括：
S1-1、将丝素蛋白溶解于溴化锂溶液或氯化钙三元体系(氯化钙/水/乙醇摩尔比1:8:2)溶液中，获得质量分数为10％的丝素蛋白溶液。
S1-2、取步骤S1-1所得丝素蛋白溶液注入模具中，在-50℃条件下进行预冷冻24h，之后在温度5℃，压强10Pa下进行冷冻体干燥48h，后在20MPa压力下模压60s获得致密层膜；
将所述致密层膜在真空干燥箱中于110℃下进行热交联24h得到致密层；
S2、硒掺杂羟基磷灰石胶原溶液的制备，具体包括：
S2-1、将I型胶原蛋白溶解于质量分数为5％的醋酸溶液中，其中I型胶原蛋白浓度为0.025g/ml；
S2-2、在步骤S2-1所得I型胶原蛋白溶液中滴加钙盐溶液，其中钙离子的加入量与I型胶原蛋白的质量比为0.015mol/g；
S2-3、在步骤S2-2所得溶液中滴加磷酸氢二铵溶液；
S2-4、在步骤S2-3所得溶液中滴加亚硒酸钠溶液；
所述亚硒酸根离子与所述磷酸根离子的摩尔比为5％；所述钙盐溶液中钙离子与所述磷酸盐溶液中磷酸根离子的摩尔比为1.676。
S2-5、在步骤S2-4所得溶液中滴加氨水溶液至混合体系pH至7；
S2-6、将步骤S2-5所得溶液静置，分离出沉淀并洗去杂质离子，冷冻干燥得到硒掺杂羟基磷灰石胶原颗粒；
S2-7、将I型胶原蛋白溶解于质量分数为5％的醋酸溶液中，其中I型胶原蛋白质量浓度为2.5％；
S2-8、在步骤S2-7所得I型胶原蛋白溶液中加入步骤S2-6所得的硒掺杂羟基磷灰石胶原颗粒，其中加入的硒掺杂羟基磷灰石胶原颗粒与I型胶原蛋白的质量比为1:1，搅拌均匀得到硒掺杂羟基磷灰石胶原溶液；
S3、将步骤S2所述矿化胶原溶液溶液注入步骤S1所述丝素蛋白致密层模具中，在-60℃条件下进行预冷冻6h，之后在温度5℃，压强15Pa下进行冷冻体干燥48h；在真空干燥箱中于110℃下进行热交联24h，依据需求进行切割、修剪，得到矿化人工骨膜。
实施例5
一种双层人工骨膜的制备方法，方法包括：
S1、致密层的制备，具体包括：
S1-1、将丝素蛋白溶解于溴化锂溶液或氯化钙三元体系(氯化钙/水/乙醇摩尔比1:8:2)溶液中，获得质量分数为15％的丝素蛋白溶液。
S1-2、取步骤S1-1所得丝素蛋白溶液注入模具中，在-50℃条件下进行预冷冻24h，之后在温度5℃，压强5Pa下进行冷冻体干燥48h，后在20MPa压力下模压30s获得致密层膜；
将所述致密层膜在真空干燥箱中于110℃下进行热交联24h得到致密层；
S2、硒掺杂羟基磷灰石胶原溶液的制备，具体包括：
S2-1、将I型胶原蛋白溶解于质量分数为5％的醋酸溶液中，其中I型胶原蛋白浓度为0.025g/ml；
S2-2、在步骤S2-1所得I型胶原蛋白溶液中滴加钙盐溶液，其中钙离子的加入量与I型胶原蛋白的质量比为0.02mol/g；
S2-3、在步骤S2-2所得溶液中滴加磷酸氢二铵溶液；
S2-4、在步骤S2-3所得溶液中滴加亚硒酸钠溶液；
所述亚硒酸根离子与所述磷酸根离子的摩尔比为10％；所述钙盐溶液中钙离子与所述磷酸盐溶液中磷酸根离子的摩尔比为1.685。
S2-5、在步骤S2-4所得溶液中滴加氨水溶液至混合体系pH至7；
S2-6、将步骤S2-5所得溶液静置，分离出沉淀并洗去杂质离子，冷冻干燥得到硒掺杂羟基磷灰石胶原颗粒；
S2-7、将I型胶原蛋白溶解于质量分数为5％的醋酸溶液中，其中I型胶原蛋白质量浓度为2.5％；
S2-8、在步骤S2-7所得I型胶原蛋白溶液中加入步骤S2-6所得的硒掺杂羟基磷灰石胶原颗粒，其中加入的硒掺杂羟基磷灰石胶原颗粒与I型胶原蛋白的质量比为2:3，搅拌均匀得到硒掺杂羟基磷灰石胶原溶液；
S3、将步骤S2所述矿化胶原溶液注入步骤S1所述丝素蛋白致密层模具中，在-60℃条件下进行预冷冻12h，之后在温度15℃，压强10Pa下进行冷冻体干燥48h；在真空干燥箱中于110℃下进行热交联24h，依据需求进行切割、修剪，得到矿化人工骨膜。
对比例1
该对比例中混合体系pH为6，其余步骤均同实施例1。
对比例2
该对比例中混合体系pH为8，其余步骤均同实施例1。
对比例3
该对比例中为体系中不滴加亚硒酸钠溶液，其余步骤均同实施例1。
对比例4
一种骨膜的制备方法，方法包括：
S1、获得丝素蛋白溶液；将丝素蛋白溶解于9.3mol/L溴化锂溶液或氯化钙三元体系溶液(氯化钙：水：乙醇摩尔比＝1:8:2)中，获得质量分数为5％(W/V)的丝素蛋白溶液；
S2、将步骤S1所述丝素蛋白溶液注入模具中，在-60℃条件下进行预冷冻12h，之后在温度-50～37℃，压强20Pa下进行冷冻体干燥48h，后在20MPa压力下模压60s获得致密层膜；将所述致密层膜在真空干燥箱中于110℃下进行热交联24h得到致密层；
S3、获得I型胶原蛋白溶液；将I型胶原蛋白溶解于质量分数为5％的醋酸溶液中，获得质量分数为1％(W/V)的I型胶原蛋白溶液；
S4、取步骤S3所述I型胶原蛋白溶液注入步骤S2所述致密层上，在-60℃条件下进行预冷冻12h，之后在温度-50～37℃，压强10Pa下进行冷冻体干燥48h；在真空干燥箱中于110℃下进行热交联24h，依据需求进行切割、修剪，得到人工骨膜。
对比例5
本对比例提供单层I型胶原膜，孔隙率69％，厚度0.5mm。
对比例6
本对比例提供单层矿化I型胶原膜，孔隙率52％，厚度0.2mm。
实施例1-5和对比例1-6提供的骨膜的参数及测试结果如下表所示：
其中，双层人工骨膜的结构测试方法为：通过扫描电子显微镜对双层骨膜进行切片检测，并通过扫描电子显微镜测量其参数。
降解时间测试方法为：取实施例制得样品，浸泡在10ml的80Unit/ml胶原蛋白水解酶溶液，于37±1℃的恒温恒湿箱下反应降解，直到样品结构完全瓦解为止。
Figure BDA0003334134640000141
Figure BDA0003334134640000151
表中，孔隙率是指块状材料中孔隙体积与材料在自然状态下总体积的百分比，本申请实施例和对比例的孔隙率由电子显微镜测得；
平均孔径是指对应的孔体积和对应的比表面相除的结果，本申请实施例和对比例的平均孔径的检测方法为压汞法。
由上表可得，I型胶原蛋白浓度低，钙离子加量低，形成硒掺杂羟基磷灰石平均粒径较高。I型胶原蛋白浓度低，钙离子加量低，双层人工骨膜强度低，降解时间快。硒掺杂羟基磷灰石双层人工骨膜相较于羟基磷灰石双层人工骨膜降解速度加快，主要原因是亚硒酸根离子部分取代了羟基磷灰石结构内的磷酸根离子。
实施例5中胶原浓度和钙离子加入量过高，溶液粘度较大，双层羟基磷灰石晶体的形成受限。
通过本发明实施例所述的方法制备的双层骨膜，在双层骨膜的总厚度控制在0.2-3.0mm的范围内的条件下，降解时间能够达到至少2个月以上，同时通过增加致密层厚度、密度可以增强其降解时间，通过适度增加疏松层密度、厚度和双层羟基磷灰石量，可以延长双层骨膜的降解时间，从而使其与和新生骨膜的生长速度一致。
与通过对比例所制得的骨膜相比，本发明实施例所述的方法制备的硒掺杂羟基磷灰石双层骨膜具备更好的降解时间，降解性能均好于单层矿化/非矿化I型胶原膜和非矿化I型胶原蛋白丝素蛋白复合膜。
附图2-6的详细说明：
如图2所示，为实施例1制得的双层人工骨膜中截面SEM结果图，由图可得，双层骨膜具有致密层和疏松层，其下层为疏松层，具有更大的孔隙率，手术植入后朝向骨内侧，上层为致密层，密度更大，手术植入后朝向骨外侧。
如图3所示，为实施例1制得的双层人工骨膜中致密层SEM结果图，由图可得，双层骨膜致密层均匀、平整，表面光滑，可以有效阻止结缔组织长入骨缺损区，防止骨填充物的从填充部位脱出。
如图4所示，为实施例1制得的双层人工骨膜中疏松层SEM结果图，由图可得，双层人工骨膜疏松层扫描电镜结果显示疏松层具有多孔结构，有利于新生骨膜组织中成纤维细胞的粘附和增殖。
如图5所示，为实施例1制得的双层人工骨膜红外图谱结果图，由图可得，红外图谱具有PO4 3-吸收峰1033cm-1和561cm-1，OH-红外吸收峰3275cm-1(酰胺A红外吸收峰3300cm-1),酰胺Ⅰ红外吸收峰1635cm-1和酰胺Ⅲ吸收峰1236cm-1，可知实施例1成功制备得到硒掺杂羟基磷灰石人工骨膜。
如图6所示，为实施例1、3、5制得的双层人工骨膜对MNNG/HOS骨肉瘤细胞毒性结果图，由图可得，双层人工骨膜对MNNG/HOS骨肉瘤细胞毒性依赖于硒元素的掺杂量；亚硒酸根离子与磷酸根离子的摩尔比为10％，即硒磷比为0.1时细胞毒性最高。这可能是因为硒掺杂羟基磷灰石双层人工骨膜在12小时后，材料进入MNNG/HOS骨肉瘤细胞溶酶体，酸性条件下材料降解导致硒离子释放，硒元素的掺杂量越高释放的硒离子越多，因而细胞毒性越高。
本发明实施例中的一个或多个技术方案，至少还具有如下技术效果或优点：
(1)原材料容易获取，安全且环境友好，避免在制备过程中以及终产品使用中对人体带来的隐患。
(2)所制备的双层人工骨膜将致密层和疏松层双层协同组合，使用丝素蛋白作为制备致密层的原料，使得致密层具有较好的力学强度，其致密结构可以在骨填充过程中将其他植骨材料限制在骨缺损部位，避免植骨材料脱出，为骨修复创造空间，同时避免骨周边组织进入骨缺损部位。致密层的表面光滑，使用时朝向软组织，能够很好地利用膜的物理屏障功能，有效阻止结缔组织长入骨缺损区，使特定组织的再生功能得到最大程度的发挥；
(3)I型胶原蛋白是脊柱动物的主要结构蛋白，是成骨过程中成骨细胞分泌的细胞外基质，是钙盐沉积的支架和骨基质双层的促进剂、双层的模板；能够促进细胞迁移、吸附、分化，并能够调节细胞生长，作为生物材料已被美国FDA认可，并有一系列胶原骨植入产品。用硒掺杂纳米羟基磷灰石和I型胶原蛋白作为制备疏松层的原料，使得疏松层具有多孔结构、良好的亲水性和粘附性，有利于血管的再生和细胞的黏附。粗糙的疏松层与自体骨成分和结构相一致，利用硒元素较强的抗氧化和抗癌作用，在修复过程中将其它植骨材料限制在骨缺损部位并与骨缺损面良好贴合的同时能够抑制骨肉瘤和治疗骨癌，是一种优选的骨膜替代和修复材料
(4)所制备的双层人工骨膜无任何明显的急性免疫反应，具有良好的生物相容性以及生物降解性。胶原蛋白和丝素蛋白均是天然的纤维型蛋白，具有良好的生物相容性和骨诱导性能。胶原采用I型胶原，可避免复合膜在使用时的免疫排斥反应，病毒感染等问题；利用丝素蛋白对胶原蛋白力学性能不足，降解性能差进行改善，得到的双层人工骨膜具有良好的力学性能和生物降解时间可控，通过调节丝素蛋白致密层和双层胶原蛋白疏松层参数，可以调节骨膜的降解时间，使骨膜的降解速率和新生骨膜的生长速度一致。
(5)所制备的双层人工骨膜具有良好的力学性能，能进行卷曲折叠，可对骨缺损部位更好的包裹覆盖，提升恢复效果。
(6)制备方法中采用热交联工艺，得到的双层人工骨膜具有良好的外观美观性和力学性能。
最后，还需要说明的是，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

Claims (10)

1.一种双层人工骨膜的制备方法，其特征在于，所述方法包括：
将丝素蛋白溶解于第一溶剂中，得到丝素蛋白溶液；
将所述丝素蛋白溶液注入模具，后进行冷冻、干燥、模压和第一热交联，得到致密层；
将第一I型胶原蛋白溶解于第二溶剂中，得到第一I型胶原蛋白溶液；
将钙盐溶液加入所述第一I型胶原蛋白溶液，得到第一混合溶液；
将磷酸盐溶液加入所述第一混合溶液，得到第二混合溶液；
将亚硒酸盐溶液加入所述第二混合溶液，后进行pH调节和冷冻干燥，得到硒掺杂羟基磷灰石胶原颗粒；
将第二I型胶原蛋白溶解于第三溶剂中，得到第二I型胶原蛋白溶液；
将所述第二I型胶原蛋白溶液和所述硒掺杂羟基磷灰石胶原颗粒混合，得到硒掺杂羟基磷灰石胶原溶液；
将所述硒掺杂羟基磷灰石胶原溶液注入至所述致密层上，后进行冷冻、干燥和第二热交联，得到双层人工骨膜；
其中，所述亚硒酸盐溶液为亚硒酸钠溶液。
2.根据权利要求1所述的双层人工骨膜的制备方法，其特征在于，所述将丝素蛋白溶解于第一溶剂中，得到所述丝素蛋白溶液中；所述第一溶剂为溴化锂溶液或氯化钙三元体系溶液；所述丝素蛋白溶液质量分数为5％～20％。
3.根据权利要求1所述的双层人工骨膜的制备方法，其特征在于，所述将第一I型胶原蛋白溶解于第二溶剂中，得到所述第一I型胶原蛋白溶液中；所述第二溶剂为第一醋酸溶液；所述第一醋酸溶液的质量分数为0.3-6％；所述第一I型胶原蛋白溶液的质量分数为0.1％～2.5％；
所述将第二I型胶原蛋白溶解于第三溶剂中，得到所述第二I型胶原蛋白溶液中；所述第三溶剂为第二醋酸溶液；所述第二醋酸溶液的质量分数为0.3-6％；所述第二I型胶原蛋白溶液的质量分数为0.1％～2.5％。
4.根据权利要求1所述的双层人工骨膜的制备方法，其特征在于，所述将钙盐溶液加入所述第一I型胶原蛋白溶液中，钙离子加入的物质的量与所述I型胶原蛋白的质量比为0.002mol/g-0.02mol/g；
所述钙盐溶液包括四水硝酸钙溶液、氯化钙溶液和氢氧化钙溶液中的一种；
所述将磷酸盐溶液加入所述第一混合溶液中，磷酸根离子加入的物质的量与钙离子加入的物质的量的比值为0.667A-6A:10，其中，A为亚硒酸根离子与所述磷酸根离子的摩尔比，A的取值范围为0.03％-10％；所述pH调节的终点pH值为6-8，所述pH调节的调节剂为氨水溶液；
所述磷酸盐溶液包括磷酸氢二铵溶液、磷酸二氢铵溶液、磷酸氢二钠溶液和磷酸氢二钾溶液中的一种。
5.根据权利要求1所述的双层人工骨膜的制备方法，其特征在于，所述将所述第二I型胶原蛋白溶液和所述硒掺杂羟基磷灰石胶原颗粒混合中，所述硒掺杂羟基磷灰石胶原颗粒与I型胶原蛋白的质量比为2-4：1-3。
6.根据权利要求1所述的双层人工骨膜的制备方法，其特征在于，所述第一热交联的温度为105℃-120℃，所述第一热交联的时间为24h-48h；所述第二热交联的温度为105℃-120℃，所述第二热交联的时间为24h-48h。
7.一种双层人工骨膜，其特征在于，所述双层人工骨膜包括：
致密层，所述致密层的制备材料为丝素蛋白；
疏松层，所述疏松层贴合于所述致密层一表面，所述疏松层的制备材料为硒掺杂羟基磷灰石和I型胶原蛋白的复合材料。
8.根据权利要求7所述的双层人工骨膜，其特征在于，所述致密层的厚度为0.1mm-1.0mm；所述疏松层的厚度为0.1mm-2.0mm。
9.根据权利要求7所述的双层人工骨膜，其特征在于，所述疏松层呈海绵状，所述疏松层的孔径为30～250μm，孔隙率为30％～80％；所述硒掺杂羟基磷灰石胶原颗粒的粒径为50nm-300nm。
10.一种双层人工骨膜的应用，其特征在于，所述应用包括将双层人工骨膜用于包覆骨损伤部位；所述双层人工骨膜包括：致密层和疏松层，所述致密层的制备材料为丝素蛋白；所述疏松层贴合于所述致密层一表面，所述疏松层的制备材料为硒掺杂羟基磷灰石和I型胶原蛋白的复合材料；所述应用中，所述致密层朝向软组织，所述疏松层朝向所述骨损伤部位。
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