CN114002357A

CN114002357A - 利用高效液相色谱仪检测非那雄胺环氧杂质的方法

Info

Publication number: CN114002357A
Application number: CN202111346343.XA
Authority: CN
Inventors: 胡雄; 龙能吟; 田青; 蒋胜兰
Original assignee: Hunan Kerey Pharmaceutical Co ltd
Current assignee: Hunan Kerey Pharmaceutical Co ltd
Priority date: 2021-11-15
Filing date: 2021-11-15
Publication date: 2022-02-01
Anticipated expiration: 2041-11-15
Also published as: CN114002357B

Abstract

本发明提供了一种利用高效液相色谱仪检测非那雄胺环氧杂质的方法，该方法将非那雄胺待测样品进行液相色谱检测，包括对环氧杂质进行定性或定量；色谱条件为：C18色谱柱，流动相为乙腈‑水，乙腈和水体积比为25～45：55～75，柱温为50～65℃；所述环氧杂质为

使用本发明的方法，可有效对非那雄胺中的环氧杂质进行定量检测，对非那雄胺的质量控制和工业优化具有重要意义。

Description

利用高效液相色谱仪检测非那雄胺环氧杂质的方法

技术领域

本发明涉及药物杂质检测技术领域，更具体地，涉及一种利用高效液相色谱仪检测非那雄胺环氧杂质的方法。

背景技术

非那雄胺(Finasteride)化学名为N-叔丁基-3-氧代-4-氮杂-5α-雄甾-1-烯-17β-甲酰胺，化学式为C₂₃H₃₆N₂O₂，是一种4-氮杂甾体化合物，其结构式如下：

非那雄胺作为竞争性细胞内酶-II型5a-还原酶抑制剂，能非常有效地减少血液和前列腺内的二氢睾丸酮，对良性前列腺增生和雄激素脱发的治疗作用可靠，且安全性和耐受性良好。

随着科研水平的提高，以及鼓励药物创新的政策，国内创新药物数量呈明显上升趋势，但与发达国家创新药物的研究相比，我国对创新药物杂质研究的水平仍有一定的差距。

创新药物杂质的研究具有非常重要的意义，首先，杂质的研究是保证药物安全性的需要。创新药物的整个研究阶段，安全性是最重要的研究内容。其次，杂质研究涉及要学研究的全过程。药物的杂质来源检测方法、限度、可能存在的潜在安全隐患，这些由杂质带来的因素，对于剂型选择、处方组成、工艺确定、分析方法的研究以及药物的储存等均产生较大的影响。所以杂质是创新药物质量研究、质量控制和安全性研究的重点。杂质研究直接体现创新药物的研究水平。

因此，创新药物研究是药物研究的重要方面，杂质研究贯穿于整个药品研究的始终。药品中的杂质是否能得到合理、有效的控制，直接关系到药品的质量可控性与安全性。

现有的各国药典标准及文献关于非那雄胺有关物质中均未控制环氧杂质，而环氧杂质含有遗传毒性警示结构——环氧结构，是非那雄胺质量研究中需要重点关注的杂质。

发明内容

基于此，本发明提供了一种利用高效液相色谱仪检测非那雄胺环氧杂质的方法，该方法具体包括以下步骤：

将非那雄胺待测样品进行液相色谱检测，包括对环氧杂质进行定性或定量；色谱条件为：C18色谱柱，流动相为乙腈-水，乙腈和水体积比为25～45：55～75，柱温为50～65℃；

所述环氧杂质为

在一些实施方式中，所述流动相中，乙腈和水体积比为30～45： 55～70。

在一些实施方式中，所述流动相中，乙腈和水体积比为35～40： 60～65。

在一些实施方式中，柱温为55～60℃。

在一些实施方式中，所述非那雄胺待测样品用乙腈-水溶液溶解和稀释，按体积比计，乙腈：水＝45～55：45～55。

在一些实施方式中，检测波长为205～215nm。

在一些实施方式中，所述流动相的流速为0.5～1.2mL/min。

在一些实施方式中，进样量为8～12μL。

具体地，包括以下步骤：

分别配制非那雄胺待测样品溶液、环氧杂质溶液、系统适应性溶液，分别将系统适应性溶液、环氧杂质溶液和非那雄胺待测样品溶液注入高效液相色谱仪进行检测并分别记录检测结果；

其中，配制非那雄胺待测样品溶液、环氧杂质溶液、系统适应性溶液所用的溶剂均为乙腈水溶液(45～55：45～55，V/V)。

相较于现有技术，本发明的有益效果：

现有的各国药典标准及文献关于非那雄胺有关物质中杂质检测均未提到关于环氧杂质的控制，而本发明首创提出了环氧杂质的检测以及提供了环氧杂质的检测方法。使用本发明的方法，可有效分离非那雄胺与环氧杂质，对非那雄胺中的环氧杂质进行有效检测，且能准确定量分析非那雄胺中的环氧杂质。

本发明的方法，可有效地准确定量分析非那雄胺原料药或非那雄胺制剂中环氧杂质的质量，对非那雄胺有关杂质研究具有作用，进一步对非那雄胺的质量控制和工艺优化具有重要作用。

附图说明

图1为非那雄胺原料药粗品液相谱图(按碘代、脱碘路线自制)；

图2为非那雄胺片剂液相谱图(原研片剂，默克)；

图3为实施例1制得的1,2-环氧非那雄胺质谱谱图；

图4为实施例1制得的1,2-环氧非那雄胺氢谱谱图；

图5为实施例1制得的1,2-环氧非那雄胺碳谱谱图；

图6为实施例1制得的1,2-环氧非那雄胺红外谱图；

图7为实施例2中系统适应性溶液HPLC图；

图8为实施例2中杂质A(中国药典杂质I或EP药典杂质A)定位HPLC图；

图9为实施例2中1,2-环氧杂质定位HPLC图

图10为实施例3中非那雄胺原料药(自制合成工艺批21040801- 02批)的HPLC图；

图11为实施例3中非那雄胺片(参比制剂：保列治，批号：T027138 批)的HPLC图；

图12为对比例1中系统适用性溶液HPLC图；

图13为对比例1中杂质A的定位HPLC图；

图14为对比例1中环氧杂质的定位HPLC图；

图15为对比例2中系统适用性溶液HPLC图；

图16为对比例2中环氧杂质的定位HPLC图；

图17为对比例2中杂质A的定位HPLC图。

具体实施方式

在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施的限制。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。

在非那雄胺药物的原料药工艺开发中，采用双酰胺化合物为起始物料的合成路线，具体路线如下所示(下式示出碘代和脱碘两步)：

还有一种合成路线采用DDQ脱氢得到非那雄胺，如下所示：

采用上述两种路线合成的非那雄胺原料药存在多种杂质，给原料药的质量控制带来挑战。

本发明人在研究中偶然发现，无论是DDQ脱氢得到的非那雄胺原料药产品，还是脱碘得到的非那雄胺原料药产品，或者是原研非那雄胺药品(原研片剂，默克)，通过液相色谱分析，均存在一个与非那雄胺极性非常相似的未知杂质(如图1和图2)。通过对反应过程的分析，我们怀疑此杂质为非那雄胺1,2位双键被氧化，形成1,2-环氧非那雄胺。同时我们发现，在非那雄胺溶液中加入过氧化物时，此杂质会有增大的趋势，于是发明人定向合成了1,2-环氧非那雄胺(化合物结构已经质谱、核磁氢谱、碳谱及红外谱图鉴定)，确定了原料药和片剂中存在的未知杂质为1,2-环氧非那雄胺，由此确定该未知杂质的化学结构，确定该杂质，结构为：

对其命名：1,2-环氧非那雄胺；化学名称：N-叔丁基-1,2-环氧-3- 氧代-4-氮杂-5α-雄甾-1-烯-17β-甲酰胺。

如式I，该杂质存在环氧结构，是上述非那雄胺合成过程中，脱碘或DDQ脱氢过程中产生的副产物。该杂质含有遗传毒性警示结构——环氧结构，是非那雄胺质量研究中需要重点关注的杂质。

1,2-环氧非那雄胺与非那雄胺非常类似，很难通过常规原料杂质分离纯化的方法得到纯净的对照品。比如由于二者极性相差很小，柱分离难度很大。

基于此，发明人通过定向合成方法制备1,2-环氧非那雄胺。发明人以非那雄胺化合物为原料，在碱性条件下，非那雄胺化合物在氧化剂作用下发生反应生成1,2-环氧非那雄胺，其制备路线如下：

实施例1环氧杂质的制备

环氧杂质的制备方法，包括以下步骤：

将5g非那雄胺化合物溶解于50mL四氢呋喃中，加入20mL 20％碳酸钠水溶液，保温至20-30℃搅拌，分三次缓慢加入2.5g间氯过氧苯甲酸，保温搅拌1小时后，加入5mL 30％双氧水，继续保温反应10- 12小时，加入200mL水淬灭反应，100mL*2二氯甲烷萃取两次，合并有机相，100mL水洗一次，减压蒸馏近干，加入8mL丙酮，搅拌1小时，过滤，滤饼用少量丙酮淋洗，50℃鼓风干燥得化合物I；收率91.2％。

对所得化合物I进行质谱、核磁氢谱、碳谱及红外谱图鉴定，鉴定结果如图3-图6和表1所示，确定化合物I为1,2-环氧非那雄胺。

表1采用质谱、核磁氢谱、碳谱分析方法对化合物I的分析结果结果

实施例2

检验采用高效液相色谱分析方法检测非那雄胺环氧杂质，1，2-环氧杂质与非那雄胺以及中国药典杂质的分离度是否符合检测要求，具体方法如下：

供试品溶液配制：取非那雄胺约25mg(±0.5mg)，精密称定，置 25mL量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。

杂质贮备液配制：分别取非那雄胺杂质A(即中国药典杂质I或 EP药典杂质A，简称：CKA001-A)与1,2-环氧杂质(非那雄胺杂质I，简称：CKA001-I)各约12.5mg(±0.5mg)，精密称定，分别置50mL 量瓶中，加稀释剂适量使溶解并稀释至刻度，摇匀，作为杂质贮备液(也可分别作为非那雄胺杂质A和环氧杂质的定位溶液)；

系统适应性溶液配制：取非那雄胺约25mg(±0.5mg)，精密称定，置25mL量瓶中，加稀释剂适量使溶解，并分别精密加入上述杂质贮备液0.1mL，加稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得(主成分非那雄胺浓度为 1mg/mL，杂质浓度分别为1μg/mL)。

上述所有溶液配制所用的稀释剂均为乙腈-水(V/V＝50：50)

色谱条件：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(Phenomenex Luna Omega C18，250×4.6mm，5μm)，以乙腈-水(38：62；V/V)为流动相，流速为1.0mL/min，柱温为55～60℃，检测波长为210nm。按照等度程序进行洗脱。

测定方法：精密量取系统适应性溶液与各杂质定位溶液各10μL，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。

系统适应性溶液HPLC图如图7所示；

CKA001-A(中国药典杂质I或EP药典杂质A)定位HPLC图如图8所示；

CKA001-I(1,2-环氧杂质)定位HPLC图如图9所示。

结果分析：通过上述系统适用性溶液和各杂质定位的HPLC图可以看出，采用本发明的方法中环氧杂质(CKA001-I，RRT为0.88～0.89) 与杂质A(CKA001-A)与非那雄胺完全分离，分离度符合规定，能满足非那雄胺中环氧杂质的定量分析。

需要说明的是，本实施例的目的在于检验在使用高效液相色谱分析方法中，1,2-环氧非那雄胺作为环氧杂质与非那雄胺或非那雄胺杂质 A(中国药典杂质I或EP药典杂质A)的分离度是否符合规定，经验证，本发明的1,2-环氧非那雄胺可作为环氧杂质用于对非那雄胺中的环氧杂质进行定量或定性。

实施例3

对自制非那雄胺原料药(自制合成工艺批21040801-02批)和非那雄胺片(参比制剂：保列治，批号为T027138批)有关物质中环氧杂质进行检测，具体步骤如下：

供试品溶液配制：

非那雄胺原料药待测样品溶液配制：取非那雄胺原料药25mg，精密称定，置25mL量瓶中，加稀释剂(50％乙腈水)溶解并稀释至刻度，摇匀，即得；过滤，取续滤液。

非那雄胺片待测样品溶液配制：取非那雄胺片剂(相当于非那雄胺 25mg)，精密称定，置25mL量瓶中，加稀释剂(50％乙腈水)溶解并稀释至刻度，摇匀，即得；过滤，取续滤液。

色谱条件：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(Phenomenex Luna Omega C18，250×4.6mm，5μm)，以乙腈-水(38：62；V/V)为流动相，流速为1.0mL/min，柱温为60℃，检测波长为210nm。按照等度程序进行洗脱。

测定法：精密量取待测样品溶液各10μL，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。

非那雄胺原料药(自制合成工艺批21040801-02批)的HPLC图如图10所示；

非那雄胺片(参比制剂：保列治，批号：T027138批)的HPLC图如图11所示；

结果分析：通过非那雄胺片(参比制剂：保列治)及自制批非那雄胺原料药的HPLC图可知，非那雄胺片及自制原料药中均检出环氧杂质(CKA001-I；RRT:0.89)，需要开发适合的检测方法，控制该杂质限度。

对比例1

采用中国药典2020年版二部非那雄胺原料药有关物质的检测方法检测非那雄胺中的环氧杂质

照高效液相色谱法(通则0512)测定，具体步骤如下：

供试品溶液配制：取本品(自制合成工艺批21040801-02批)约 25mg，置25mL量瓶中，加流动相使溶解并稀释至刻度，摇匀。

对照溶液配制：精密量取供试品溶液1mL，置200mL量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀。

系统适用性溶液：取非那雄胺(自制合成工艺批21040801-02批)、杂质A(CKA001-A)及环氧杂质(CKA001-I)适量，加流动相溶解并稀释配制成每1mL中约含非那雄胺0.1mg、杂质A与环氧杂质0.01mg 的溶液。杂质定位溶液配制成浓度为0.01mg/mL。

色谱条件：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-水(50： 50，V/V)为流动相；检测波长为210nm；柱温为30℃；进样体积20 μL。

系统适用性要求：系统适用性溶液色谱图中，理论板数按非那雄胺峰计算不低于3000，非那雄胺峰与杂质A峰之间的分离度应复合要求。

测定法：精密量取系统适用性溶液与杂质定位溶液，分别注入高效液相色谱仪，记录色谱图至主成分色谱峰保留时间的2倍。

系统适用性溶液HPLC图如图12所示；

杂质A定位HPLC图如图13所示；

环氧杂质定位HPLC图如图14所示；

结果分析：通过图12至图14显示可知，采用中国药典2020年版二部非那雄胺原料药有关物质的检测方法，主成分非那雄胺与环氧杂质未分离，环氧杂质与非那雄胺完全重叠，说明按照中国药典方法不能有效检测非那雄胺中环氧杂质限度。

对比例2

采用非那雄胺原料药(参比制剂：保列治，批号为T027138批) 按EP10.0或USP43药典有关物质检测方法检测非那雄胺中的环氧杂质

具体步骤如下：

供试品溶液配制、对照溶液配制、系统适用性溶液配制均如对比例 1所示，区别在于供试品为非那雄胺原料药(参比制剂：保列治，批号为T027138批)。

色谱柱：250mm×4.6mm，5μm；填充剂：十八烷基硅烷键合硅胶 (C18)；

流动相：乙腈-四氢呋喃-水(10：10：80，V/V/V)；

流速：1.5mL/min；

检测波长：210nm；

柱温：60℃；

进样量：15μL；

稀释剂：乙腈-水(50：50，V/V)；

供试品浓度：10mg/mL；

洗脱方式：等度洗脱。

测定方法：如对比例1所示。

系统适用性溶液HPLC图如图15所示；

环氧杂质定位HPLC图如图16所示；

杂质A定位HPLC图如图17所示。

分析结果：通过上述系统适用性溶液及杂质定位溶液HPLC图可知，采用本方法检测，非那雄胺中环氧杂质与非那雄胺杂质A重叠，并未分离，说明非那雄胺原料药EP药典有关物质方法很难对环氧杂质及杂质A进行准确定量分析，不利于杂质限度控制。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims

1.利用高效液相色谱仪检测非那雄胺中环氧杂质的方法，其特征在于，包括以下步骤：

所述环氧杂质为

2.根据权利要求1所述的利用高效液相色谱仪检测非那雄胺中环氧杂质的方法，其特征在于，所述流动相中，乙腈和水体积比为30～45：55～70。

3.根据权利要求2所述的利用高效液相色谱仪检测非那雄胺中环氧杂质的方法，其特征在于，所述流动相中，乙腈和水体积比为35～40：60～65。

4.根据权利要求1所述的利用高效液相色谱仪检测非那雄胺中环氧杂质的方法，其特征在于，柱温为55～60℃。

5.根据权利要求1所述的利用高效液相色谱仪检测非那雄胺中环氧杂质的方法，其特征在于，所述非那雄胺待测样品用乙腈-水溶液溶解和稀释，按体积比计，乙腈：水＝45～55：45～55。

6.根据权利要求1所述的利用高效液相色谱仪检测非那雄胺中环氧杂质的方法，其特征在于，检测波长为205～215nm。

7.根据权利要求1所述的利用高效液相色谱仪检测非那雄胺中环氧杂质的方法，其特征在于，所述流动相的流速为0.5～1.2mL/min。

8.根据权利要求1所述的利用高效液相色谱仪检测非那雄胺中环氧杂质的方法，其特征在于，进样量为8～12μL。