CN113999817B - 半乳糖凝集素-3鼠杂交瘤细胞、单克隆抗体、检测试剂盒及检测方法 - Google Patents

半乳糖凝集素-3鼠杂交瘤细胞、单克隆抗体、检测试剂盒及检测方法 Download PDF

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Abstract

本申请涉及免疫学检测的技术领域，具体涉及半乳糖凝集素‑3鼠杂交瘤细胞、单克隆抗体、检测试剂盒及检测方法。其中，以半乳糖凝集素‑3重组蛋白作为抗原，对小鼠进行免疫反应后制备得到，得到两种半乳糖凝集素‑3鼠杂交瘤细胞，分别可以分泌包被抗体、标记抗体两种单克隆抗体。通过上述单克隆抗体制备得到的试剂盒，具有高精度、高灵敏度、高检出限和高稳定性，因此具有较好的实际运用价值。

Description

半乳糖凝集素-3鼠杂交瘤细胞、单克隆抗体、检测试剂盒及检 测方法
技术领域
本申请涉及免疫学检测的技术领域，具体涉及半乳糖凝集素-3鼠杂交瘤细胞、单克隆抗体、检测试剂盒及检测方法。
背景技术
Galectin-3也称半乳糖结合蛋白-3(Gal-3)，是Galectin家族的一员。Gal-3在人类基因组中由LGALS3编码，位于14号染色体，q21-q22，总长约17kb，包含6个外显子和5个内含子。Gal-3含有一个富于脯氨酸和甘氨酸重复序列的氨基端以及一个带有CRD的球形羧基端，分子量为29-35000，含251个氨基酸残基，有3个不同的结构域，分别为由12个氨基酸残基组成的N端结构域，其中丝氨酸Ser6磷酸化位点具有调节细胞靶向的作用；富含甘氨酸，酪氨酸，脯氨酸串联重复序列的类胶原结构，作为基质金属蛋白酶的底物；C端的CRD包含Bcl-2家族同源序列BH1中的保守基序NWGR。
血清Gal-3能促进心肌巨噬细胞和肥大细胞的活化和迁移，加速刺激纤维母细胞的活化，诱导成纤维细胞增殖，增加心肌间质如Ⅰ型胶原等在心脏及血管周围沉积，引起心肌肥厚、心肌顺应性减退，导致心脏重塑以及心肌纤维化，而心脏重塑和心肌纤维化正是影响慢性心力衰竭的重要决定性因素。经过多人研究表明，Gal-3在血清中的浓度水平是预测心力衰竭的重要标志，在临床应用上具有重要的意义。目前，用于检测Gal-3浓度水平的试剂盒，其检测范围较小，检出限较高，灵敏度、特异性和稳定性均有待提高。
发明内容
为了提供一种用于高精度、高灵敏度、高检出限和高稳定性的半乳糖结合蛋白-3的检测方法，本申请提供了半乳糖凝集素-3鼠杂交瘤细胞、单克隆抗体、检测试剂盒及检测方法。
首先，本申请提供了一种半乳糖凝集素-3鼠杂交瘤细胞，以半乳糖凝集素-3重组蛋白作为抗原，对小鼠进行免疫反应后制备得到。
进一步地，本申请提供了一种半乳糖凝集素-3鼠杂交瘤细胞，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No:23013，保藏时间为2021年7月16日。
同时，本申请还提供了另一种半乳糖凝集素-3鼠杂交瘤细胞，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No:23014，保藏时间为2021年7月16日。
同时，本申请还涉及两种单克隆抗体，分别为上述两种半乳糖凝集素-3鼠杂交瘤细胞分泌得到，分别编号为A80和B07。
本申请还提供了一种半乳糖凝集素-3检测试剂盒，包括包被抗体和标记抗体，其中包被抗体为A80，标记抗体为B07。
上述试剂盒可以为化学发光免疫试剂盒、酶联免疫试剂盒、胶体金免疫试剂盒、荧光免疫试剂盒中的任意一种。
最后，本申请还涉及血清半乳糖凝集素-3的检测方法，通过上述试剂盒建立基于DAS-ELISA的方法，并使用生物素放大系统，从而测得血清半乳糖凝集素-3的含量。
根据上述技术方案，本申请的有益效果如下：
通过本申请中提供的杂交瘤细胞分泌的到的单克隆抗体，均为IgG1亚型，免疫性能强，具有较强的活性和亲和力，稳定性高等优点。检上述单克隆抗体及试剂盒在运用于血清半乳糖凝集素检测的过程中，具有较强的特异性和较高的灵敏度，检测范围到达0.046-33.333ng/mL。
上述检测方法可以能够有效推动Gal-3检测的应用，促进Gal-3检测纳入常规临床检测中，在临床诊断中具有重要的作用。
说明书附图
图1是配对抗体线性检测的结果图。
具体实施方式
以下结合附图和实施例对本申请进行进一步说明。
生物保藏说明：半乳糖凝集素-3鼠杂交瘤细胞，标记为杂交瘤细胞株Gal-3-1，于2021年7月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101，保藏号为CGMCC No:23013。
在下文中，PBST洗涤液通过向PBS溶液中添加质量分数为0.5％吐温20配制而成。
半乳糖凝集素-3鼠杂交瘤细胞，标记为杂交瘤细胞株Gal-3-2，于2021年7月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101，保藏号为CGMCC No:23014。
实施例1，半乳糖凝集素-3鼠杂交瘤细胞的培养，通过Gal-3重组蛋白对小鼠进行免疫反应后经筛选分离得到。本实施例中，所用的Gal-3重组蛋白为毕赤酵母表达系统表达(44KD)，产自杭州博茵生物技术有限公司。小鼠选用选取6周龄，体重为18～20g的BALB/c的雌性小鼠，具体步骤如下。
免疫反应：将上述Gal-3重组蛋与弗氏完全佐剂风体积混合并充分乳化，在小鼠的腹部进行多点注射免疫，Gal-3的剂量为100μg/只，注射量为0.3ml/只。注射完毕后，两周后进行第二次免疫，Gal-3的剂量为80μg/只，注射量为0.3mL/只。一周后，对小鼠进行眼眶采血、分离血清，采用间接ELISA法检测血清效价，取效价达到1:105及以上的小鼠进行脾脏加强免疫，加强免疫所用的Gal-3重组蛋白的用量为50μg/只，加强免疫后继续正常饲养三天。
饲养层细胞的制备：取普通BALB/c小鼠的腹腔巨噬细胞和胸腺细胞作为饲养细胞，具体操作如下：取6周龄BALB/c小鼠，眼球放血致死，用消毒后的剪刀和镊子从后腹剪开腹部皮肤，暴露腹膜。用注射器取4ml IMDM培养基至腹腔，用手指轻轻挤压腹部，并进行反复冲洗，回收冲洗液。取出小鼠的胸腺，将其研磨后用IMDM培养基冲洗，回收洗液。将两次回收液混合后，以1300rpm的转速离心3min，弃上清，即得到饲养层细胞。
脾细胞的制备：以上述加强免疫后的小鼠，眼球放血致死，用消毒后的剪刀剪开小鼠加强部位的皮肤，用镊子和剪刀剥离脾脏，并去除脂肪和结缔组织，用IMDM培养基淋洗，淋洗完毕的脾脏置于过滤筛网内，用无菌注射器的手柄充分研磨，再用IMDM培养基冲洗脾细胞进入无菌离心管中，1300rpm离心3min，弃上清，即得到脾细胞。
细胞融合：将小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)和上述制得的小鼠脾细胞以1∶7的比例均匀分散于IMDM培养基中，随后以1300rpm离心3min，除去培养基后，在37℃水浴环境下，加入1mL 50％PEG(平均分子量1500)并融合2min，随后用无血清IMDM培养基终止融合，以1300rpm的转速离心3min，去上清，沉淀用HAT培养基悬浮，并加入上述制备得到的饲养层细胞，分装到96孔细胞板中，并置于37℃，含5％CO2的细胞培养箱中培养。
细胞筛选：上述细胞在培养过程中每日观察，当融合细胞覆盖孔底面积为10～30％时，用常规间接ELISA方法筛选分泌抗体的阳性孔，具体操作如下：以Gal-3重组蛋白为抗原，用CB稀释到0.5μg/ml，在96孔酶标板中以50μl/孔的量加入上述稀释液，4℃包被过夜。翌日，将96孔酶标板拍干，用含1％BSA的PBS缓冲液封闭(200μl/孔)，37℃封闭2小时，随后再次拍干。将待检细胞培养上清50μl/孔加入上述ELISA板中，于37℃反应30min后，拍干，并用PBST洗涤液洗涤三次并拍干。随后加入50μl/孔的HRP标记的羊抗鼠IgG，于37℃孵育30min后，再次用PBST洗涤液洗涤三次并拍干。之后加入50μl/孔的TMB显色液，于37℃避光显色10min，随后加入25μl/孔的2mol/L H2SO4终止反应，并于OD450处读取数值。阳性孔的确定原则：OD450值/阴性对照值≥2.1。选择呈强阳性反应的细胞孔，进行有限稀释法克隆。经过三至四次的克隆化筛选后，单克隆细胞株阳性率100％即确定为稳定细胞株。经扩大培养后，得到一系列细胞株。
注，在上述实验过臣妾各种，强阳性选取的标准为，OD450值大于等于30。
实施例2，单克隆抗体的制备，用于制备并筛选单克隆抗体，具体包括如下步骤。
腹水抗体的制备：取8周龄左右F1小鼠，腹腔注射0.3-0.5mL石蜡，7-10天后腹腔注入约8×105个杂交瘤细胞，注射后7-10天可见小鼠腹部明显膨大，注射针头采取腹水，8000rpm离心3min，收集上清液，得到单抗腹水。
腹水抗体的纯化：取1倍体积腹水加2倍体积0.06mol/L-1pH 4.8醋酸缓冲液稀释，室温下边搅拌边加辛酸(相较于腹水的体积为30μL/mL)，随后在4℃下静置1h至澄清，在12000rpm下离心20min，收集上清，再用50％饱和硫酸铵沉淀免疫球蛋白，4℃放置2h，3000rpm离心20min，沉淀用2倍于沉淀体积的PBS溶液将沉淀溶解，在4℃流动透析24h后即获纯化的腹水抗体(即抗体溶液)，-70℃保存。
抗体的HRP标记：取1mg HRP溶于0.5ml的蒸馏水中，再加入0.2ml NaIO4溶液(0.06mol/L)，混匀后置于4℃避光条件下放置30min。随后向上述体系中加入0.2ml乙二醇溶液(0.16mol/L)，在20±5℃避光条件中，以30rpm的搅拌速度搅拌30min。搅拌完毕后加入1mg的抗体溶液，混合均匀后装入透析袋中，置于CBS溶液中，在室温和避光条件下透析6h。从透析袋中取出反应液，加入50μl NaBH4溶液(5mg/ml)，混匀置于4℃避光条件下放置2h，随后缓慢加入等体积(约1.2ml)的饱和硫酸铵溶液，混匀并置于4℃避光条件下继续放置30min。处理完成后，上述体系在10000rpm的转速下离心10min，去上清，以200μl的PBS重悬沉淀，然后置于PBS中透析12-18h，期间换液一次。取出溶液并加入等体积的甘油，充分混匀后于-20℃保存备用，即得到标记抗体。
标记抗体和包被抗体的筛选：用CB将抗体溶液稀释到4μg/ml，以每孔100μl加入到酶标板孔中，4℃包被过夜。翌日将酶标板拍干，每孔加入200μl封闭液(含1％BSA的PBS)，于37℃下封闭2h，封闭结束后并拍干。将阳性血样用PBS稀释至2ng/ml，每孔加样100μl，以阴性血样为对照。37℃孵育1h后洗板3次，洗液为0.05％的PBST。
另外，用含1％BSA的洗液将标记抗体稀释成1000倍的工作液，每孔加100μl，37℃孵育1h，然后洗板4次并拍干。每孔加入100μl TMB显色液，37℃孵育10min。每孔加50μl加入终止液，在酶标仪上用450nm读取OD值。结果如表1和表2所示所示。
表1、以A80～AB6为包被抗体、以B01～B07为标记抗体的配对筛选检测
Figure BDA0003325433970000061
表2、以A80～AB6为标记抗体、以B01～B07为包被抗体的配对筛选检测
Figure BDA0003325433970000062
通过上述筛选，选取A80为标记抗体，B07为包被抗体，并对对应的细胞株进行保藏。
对抗体A80和B07，使用抗体分型鉴定试剂盒SBAClonotyping System-HRP(Southern Biotech，cat:5300-05)，按说明书方法进行鉴定，其结果如表3所示。
表3、单克隆抗体A80和B07的分型鉴定表
抗体 B07 A80
κ 1.003 1.603
λ 0.05 0.052
IgA 0.057 0.058
IgM 0.061 0.072
IgG1 3.283 3.5
IgG2a 0.083 0.08
IgG2b 0.05 0.101
IgG3 0.054 0.089
鉴定结果表明，A80抗体和B07抗体均为IgG1亚类，Ig-k亚型抗体。
实施例3，半乳糖凝集素-3检测试剂盒及检测方法，试剂盒中包含标记抗体A80和包被抗体B07，该试剂盒为酶联反应试剂盒，具体操作步骤如下：抗体的生物素化标记：配置20mmol/L的生物素溶液，将标记抗体A80稀释至2-5mg/ml，按摩尔比(生物素：抗体)20：1进行标记，室温反应2h。后置于0.05M PBS溶液透析过夜，换液3次。收集标记物，加入等体积甘油，并用0.22μm滤膜过滤，储存于-20℃冰箱。
配对抗体线性检测：将一份赋值的阳性混合血清(浓度100.2ng/ml)用阴性血清以3倍的梯度稀释至0.046ng/ml，并对各个梯度稀释的样本进行检测。具体检测方法如下：
用CB将包被抗体稀释到4μg/ml，以每孔100μl加入到酶标板孔中，4℃包被过夜。翌日将酶标板拍干，每孔加入200μl封闭液(含1％BSA的PBS)，于37℃下封闭2h，封闭结束后并拍干。每孔加入样本100μl。37℃孵育1h后洗板3次，洗液为0.05％的PBST。用含1％BSA的洗液将酶标抗体稀释成1000倍的工作液，每孔加100μl，37℃孵育1h，然后洗板4次并拍干。每孔加入100μl TMB显色液，37℃孵育10min。每孔加50μl加入终止液，在酶标仪上用450nm读取OD值。
以P/N值大于等于2作为阳性结果，其结果如表4和图1所示。
表4、A80/B07配对抗体的线性检测
Figure BDA0003325433970000071
Figure BDA0003325433970000081
通过上述实验数据可知，本申请中采用A80和B07体系得到的试剂盒，在抗原浓度低至0.046ng/mL的浓度下依旧具有明显的阳性表现，证明本申请中所采用的单克隆抗体，具有较低检出限，在实际运用中，灵敏度高，在定性检测方面具有广阔的运用前景。同时，
配对抗体的灵敏度检测：采用夹心ELISA方法，对单克隆抗体A80/B07配对的灵敏度进行检测。
用CB将包被抗体稀释到4μg/ml，以每孔100μl加入到酶标板孔中，4℃包被过夜。翌日将酶标板拍干，每孔加入200μl封闭液(含1％BSA的PBS)，于37℃下封闭2h，封闭结束后并拍干。每孔加入样本100μl。37℃孵育1h后洗板3次，洗液为0.05％的PBST。用含1％BSA的洗液将酶标抗体稀释成1000倍的工作液，每孔加100μl，37℃孵育1h，然后洗板4次并拍干。每孔加入100μl TMB显色液，37℃孵育10min。每孔加50μl加入终止液，在酶标仪上用450nm读取OD值。
其中，样本浓度选用最低检出限，即浓度为0.046ng/mL的阳性样本4个，每个样本进行5次检测，标记为L1～L20，同时将一个阴性样本检测20次，标记为N1～N20，其结果如表5所示。
表5、本实施例中试剂盒进行抗体灵敏度检测的结果
Figure BDA0003325433970000082
Figure BDA0003325433970000091
通过上述实验数据可知，本申请中的样本在检出限处具有较好的灵敏度和准确性，其中所有样本，最低检测限的阳性结果均大于阴性结果与两倍标准差之和，证明了上述试剂盒的具有出色的稳定性。
上述具体实施方式用来解释说明本发明，仅为本发明的优选实施例，而不是对本发明进行限制，在本发明的精神和权利要求的保护范围内，对本发明作出的任何修改、等同替换、改进等，都落入本发明的保护范围。

Claims (5)

1.半乳糖凝集素-3鼠杂交瘤细胞，其特征在于，为以下两种中的任意一种：
保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No:23013，保藏时间为2021年7月16日的半乳糖凝集素-3鼠杂交瘤细胞；
保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No:23014，保藏时间为2021年7月16日的半乳糖凝集素-3鼠杂交瘤细胞。
2.单克隆抗体，其特征在于，为IgG型抗体，由如权利要求1所述的保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No:23013，保藏时间为2021年7月16日的半乳糖凝集素-3鼠杂交瘤细胞分泌得到。
3.单克隆抗体，其特征在于，为IgG型抗体，由如权利要求1所述的保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No:23014，保藏时间为2021年7月16日的半乳糖凝集素-3鼠杂交瘤细胞分泌得到。
4.半乳糖凝集素-3检测试剂盒，其特征在于，包括包被抗体和标记抗体，所述包被抗体为如权利要求2所述的单克隆抗体，所述标记抗体为如权利要求3所述的抗体。
5.根据权利要求4所述的半乳糖凝集素-3检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒为化学发光免疫试剂盒、酶联免疫试剂盒、胶体金免疫试剂盒、荧光免疫试剂盒中的任意一种。
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