CN114018886B - 一种间接检测磺胺兽药的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种间接检测磺胺兽药的方法，其特征在于，包括具体步骤如下：步骤一，含磺胺兽药的食品预处理：步骤二，通过步骤一处理所得磺胺兽药样品在氮气中热分解为二氧化硫：步骤三，步骤二中产生二氧化硫经醋酸铅溶液吸收而形成白色亚硫酸铅沉淀，步骤四，在步骤三中所得沉淀中加入浓盐酸得到亚硫酸溶液，步骤五，计算出磺胺兽药残留质量，本发明解决了对磺胺兽药残留采用免疫分析法检测存在特异性、假阳性率高、检测成分需衍生无法直接检测，以及采用仪器检测存在对样品前处理及操作人员要求较高，且存在检测条件难以确定，耗时长，检测成本高，无法快速检测，现场监控不易普及的问题。

Description

一种间接检测磺胺兽药的方法
技术领域
本发明属于药品检测技术领域，尤其是涉及一种间接检测磺胺兽药的方法。
背景技术
随着生活水平的提高，人们对食品的需求发生了从量(温饱)到质(安全和品质)的转变。在众多食品安全问题中，兽药残留是引发食品安全问题最主要的一个因素。
磺胺(Sulfonamides，SAs)类兽药为具有对氨基苯磺酰胺结构的合成抗生素，主要用于预防和治疗动物细菌性疾病的感染。使用过磺胺类药物的动物，其组织、脏器、蛋、奶等均有残留。人们经食物链摄入SAs残留的畜禽和水产品，可间接对人体健康造成极大危害，如使细菌产生耐药性、引发人体过敏反应、损坏造血系统和泌尿系统等。基于此，世界各国对食品中SAs的残留限量提出了严格要求，如欧美、日韩等将SAs列入抗生素禁用清单，我国农业部规定磺胺类药物的残留总量不得大于100μg/kg。目前，因过度或不规范用药等诸多主客观因素，直接造成动物食品中SAs残留严重超标。因此，加强SAs的残留检测和监控并消除其危害尤为必要。
目前，针对磺胺类兽药残留的检测，大体有免疫分析方法及仪器分析方法两大类。其中免疫分析方法具有灵敏、简便等优点，但该类方法大多存在特异性、假阳性率高、检测成分需衍生无法直接检测等问题，通常需液质联用等仪器测试方法加以确证；仪器分析方法具有高灵敏度、高准确性等优点，但对样品前处理及操作人员要求较高，且存在检测条件难以确定，耗时长，检测成本高，无法快速检测，现场监控不易普及等不足。
因此，本发明旨在建立一种集上述两类方法优势的检测技术用于磺胺类兽药残留检测，利用荧光探针分子高灵敏度、可视化、快捷、高选择性等优异特点，选择课题组自制的靶向HSO3 -荧光探针定量快速、灵敏准确地检测磺胺兽药热解产生的二氧化硫，从而间接定量测定食品中残留的磺胺兽药。
发明内容
有鉴于此，本发明旨在提出一种间接检测磺胺兽药的方法，解决了对磺胺兽药残留采用免疫分析法检测存在特异性、假阳性率高、检测成分需衍生无法直接检测，以及采用仪器检测存在对样品前处理及操作人员要求较高，且存在检测条件难以确定，耗时长，检测成本高，无法快速检测，现场监控不易普及的问题。
为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：
一种间接检测磺胺兽药的方法，包括具体步骤如下：
步骤一，对含有磺胺兽药的食品进行预处理；
S1、对含磺胺兽药食品取样；
S2、提取及待测磺胺样品制备；
S3、外加入标准磺胺兽药的磺胺样品制备；
步骤二，将步骤一中的经S2所处理得到的磺胺兽药样品放入GTF-1200-A1管式炉中，在惰性气体氮气氛围中以300~450°C的温度范围内加热30~60分钟，热分解产生的二氧化硫气体以惰性气体气流经导管导出；
步骤三，在100mL锥形瓶中加入10~50mL20g/L的醋酸铅溶液，用于吸收步骤二中产生的二氧化硫，并生成亚硫酸铅沉淀，反应原理：Pb(Ac)2+H2O+ SO2 ® PbSO3¯+ 2HAc；
步骤四，向步骤三中所得溶液中加入一定体积37%的浓HCl，摇匀，使亚硫酸铅沉淀溶解，得到亚硫酸盐溶液；
步骤五，以自制荧光探针定量检测步骤四所得溶液中HSO3的浓度，利用磺胺与二氧化硫两者之间依存的化学计量关系，即：，HSO3 -摩尔数等于二氧化硫的摩尔数等于磺胺的摩尔数，从而通过定量检出的HSO3 -物质的量换算出磺胺兽药的质量，并计算相应的加样回收率；
S1、建立自制荧光探针与HSO3 -反应后释放的荧光强度与亚硫酸氢钠标准溶液中HSO3浓度两者之间的线性方程；
S2、将一定体积的步骤四所得的亚硫酸盐溶液加入到荧光探针溶液中，测试溶液的荧光强度并代入步骤五中S1的线性方程，计算出亚硫酸盐溶液的浓度和二氧化硫的摩尔数；
S3、再通过磺胺兽药与二氧化硫的等摩尔比关系，计算出肉类样品中磺胺兽药的残留质量，单位为mg/kg。
所述步骤一中S1的取样方式：取约500g有代表性可食部位的动物肉类样品，高速组织捣碎机均匀捣碎混匀，均分成两份，分别装入洁净容器作为试样并予以标记，低温下密封避光保存。
所述步骤一中S2的提取及待测磺胺样品制备步骤：取其中一份肉类样品2~10g于50mL离心管，加入无水硫酸钠和一定体积的乙腈，搅拌提取，然后提取液冷冻离心，上清液转移至圆底烧瓶，残余物用乙腈重复处理，合并提取上清液，减压脱除乙腈，剩余残渣用少量甲醇溶解，加入正己烷，振荡后离心脱脂，分液取下层液体作为磺胺类兽药残留待处理溶液，分别取均分的肉类样品做成两个平行样。
所述步骤一中S3的加标准磺胺兽药的磺胺样品制备步骤：在待测动物肉类样品中加入0.1~1.0mg的磺胺兽药的乙腈溶液，按步骤一中的S2操作制备平行样品六份，作为加标回收率实验用。
将步骤一中S3处理所得外加入标准磺胺兽药的肉类样品按步骤二~步骤五的流程进行加标回收率实验，计算加样回收率以评估测试方法的可行性。
相对于现有技术，本发明所述的间接检测磺胺兽药的方法具有以下优势：
（1）、通过荧光探针分子高灵敏度、可视化、快捷、高选择性等优异特点，选择靶向HSO3 -荧光探针定量快速、灵敏准确地检测磺胺兽药热解产生的二氧化硫，从而间接定量测定食品中残留的磺胺兽药，解决了对磺胺兽药残留采用免疫分析法检测存在特异性、假阳性率高、检测成分需衍生无法直接检测，以及采用仪器检测存在对样品前处理及操作人员要求较高，且存在检测条件难以确定，耗时长，检测成本高，无法快速检测，现场监控不易普及的问题。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
图1为本发明实施例中磺胺对甲氧基嘧啶的热分解变化曲线图；
图2为本发明实施例中HSO3 -离子浓度在0~30nM范围内与荧光探针强度的线性关系图。
实施方式
除有定义外，以下实施例中所用的技术术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。以下实施例中所用的试验试剂，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下面结合实施例来详细说明本发明。
实施例
一种间接检测磺胺兽药的方法，具体步骤如下：包括具体步骤如下：
步骤一，对含有磺胺兽药的食品进行预处理；
（1）、对含磺胺兽药食品取样；
（2）、提取及待测磺胺样品制备；
（3）、外加入标准磺胺兽药的磺胺样品制备；
步骤二，将步骤一中的经S2所处理得到的磺胺兽药样品放入GTF-1200-A1管式炉中，在惰性气体氮气氛围中以300~450°C的温度范围内加热30~60分钟，热分解产生的二氧化硫气体以惰性气体气流经导管导出；
步骤三，在100mL锥形瓶中加入10~50mL20g/L的醋酸铅溶液，用于吸收步骤二中产生的二氧化硫，并生成亚硫酸铅沉淀，反应原理：Pb(Ac)2+H2O+ SO2 ® PbSO3¯+ 2HAc；
步骤四，向步骤三中所得溶液中加入一定体积37%的浓HCl，摇匀，使亚硫酸铅沉淀溶解，得到亚硫酸盐溶液；
步骤五，以自制荧光探针定量检测步骤四所得溶液中HSO3的浓度，利用磺胺与二氧化硫两者之间依存的化学计量关系，即：，HSO3 -摩尔数等于二氧化硫的摩尔数等于磺胺的摩尔数，从而通过定量检出的HSO3 -物质的量换算出磺胺兽药的质量，并计算相应的加样回收率；
S1、建立自制的荧光探针结构与HSO3 -反应后释放的荧光强度与亚硫酸氢钠标准溶液中HSO3浓度两者之间的线性方程；
S2、将一定体积的步骤四所得的亚硫酸盐溶液加入到自制荧光探针溶液中，测试溶液的荧光强度并代入步骤五中S1的线性方程，计算出亚硫酸盐溶液的浓度和二氧化硫的摩尔数；
S3、再通过磺胺兽药与二氧化硫的等摩尔比关系，计算出肉类样品中磺胺兽药的残留质量，单位为mg/kg。
以下为本申请通过实施例步骤对鸡肉中磺胺对甲氧嘧啶含量的检测的实验数据：
1、鸡肉的前处理；
（1.1）对含磺胺兽药食品取样：取约500g鸡的腿部肌肉，高速组织捣碎机均匀捣碎混匀，均分成两份，每份250g，分别装入洁净容器，标记为鸡肉样品一和鸡肉样品二，低温下密封避光保存。
（1.2）提取及待测磺胺样品制备：
取捣碎鸡肉样品一 10g于50mL离心管，加入无水硫酸钠5g和25mL乙腈，搅拌提取；提取液冷冻离心，上清液转移至圆底烧瓶，残余物用分别用50mL乙腈重复处理两次，合并提取上清液，减压脱除乙腈；残渣用2mL甲醇溶解，加入正己烷10mL，振荡后离心脱脂，分液取下层液体为鸡肉所含磺胺对甲氧嘧啶待处理液。同时，以鸡肉样品二按相同处理为另一平行样。
（1.3）外加入标准磺胺兽药的磺胺样品制备：
在待测动物肉类样品一中加入0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1mg的磺胺对甲氧嘧啶，按（1.2）所述操作制备测试样六份，为加标回收率实验用。
2、通过步骤一中经（1.2）处理所得磺胺对甲氧嘧啶样品在氮气中热分解为二氧化硫；
（2.1） 磺胺对甲氧嘧啶的热分解（如图1）；
图1中磺胺对甲氧基嘧啶的热分解结果表明，其TG在240~310°C的范围内和310~450°C范围内发生了磺胺化合物S-N键和S-C的断裂，并释放出二氧化硫。实验结果与文献报道一致（ref：N-(邻甲基苯基)二茂铁磺酰胺的制备、晶体结构及热分解研究，化学学报，2002，60（8）：1479-1484）。
（2.2）将步骤一中经（1.2）处理所得磺胺对甲氧嘧啶样品放入GTF-1200-A1管式炉中，在惰性气体如氮气氛围中以300~450°C的温度范围内加热40分钟，热分解产生的二氧化硫气体以惰性气体气流经导管导出。
3. 步骤二中产生二氧化硫经醋酸铅溶液吸收而形成白色亚硫酸铅沉淀；
在100mL锥形瓶中加入25mL 20 g/L的醋酸铅溶液，用于吸收步骤二中产生的二氧化硫，并生成亚硫酸铅沉淀。
4. 在步骤三中所得沉淀中加入浓盐酸得到亚硫酸溶液；
向步骤三中所得溶液中加入10mL 37%的浓HCl，摇匀，使亚硫酸铅沉淀溶解，得到亚硫酸盐待测溶液。
5. 以检测限为12nm的自制荧光探针（表1）定量检测步骤四所得溶液中HSO3 -的浓度，利用磺胺与二氧化硫两者的等摩尔比计量关系，通过定量检出的HSO3 -物质的量换算出磺胺对甲氧嘧啶的质量（取两个平行样结果的平均值）。同时测试经（1.3）中处理并外加标样的样品中磺胺对甲氧嘧啶的质量，并计算相应的加样回收率；
表1 自制荧光探针的结构
（5.1） 建立自制荧光探针与HSO3 -反应后释放的荧光强度与亚硫酸氢钠标准溶液中HSO3 -浓度两者之间的线性方程（如图2所示）
以荧光强度为纵坐标，HSO3 -为离子浓度为横坐标，荧光强度与2.0~30nM的HSO3 -离子浓度呈较好线性关系，根据检测限计算公式得到荧光探针对HSO3 -离子检出限为12.3nM。
（5.2） 将一定体积的步骤四所得亚硫酸盐溶液加入到探针溶液中，测试溶液的荧光强度并代入（5.1）的线性方程，计算出亚硫酸盐溶液的浓度和二氧化硫的摩尔数。
取0.1mL1mM 的荧光探针溶液于10mL容量瓶中，吸取5.0mL步骤四中的
亚硫酸溶液至容量瓶中，摇匀，用PBS/DMSO=9/1（pH = 7.4）缓冲溶液定容至刻度线，测试其荧光强度，代入线性方程，计算溶液中HSO3浓度 1 CHSO3 -（nM），对应的HSO3 -摩尔数为 1 CHSO3 - ´10-2´7（摩尔）。
（5.3） 通过磺胺对甲氧嘧啶与二氧化硫的等摩尔比关系，计算出1kg鸡肉样品中磺胺对甲氧嘧啶的残留质量（m1）=  1 CHSO3 -´10-2´7´280.33´106´100（mg/kg）。
表2鸡肉样品中残留的磺胺对甲氧嘧啶质量检测结果
6. 将鸡肉样品一按步骤（1.3）处理所得外加磺胺对甲氧嘧啶的样品按步骤二~步骤五流程进行加标回收率实验，计算加样回收率以评估测试方法的可行性。
取0.1mL 1.0mM 的探针溶液于10mL容量瓶中，吸取2mL步骤四中的亚硫酸溶液至容量瓶中，摇匀，用PBS/DMSO=9/1（pH = 7.4）缓冲溶液定容至刻度线，测试其荧光强度，代入线性方程，计算溶液中HSO3浓度CHSO3 -，得到外加标准磺胺兽药1kg鸡肉样品中磺胺对甲氧嘧啶的质量（m2）=  2 CHSO3 - ´10-2´35¸2´280.33´106´100（mg/kg），加样回收率=m2 /外加标准样质量´100%。同时计算测试样本的RSD值。
表3 外加标样的鸡肉样品一中磺胺对甲氧嘧啶检测结果
通过分析，本申请具有的有益效果为：
（1）具有处理简单、快速灵敏、可视化、结果准确、检测限低等优点。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种间接检测磺胺兽药的方法，其特征在于，包括具体步骤如下：
步骤一，对含有磺胺兽药的食品进行预处理；
S1、对含磺胺兽药食品取样；
S2、提取及待测磺胺样品制备；
S3、外加入标准磺胺兽药的磺胺样品制备；
步骤二，将步骤一中的经S2所处理得到的磺胺兽药样品放入GTF-1200-A1管式炉中，在惰性气体氮气氛围中以300~450°C的温度范围内加热30~60分钟，热分解产生的二氧化硫气体以惰性气体气流经导管导出；
步骤三，在100mL锥形瓶中加入10~50mL20g/L的醋酸铅溶液，用于吸收步骤二中产生的二氧化硫，并生成亚硫酸铅沉淀，反应原理：Pb(Ac)2+H2O+ SO2 ® PbSO3¯+ 2HAc；
步骤四，向步骤三中所得溶液中加入一定体积37%的浓HCl，摇匀，使亚硫酸铅沉淀溶解，得到亚硫酸盐溶液；
步骤五，以自制荧光探针定量检测步骤四所得溶液中HSO3-的浓度，利用磺胺与二氧化硫两者之间依存的化学计量关系，即：，HSO3 -摩尔数等于二氧化硫的摩尔数等于磺胺的摩尔数，从而通过定量检出的HSO3 -物质的量换算出磺胺兽药的质量，并计算相应的加样回收率；
S1、建立自制荧光探针与HSO3 -反应后释放的荧光强度与亚硫酸氢钠标准溶液中HSO3 -浓度两者之间的线性方程；
S2、将一定体积的步骤四所得的亚硫酸盐溶液加入到自制的荧光探针结构荧光探针溶液中，测试溶液的荧光强度并代入步骤五中S1的线性方程，计算出亚硫酸盐溶液的浓度和二氧化硫的摩尔数；
S3、再通过磺胺兽药与二氧化硫的等摩尔比关系，计算出肉类样品中磺胺兽药的残留质量，单位为mg/kg，且自制荧光探针的结构为；
。
2.根据权利要求1所述的间接检测磺胺兽药的方法，其特征在于：所述步骤一中S1的取样方式：取约500g有代表性可食部位的动物肉类样品，高速组织捣碎机均匀捣碎混匀，均分成两份，分别装入洁净容器作为试样并予以标记，低温下密封避光保存。
3.根据权利要求1所述的间接检测磺胺兽药的方法，其特征在于：所述步骤一中S2的提取及待测磺胺样品制备步骤：取其中一份肉类样品2~10g于50mL离心管，加入无水硫酸钠和一定体积的乙腈，搅拌提取，然后提取液冷冻离心，上清液转移至圆底烧瓶，残余物用乙腈重复处理，合并提取上清液，减压脱除乙腈，剩余残渣用少量甲醇溶解，加入正己烷，振荡后离心脱脂，分液取下层液体作为磺胺类兽药残留待处理溶液，分别取均分的肉类样品做成两个平行样。
4.根据权利要求1所述的间接检测磺胺兽药的方法，其特征在于：所述步骤一中S3的加标准磺胺兽药的磺胺样品制备步骤：在待测动物肉类样品中加入0.1~1.0mg的磺胺兽药的乙腈溶液，按步骤一中的S2操作制备平行样六份，作为加标回收率实验用。
5.根据权利要求1所述的间接检测磺胺兽药的方法，其特征在于：将步骤一中S3处理所得外加入标准磺胺兽药的肉类样品按步骤二~步骤五的流程进行加标回收率实验，计算加样回收率以评估测试方法的可行性。
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