CN114018883A - 一种流式细胞多谱分析仪及其使用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种流式细胞多谱分析仪及其使用方法,其包括进样模块、光谱检测模块、电离室、质谱检测模块以及数据处理模块;所述进样模块将输出的连续液流传输至所述光谱检测模块内进行处理后,连续液流传输至所述电离室内,经所述光谱检测模块处理后得到的电信号传输至所述数据处理模块;所述电离室处理后得到的离子进入所述质谱检测模块进行处理,处理后的结果传输至所述数据处理模块;所述数据处理模块将接收到的全部数据进行整合。本发明联合光谱分析和质谱分析实现细胞蛋白质、代谢物等多维度信息的多谱学高通量检测。本发明可以广泛在细胞分析技术领域中应用。
Description
技术领域
本发明涉及一种细胞分析技术领域,特别是关于一种流式细胞多谱分析仪及其使用方法。
背景技术
对细胞进行逐一分析有助于挖掘被群体细胞平均化掩盖的差异。随着分析技术的不断发展,涌现了很多单细胞水平的分析技术,能够对单个细胞内重要的生物分子进行高通量分析。单细胞分析技术最初集中于发展能够准确测定细胞的单一种类的分子信息,如利用单细胞DNA测序等技术研究细胞基因组,用单细胞RNA测序等技术研究细胞转录组,用流式细胞仪等技术研究细胞的蛋白质表达,用质谱分析等技术研究细胞代谢组。
近年来,高通量、多组学分析成为目前单细胞分析领域中研究的热点,多组学分析有利于更加全面的了解一个细胞的分子信息、为揭示细胞间的差异性以及理解细胞内不同层次的生物分子间的相互关系等提供了可能。目前在蛋白和代谢组学联用方面的研究还在起步阶段,相关的分析方法还比较少。然而二者联用具有重要的意义,高通量的单细胞蛋白及代谢多组学分析能够建立免疫分型和代谢分型间的联系,分析特定免疫表型中的代谢异质性以及研究蛋白调控和代谢水平变化的相关性,对于理解生物样品中的表型差异、临床个性化治疗以及药物筛选等方面具有广泛的应用潜力。
发明内容
针对上述问题,本发明的目的是提供一种流式细胞多谱分析仪及其使用方法,其联合光谱分析和质谱分析实现细胞蛋白质、代谢物等多维度信息的多谱学高通量检测。
为实现上述目的,本发明采取以下技术方案:一种流式细胞多谱分析仪,其包括进样模块、光谱检测模块、电离室、质谱检测模块以及数据处理模块;所述进样模块将输出的连续液流传输至所述光谱检测模块内进行处理后,连续液流传输至所述电离室内,经所述光谱检测模块处理后得到的电信号传输至所述数据处理模块;所述电离室处理后得到的离子进入所述质谱检测模块进行处理,处理后的结果传输至所述数据处理模块;所述数据处理模块将接收到的全部数据进行整合。
进一步,所述进样模块包括进样泵、进样池和聚焦流路;所述进样泵的输出端经所述进样池与所述聚焦流路的一端连接,所述聚焦流路的另一端与所述光谱检测模块的输入端连接。
进一步,所述进样泵采用恒压泵或恒流泵;所述进样池采用玻璃、塑料或金属材料制成;所述聚焦流路采用光学玻璃或石英管制成。
进一步,所述光谱检测模块包括第一流路、光源、透镜、色散棱镜、光电倍增管和电信号放大器;所述第一流路的一端与所述进样模块连接,由所述进样模块流出的连续液流进入所述第一流路内;所述光源发射的激发光经所述透镜会聚后,垂直照射在所述第一流路中的连续液流上激发产生荧光,产生的荧光经所述色散棱镜产生特定波长的荧光由所述光电倍增管接收并转换成电信号,该电信号传输至所述电信号放大器放大后,传输至所述数据处理模块。
进一步,所述第一流路采用光学玻璃或石英管制成;所述光源采用弧光灯或激光,所述光源的波长范围为300~650nm。
进一步,所述电离室与所述第一流路的另一端连接,由所述第一流路将包含细胞的连续液流直接进入所述电离室内,经所述电离室处理形成离子后传输至所述质谱检测模块。
进一步,所述电离室采用气体辅助电喷雾的方式,实现在线的萃取和离子化,包括鞘流液注射泵、进样毛细管、鞘流液三通、鞘流液毛细管、气瓶、气路通道、气路三通、气路毛细管、高压直流电源和雾化锥口;
所述进样毛细管的一端与所述第一流路的另一端连接,所述进样毛细管的另一端与所述鞘流液三通的第一端连接,所述鞘流液三通的第二端与所述鞘流液注射泵连接,所述鞘流液三通的第三端经所述鞘流液毛细管与所述气路三通的第一端连接,所述气路三通的第二端经所述气路通道与所述气瓶连接,所述气路三通的第三端与所述雾化锥口连接,将离子经所述雾化锥口进入所述质谱检测模块中质谱分析器内;
所述高压直流电源与所述鞘流液三通连接,为所述鞘流液三通内的鞘流液施加电压形成喷雾。
进一步,所述质谱检测模块包括质谱分析器和计算机分析器;所述质谱分析器将接收到的离子分析处理后得到的结果,传输至所述计算机分析器内进行处理。
进一步,所述数据处理模块设置在所述计算机分析器上,用于将所述光谱检测模块和所述质谱检测模块得到的数据整合分析。
一种流式细胞多谱分析仪的使用方法,该方法基于上述流式细胞多谱分析仪实现,其包括:
将待测细胞悬液加入进样池,开启进样泵将细胞悬液稳定地引入聚焦流路中,经过聚焦后细胞在连续液流中呈单行排列,进入光学检测模块;
经过透镜聚焦整形后的光束垂直照射在第一流路中的连续液流上,激发产生的荧光经色散棱镜产生特定波长的荧光由光电倍增管捕获转换成电信号,该电信号经电信号放大器放大后被计算机分析器识别并分析处理,得到细胞生物学参数以及细胞上荧光标记的蛋白质的相对含量信息;
包含细胞的连续液流直接进入电离室,液滴或连续液流进入电离室后,被充分蒸发、离子化形成离子;
来自不同细胞的离子依次进入质谱检测模块,经过质谱分析器得到的结果由计算机分析器进行处理,得到来自细胞的质谱图,得到细胞中的代谢物/金属元素的种类和含量;
在数据处理模块中,将光谱检测模块和质谱检测模块得到的数据整合得到细胞的多维度、多组学数据。
本发明由于采取以上技术方案,其具有以下优点:
1、本发明通过将光谱分析和质谱分析这两种原理不同的分析技术联用,可以获得细胞生理学特性、蛋白表达、代谢水平等多维度、多组学信息,从而更全面地了解细胞。
2、本发明采用流动进样、在线检测的原理,保证了细胞的检测通量,能够在短时间内实现大量细胞的检测。
附图说明
图1为本发明一实施例中的分析仪整体结构示意图;
图2a为本发明一实施例中对Hela细胞的质谱分析时,提取离子(m/z=760)强度随时间变化情况图;
图2b为本发明一实施例中对Hela细胞的质谱分析时,单细胞的分子指纹图谱;
图2c为本发明一实施例中对Hela细胞的质谱分析时,提取离子强度与荧光信号对应情况图;
图3为本发明一实施例中的电离室结构示意图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚,下面将结合本发明实施例的附图,对本发明实施例的技术方案进行清楚、完整地描述。显然,所描述的实施例是本发明的一部分实施例,而不是全部的实施例。基于所描述的本发明的实施例,本领域普通技术人员所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
在本发明的描述中,需要理解的是,术语“上”、“下”“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系,仅是为了便于描述本发明和简化描述,而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作,因此不能理解为对本发明的限制。
实施例1:
在本实施例中,如图1所示,提供一种流式细胞多谱分析仪,其包括进样模块、光谱检测模块1、电离室2、质谱检测模块以及数据处理模块。进样模块将输出的连续液流传输至光谱检测模块1内进行处理后,连续液流传输至电离室2内,经光谱检测模块1处理后得到的电信号传输至数据处理模块;电离室2处理后得到的离子进入质谱检测模块进行处理,处理后的结果传输至数据处理模块;数据处理模块将接收到的全部数据进行整合。
其中,进样模块用于细胞悬液的引入和细胞的线性聚焦;进样模块包括进样泵3、进样池4和聚焦流路5。进样泵3的输出端经进样池4与聚焦流路5的一端连接,聚焦流路5的另一端与光谱检测模块的输入端连接。使用时,进样泵3提供压力使置于进样池4中的细胞悬液被引入聚焦流路5,形成细胞单行排列的连续液流。
光谱检测模块1用于细胞尺寸、形态和内部结构等生物学参数以及细胞上荧光标记的蛋白质等信息的光学检测;其包括第一流路、光源6、透镜7、色散棱镜8、光电倍增管9和电信号放大器10。第一流路的一端与进样模块连接,由进样模块流出的连续液流进入第一流路内;光源6发射的激发光经透镜7会聚后,垂直照射在第一流路中的连续液流上激发产生荧光,产生的荧光经色散棱镜8产生特定波长的荧光由光电倍增管9接收并转换成电信号,该电信号传输至电信号放大器10放大后,传输至数据处理模块。
电离室2用于对经过光学检测后的细胞进行离子化;电离室2与第一流路的另一端连接,由第一流路将包含细胞的连续液流直接进入电离室2内,经电离室2处理形成离子后传输至质谱检测模块。使用时,液滴或连续液流进入电离室2后,被充分蒸发、离子化形成离子,来自不同细胞的离子依次进入质谱检测模块。
质谱检测模块用于对来自细胞的代谢物离子或金属离子等进行检测,其包括质谱分析器11和计算机分析器12;质谱分析器11将接收到的离子分析处理后得到的结果,传输至计算机分析器12内进行处理。
数据处理模块设置在计算机分析器12上,用于将光谱检测模块和质谱检测模块得到的数据整合分析,实现细胞多维度、多组学分析。
在一个优选的实施例中,可以根据实验需求设定多个光源6。光电倍增管9、电信号放大器10的数量和色散棱镜8的数量一致。图1中展示的是单个激光器和两个色散棱镜8的情况。
在一个优选的实施例中,进样泵3为精密压力控制器,可以采用恒压泵或恒流泵等。
进样池4可以采用玻璃、塑料或金属等材料制成,在本实施例中,优选为石英玻璃管。
聚焦流路5和第一流路4都可以采用光学玻璃、石英管以及其他透明材料制成,在本实施例中,优选采用石英毛细管。聚焦流路5采用的聚焦原理不限,例如可采用流体聚焦(鞘液聚焦、无鞘液聚焦)或声波聚焦等。
光源6可以采用弧光灯或激光等,光源6的波长范围为300~650nm。在本实施例中,光源6优选为发射波长为488nm的激光器,两个色散棱镜8分别可反射525nm和670nm波长的荧光、两个光电倍增管9分别收集来自色两个散棱镜7的光信号。
在一个优选的实施例中,聚焦流路5由内管和外管构成,内管嵌设在外管内部。聚焦流路5中采用的聚焦方式为鞘液包裹样品流的流体聚焦方式,如图2a~图2c所示,外管中鞘流液包裹内管中的样品溶液,在液—液聚焦的原理作用下,细胞沿轴线运动。
在一个优选的实施例中,电离室2采用气体辅助电喷雾的方式,实现在线的萃取和离子化。如图3所示,电离室2包括进样毛细管13、鞘流液三通14、鞘流液注射泵15、鞘流液毛细管16、气路三通17、气路通道18、气瓶19、气路毛细管20、雾化锥口21和高压直流电源22。进样毛细管13的一端与第一流路的另一端连接,进样毛细管13的另一端与鞘流液三通14的第一端连接,鞘流液三通14的第二端与鞘流液注射泵15连接,鞘流液三通14的第三端经鞘流液毛细管16与气路三通17的第一端连接,气路三通17的第二端经气路通道18与气瓶19连接,气路三通17的第三端与气路毛细管20连接,气路毛细管20的末端设置有雾化锥口21,将雾化后的离子经雾化锥口21进入质谱检测模块中质谱分析器11内。其中,高压直流电源22与鞘流液三通14连接,用于为鞘流液三通14内的鞘流液施加电压,使输出的鞘流液形成喷雾。
其中,电离室2与气压泵连接,电离室2中的气压范围可调节,优选调节为小于等于1MPa。
上述实施例中,电离室2可采取多种离子化方式,例如电喷雾离子化及其衍生方法(如CyESI,EESI,PESI等),激光解析离子化及其衍生方法,等离子体离子化及其衍生方法(ICP,DBDI,LTP),或电晕放电离子化及其衍生方法(如APCI)。
在一个优选的实施例中,质谱分析器11可以采用四级杆质谱仪、飞行时间质谱仪、离子阱质谱仪或离子迦旋共振分析器等。在本实施例中,质谱分析器11优选为轨道离子阱质谱仪。
实施例2
在本实施例中,基于实施例1中的流式细胞多谱分析仪,提供一种流式细胞多谱分析仪的使用方法,在本实施例中,以人体肿瘤细胞HeLa与MCF7为研究对象,该使用方法包括以下步骤:
步骤1、将待测细胞悬液加入进样池4,开启进样泵3将细胞悬液稳定地引入聚焦流路5中,经过聚焦后细胞在连续液流中呈单行排列,进入光学检测模块4;
在本实施例中,以人体肿瘤细胞HeLa与MCF7为研究对象,采用光谱分析区分肿瘤细胞的种类,再用质谱分析得到不同类型免疫细胞的代谢物水平差异。
对细胞样品进行荧光染色,制备预先分离好的肿瘤细胞悬浮液,加入到进样池4中,在进样泵3的驱动下,悬浮液进入到聚焦流路5的内管中,流速控制在50-500nL/min。外置恒流泵控制鞘流液的速度为0.5-5μL/min。
步骤2、经过透镜7聚焦整形后的光束垂直照射在第一流路中的连续液流上,激发产生的荧光经色散棱镜8产生特定波长的荧光由光电倍增管9捕获转换成电信号,该电信号经电信号放大器10放大后被计算机分析器12识别并进一步分析处理,从而得到细胞尺寸、形态和内部结构的复杂程度等生物学参数以及细胞上荧光标记的蛋白质的相对含量等信息;
例如,包含细胞的样品流进入第一流路,经过两个透镜7会聚的光(激发波长为:488nm)垂直打在第一流路上。波长分别为500-560nm的发射光经过两个色散棱镜8反射后分别由两个光电倍增管9捕获转换成电信号,然后由两个电信号放大器10放大后经过转换被计算机分析器12识别并进一步分析处理。
步骤3、包含细胞的连续液流直接进入电离室2;液滴或连续液流进入电离室2后,被充分蒸发、离子化形成离子;
步骤4、由于细胞彼此分离,因此来自不同细胞的离子会依次进入质谱检测模块,经过质谱分析器11得到的结果由计算机分析器12进行处理,从而得到来自细胞的质谱图,进一步分析出细胞中的代谢物/金属元素的种类和含量;
步骤5、在数据处理模块中,将光谱检测模块1和质谱检测模块得到的数据整合从而得到细胞的多维度、多组学数据。
上述各实施例仅用于说明本发明,各部件的结构、尺寸、设置位置及形状都是可以有所变化的,在本发明技术方案的基础上,凡根据本发明原理对个别部件进行的改进和等同变换,均不应排除在本发明的保护范围之外。
本领域内的技术人员应明白,本申请的实施例可提供为方法、系统、或计算机程序产品。因此,本申请可采用完全硬件实施例、完全软件实施例、或结合软件和硬件方面的实施例的形式。而且,本申请可采用在一个或多个其中包含有计算机可用程序代码的计算机可用存储介质(包括但不限于磁盘存储器、CD-ROM、光学存储器等)上实施的计算机程序产品的形式。
本申请是参照根据本申请实施例的方法、设备(系统)、和计算机程序产品的流程图和/或方框图来描述的。应理解可由计算机程序指令实现流程图和/或方框图中的每一流程和/或方框、以及流程图和/或方框图中的流程和/或方框的结合。可提供这些计算机程序指令到通用计算机、专用计算机、嵌入式处理机或其他可编程数据处理设备的处理器以产生一个机器,使得通过计算机或其他可编程数据处理设备的处理器执行的指令产生用于实现在流程图一个流程或多个流程和/或方框图一个方框或多个方框中指定的功能的装置。
这些计算机程序指令也可存储在能引导计算机或其他可编程数据处理设备以特定方式工作的计算机可读存储器中,使得存储在该计算机可读存储器中的指令产生包括指令装置的制造品,该指令装置实现在流程图一个流程或多个流程和/或方框图一个方框或多个方框中指定的功能。
这些计算机程序指令也可装载到计算机或其他可编程数据处理设备上,使得在计算机或其他可编程设备上执行一系列操作步骤以产生计算机实现的处理,从而在计算机或其他可编程设备上执行的指令提供用于实现在流程图一个流程或多个流程和/或方框图一个方框或多个方框中指定的功能的步骤。
Claims (10)
1.一种流式细胞多谱分析仪,其特征在于,包括进样模块、光谱检测模块、电离室、质谱检测模块以及数据处理模块;所述进样模块将输出的连续液流传输至所述光谱检测模块内进行处理后,连续液流传输至所述电离室内,经所述光谱检测模块处理后得到的电信号传输至所述数据处理模块;所述电离室处理后得到的离子进入所述质谱检测模块进行处理,处理后的结果传输至所述数据处理模块;所述数据处理模块将接收到的全部数据进行整合。
2.如权利要求1所述流式细胞多谱分析仪,其特征在于,所述进样模块包括进样泵、进样池和聚焦流路;所述进样泵的输出端经所述进样池与所述聚焦流路的一端连接,所述聚焦流路的另一端与所述光谱检测模块的输入端连接。
3.如权利要求2所述流式细胞多谱分析仪,其特征在于,所述进样泵采用恒压泵或恒流泵;所述进样池采用玻璃、塑料或金属材料制成;所述聚焦流路采用光学玻璃或石英管制成。
4.如权利要求1所述流式细胞多谱分析仪,其特征在于,所述光谱检测模块包括第一流路、光源、透镜、色散棱镜、光电倍增管和电信号放大器;所述第一流路的一端与所述进样模块连接,由所述进样模块流出的连续液流进入所述第一流路内;所述光源发射的激发光经所述透镜会聚后,垂直照射在所述第一流路中的连续液流上激发产生荧光,产生的荧光经所述色散棱镜产生特定波长的荧光由所述光电倍增管接收并转换成电信号,该电信号传输至所述电信号放大器放大后,传输至所述数据处理模块。
5.如权利要求4所述流式细胞多谱分析仪,其特征在于,所述第一流路采用光学玻璃或石英管制成;所述光源采用弧光灯或激光,所述光源的波长范围为300~650nm。
6.如权利要求4所述流式细胞多谱分析仪,其特征在于,所述电离室与所述第一流路的另一端连接,由所述第一流路将包含细胞的连续液流直接进入所述电离室内,经所述电离室处理形成离子后传输至所述质谱检测模块。
7.如权利要求6所述流式细胞多谱分析仪,其特征在于,所述电离室采用气体辅助电喷雾的方式,实现在线的萃取和离子化,包括鞘流液注射泵、进样毛细管、鞘流液三通、鞘流液毛细管、气瓶、气路通道、气路三通、气路毛细管、高压直流电源和雾化锥口;
所述进样毛细管的一端与所述第一流路的另一端连接,所述进样毛细管的另一端与所述鞘流液三通的第一端连接,所述鞘流液三通的第二端与所述鞘流液注射泵连接,所述鞘流液三通的第三端经所述鞘流液毛细管与所述气路三通的第一端连接,所述气路三通的第二端经所述气路通道与所述气瓶连接,所述气路三通的第三端与所述雾化锥口连接,将离子经所述雾化锥口进入所述质谱检测模块中质谱分析器内;
所述高压直流电源与所述鞘流液三通连接,为所述鞘流液三通内的鞘流液施加电压形成喷雾。
8.如权利要求1所述流式细胞多谱分析仪,其特征在于,所述质谱检测模块包括质谱分析器和计算机分析器;所述质谱分析器将接收到的离子分析处理后得到的结果,传输至所述计算机分析器内进行处理。
9.如权利要求8所述流式细胞多谱分析仪,其特征在于,所述数据处理模块设置在所述计算机分析器上,用于将所述光谱检测模块和所述质谱检测模块得到的数据整合分析。
10.一种流式细胞多谱分析仪的使用方法,其特征在于,该方法基于如权利要求1至9任一项所述流式细胞多谱分析仪实现,其包括:
将待测细胞悬液加入进样池,开启进样泵将细胞悬液稳定地引入聚焦流路中,经过聚焦后细胞在连续液流中呈单行排列,进入光学检测模块;
经过透镜聚焦整形后的光束垂直照射在第一流路中的连续液流上,激发产生的荧光经色散棱镜产生特定波长的荧光由光电倍增管捕获转换成电信号,该电信号经电信号放大器放大后被计算机分析器识别并分析处理,得到细胞生物学参数以及细胞上荧光标记的蛋白质的相对含量信息;
包含细胞的连续液流直接进入电离室,液滴或连续液流进入电离室后,被充分蒸发、离子化形成离子;
来自不同细胞的离子依次进入质谱检测模块,经过质谱分析器得到的结果由计算机分析器进行处理,得到来自细胞的质谱图,得到细胞中的代谢物/金属元素的种类和含量;
在数据处理模块中,将光谱检测模块和质谱检测模块得到的数据整合得到细胞的多维度、多组学数据。
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