CN113980921B - 一种离子液体修饰的复合材料固定化漆酶的方法 - Google Patents

一种离子液体修饰的复合材料固定化漆酶的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种离子液体修饰的复合材料固定化漆酶的方法，所述离子液体修饰的复合材料用于漆酶的固定化，其制备包括复合材料的制备、复合材料的酸化及离子液体的修饰三个主要步骤；制备过程中，首先以累托石为原料，通过煅烧制备得到累托石复合材料；随后通过酸化、偶联剂改性在累托石复合材料表面形成丰富的羟基、氨基，最后利用上述羟基、氨基与离子液体进行结合，实现离子液体对载体的进一步修饰。所得固定化酶的固定量接近120mg/g；对常见的酚类物质2,4‑二氯苯酚、邻苯二酚、间苯二酚都具有良好的降解吸附效果，其中间苯二酚、2,4‑二氯苯酚的降解吸附率超过90%，邻苯二酚的降解吸附率接近80%，应用前景广阔。

Description

一种离子液体修饰的复合材料固定化漆酶的方法
技术领域
本发明属于漆酶固定化技术领域，具体涉及一种离子液体修饰的复合材料固定化漆酶的方法。
背景技术
漆酶是一种含铜的糖蛋白，由于其特殊的催化功能和广泛的作用底物特性，被研究人员广泛应用于生物学、环境学、食品工程、化学等技术领域。漆酶的低温定性和高成本的不足极大地制约了漆酶的单独使用，将漆酶进行固定化能够极大地提高酶的抗溶剂、抗热等性能，改善催化活性。
漆酶固定化中，载体的使用十分重要。通常来说，比表面积大、多孔、含丰富的官能团是选择固定化漆酶载体时必须要考虑的因素，围绕着上述目标特征，已有诸多的现有技术报道。专利文献CN102250868A报道了一种离子液体与Fe3O4颗粒复合通过吸附、共价固定化酶的方法，实现了载体的可回收利用；专利文献CN105836731A报道了一种离子液体修饰碳纳米管用于固定酶的方法；专利文献CN101724619A报道了一种离子液体修饰介孔分子筛固定酶的方法。上述方法中，离子液体都是对常用的纳米材料（如碳纳米管）、多孔材料（如介孔分子筛）等进行简单修饰，所用基体材料缺乏必要的修饰，使得酶固定化的量和固定化酶的降解吸附效果还不是特别理想。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明提供了一种离子液体修饰的复合材料固定化漆酶的方法，通过引入铁氧化物优化累托石基体的比表面积及孔道结构，随后通过引入羟基、氨基等基团，并用离子液体进行修饰，实现了漆酶的高固化和良好的降解吸附效果。
为了实现上述目的，本发明采取如下技术方案：
一种离子液体修饰的复合材料固定化漆酶的方法，包括如下步骤：
（1）漆酶固定化载体的制备；
（2）漆酶的固定化；
其中，漆酶固定化载体的制备包括如下步骤：
S1、复合材料的制备：将除杂干燥后的累托石与去离子水混合，接着加入硫酸铁溶液并调节pH至中性；随后进行搅拌反应，反应完成后进行抽滤、洗涤、干燥处理，经研磨后于750~850℃下煅烧，即得复合材料；
S2、复合材料的酸化：将步骤（1）得到的复合材料与稀盐酸溶液混合后，进行搅拌反应，反应完成后加入偶联剂溶液进行浸泡，浸泡完成后经洗涤、干燥处理，即得酸化复合材料；
S3、离子液体的修饰：将步骤（2）得到的酸化复合材料分散到溶剂中，随后加入离子液体，接着加热回流反应一段时间，反应完成后经过滤、洗涤、干燥处理，即得漆酶固定化载体。
优选地，步骤S1中搅拌反应的温度为室温，搅拌反应的时间为1~3.5h。
优选地，步骤S1中煅烧时间为0.5~1.5h。
优选地，步骤S1中硫酸铁与累托石的质量比为1:1.5~2.5，硫酸铁的浓度为0.05~0.2 g/g。
优选地，步骤S2中稀盐酸的质量分数为8~12%，稀盐酸溶液与复合材料的质量比为3~6:1。
优选地，步骤S2中搅拌反应温度为60~100℃，搅拌反应时间为1~3h。
优选地，步骤S2中偶联剂溶液通过以下方法制备得到：按照1~3%wt的浓度，将KH-550溶于体积比为1:4的水、丙酮混合溶液中即得。
优选地，步骤S3中溶剂为氯仿、丙酮、乙醇中的一种或多种，离子液体为1-乙基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐离子液体，离子液体与酸化复合材料的质量比为10~20：1。
优选地，步骤S3中回流反应温度为75~95℃，回流反应时间为18~36h。
优选地，步骤（2）中漆酶的固定化包括如下步骤：室温下，取1.5 mL pH为5.5的含漆酶的醋酸-醋酸钠缓冲液，随后加入0.5g漆酶固定化载体，室温下震荡2h，抽滤、洗涤后即得固定化漆酶；
其中，漆酶的浓度为0.5 g/L。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
（1）本发明提供了一种用于固定化漆酶的载体，首先以累托石为原料，通过煅烧制备得到累托石复合材料；随后通过酸化、偶联剂改性在累托石复合材料表面形成丰富的羟基、氨基，最后利用上述羟基、氨基与离子液体进行结合，实现离子液体对载体的进一步修饰。所得固定化酶的固定量接近120mg/g；对常见的酚类物质2,4-二氯苯酚、邻苯二酚、间苯二酚都具有良好的降解吸附效果，其中间苯二酚、2,4-二氯苯酚的降解吸附率超过90%，邻苯二酚的降解吸附率接近80%。
（2）本发明制备的累托石复合材料，以硫酸铁为铁源以取代累托石中硅氧结构中的硅离子，产生过剩电荷，极大地削弱了离子和累托石中硅氧结构间的作用力，并在溶剂的作用下脱离，使得制备得到的累托石的比表面积大；同时，在高温煅烧作用下，累托石表面及内部负载的部分铁氢氧化物会煅烧生成相应的铁氧化物，进一步改善累托石的内部孔道结构；同时，在795℃左右下煅烧，能够使得累托石的层状结构被破坏，进一步促进离子的交换。
（3）本发明中利用盐酸、偶联剂对累托石复合材料进行改性，能够使得累托石表面生成丰富的羟基、羧基、氨基等官能团，便于后续的离子液体改性修饰。
具体实施方式
为了使本发明的发明目的、技术方案和发明优势更加清楚阐述，以下将结合说明书实施例对本发明做进一步详细讲解。
特别需要强调的是，如无特殊说明，本发明中的原料或试剂通过商业渠道购买。
实施例1
一种离子液体修饰的复合材料固定化漆酶的方法，包括如下步骤：
（1）漆酶固定化载体的制备；
（2）漆酶的固定化：室温下，取1.5 mL pH为5.5的含漆酶的醋酸-醋酸钠缓冲液，随后加入0.5g漆酶固定化载体，室温下震荡2h，抽滤、洗涤后即得固定化漆酶；其中，漆酶的浓度为0.5 g/L。
其中，漆酶固定化载体的制备包括如下步骤：
S1、复合材料的制备：将除杂干燥后的12g累托石与100mL去离子水混合均匀，接着加入100g 0.08g/g的硫酸铁溶液并调节pH至中性；随后室温下搅拌反应1.5h，反应完成后进行抽滤、洗涤、干燥处理，经研磨后于790℃下1h，即得复合材料；
S2、复合材料的酸化：将10g步骤（1）得到的复合材料与30g 9%的稀盐酸溶液混合后，于65℃下搅拌反应1.5h，反应完成后加入到25mL偶联剂溶液中进行浸泡，浸泡完成后经洗涤、干燥处理，即得酸化复合材料；
S3、离子液体的修饰：将3g步骤（2）得到的酸化复合材料分散到40mL氯仿溶剂中，随后加入30g 1-乙基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐离子液体，接着于75℃下加热回流反应18h，反应完成后经过滤、洗涤、干燥处理，即得漆酶固定化载体。
其中，步骤S2中偶联剂溶液通过以下方法制备得到：按照1.5%wt的浓度，将KH-550溶于体积比为1:4的水、丙酮混合溶液中即得。
实施例2
一种离子液体修饰的复合材料固定化漆酶的方法，包括如下步骤：
（1）漆酶固定化载体的制备；
（2）漆酶的固定化：室温下，取1.5 mL pH为5.5的含漆酶的醋酸-醋酸钠缓冲液，随后加入0.5g漆酶固定化载体，室温下震荡2h，抽滤、洗涤后即得固定化漆酶；其中，漆酶的浓度为0.5 g/L。
其中，漆酶固定化载体的制备包括如下步骤：
S1、复合材料的制备：将除杂干燥后的12g累托石与100mL去离子水混合均匀，接着加入100g 0.09g/g的硫酸铁溶液并调节pH至中性；随后室温下搅拌反应2h，反应完成后进行抽滤、洗涤、干燥处理，经研磨后于795℃下1h，即得复合材料；
S2、复合材料的酸化：将10g步骤（1）得到的复合材料与30g 8%的稀盐酸溶液混合后，于70℃下搅拌反应2h，反应完成后加入到25mL偶联剂溶液中进行浸泡，浸泡完成后经洗涤、干燥处理，即得酸化复合材料；
S3、离子液体的修饰：将3g步骤（2）得到的酸化复合材料分散到40mL氯仿溶剂中，随后加入35g 1-乙基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐离子液体，接着于80℃下加热回流反应24h，反应完成后经过滤、洗涤、干燥处理，即得漆酶固定化载体。
其中，步骤S2中偶联剂溶液通过以下方法制备得到：按照2%wt的浓度，将KH-550溶于体积比为1:4的水、丙酮混合溶液中即得。
实施例3
一种离子液体修饰的复合材料固定化漆酶的方法，包括如下步骤：
（1）漆酶固定化载体的制备；
（2）漆酶的固定化：室温下，取1.5 mL pH为5.5的含漆酶的醋酸-醋酸钠缓冲液，随后加入0.5g漆酶固定化载体，室温下震荡2h，抽滤、洗涤后即得固定化漆酶；其中，漆酶的浓度为0.5 g/L。
其中，漆酶固定化载体的制备包括如下步骤：
S1、复合材料的制备：将除杂干燥后的12g累托石与100mL去离子水混合均匀，接着加入100g 0.095g/g的硫酸铁溶液并调节pH至中性；随后室温下搅拌反应2.5h，反应完成后进行抽滤、洗涤、干燥处理，经研磨后于800℃下1h，即得复合材料；
S2、复合材料的酸化：将10g步骤（1）得到的复合材料与30g 9.5%的稀盐酸溶液混合后，于75℃下搅拌反应2h，反应完成后加入到25mL偶联剂溶液中进行浸泡，浸泡完成后经洗涤、干燥处理，即得酸化复合材料；
S3、离子液体的修饰：将3g步骤（2）得到的酸化复合材料分散到40mL氯仿溶剂中，随后加入40g 1-乙基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐离子液体，接着于85℃下加热回流反应24h，反应完成后经过滤、洗涤、干燥处理，即得漆酶固定化载体。
其中，步骤S2中偶联剂溶液通过以下方法制备得到：按照2%wt的浓度，将KH-550溶于体积比为1:4的水、丙酮混合溶液中即得。
对实施例1~3制备得到的固定化漆酶进行酶活力测试、固定化漆酶量测试、降解吸附性能测试、热稳定性测试。具体测试方法如下：
（1）酶活性测试
将2mL 1mg/mL的游离酶或者2 mg 得到的固定化漆酶加入到1mmol/L的ABTS溶液中，于25℃下振荡反应15min后，置于冰浴中终止反应，离心分离，使用紫外-可见分光光度计测定上清液在420nm处的吸光度变化，即可计算出相应的酶活力。
本实施例中，紫外-可见分光光度计型号为新世纪T6。
（2）固定化漆酶量测试
a）蛋白质标准曲线的绘制：按照不同量分别加入1000µg/mL 标准蛋白质溶液和蒸馏水，随后再分别依次加入5mL考马斯亮蓝 G-250 试剂，染色 5 min 后测其吸光度，以蛋白质含量为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制蛋白质标准曲线。
b）固定化漆酶量的测定：采用考马斯亮蓝法进行漆酶量的测试；其中，酶量计算公式如下：
Q（%）=（Co-C）V/W*100
上式中，Q为酶吸附量，Co为固定化前溶液中的漆酶的浓度；C为固定化后溶液中漆酶的浓度，V为固定化溶液的总体积，W为载体的质量。具体到本案，Co=0.5 g/L，V=1.5mL=1.5*10-3L，W=0.5g。具体的测试、计算结果见表1。
表1固定化漆酶量测试结果
固定化漆酶量/（mg/g）
实施例1 121.3
实施例2 119.8
实施例3 122.6
从表1中可以看到，本发明中各实施例对漆酶的固定化量接近120mg/g，固定化效率高。
（3）常见酚类物质的降解吸附
取0.2g固定化漆酶与15mL、10mg/L的2,4-二氯苯酚进行混合，室温条件下反应5h，离心分离，取10mL上清液稀释，随后依次加入1.25mL、0.5mol/L 的 NH3·H2O，0.5ml、2%的4-氨基安替比林，0.5mL、80g/L 的铁氰化钾溶液，搅拌反应 15min，通过紫外分光光度计测量在波长 510nm 处的吸光度变化，即可计算得到固定化漆酶对 2,4-二氯苯酚的吸附降解率。
同时，取0.2g固定化漆酶与15mL、10mg/L的邻苯二酚或间苯二酚中分别进行混合，室温条件下反应3h，调节pH值至8左右，终止反应，随后离心分离，利用HPLC检测分离得到的上清液中的邻苯二酚或间苯二酚的浓度，即可计算得到相应物质的吸附降解率。
本实施例中，HPLC为日本岛津LC-20A。
表2 三种二氯苯酚降解吸附测试结果
Figure DEST_PATH_IMAGE001
从上表中，可以看到，本申请各实施例中制备得到的固定化漆酶对邻苯二酚、间苯二酚及2,4-二氯苯酚均具有较好的吸附降解率。
（4）热稳定性测试
将实施例1~3制备得到的固定化漆酶与游离酶在不同温度下保存1.5h，按前述酶活测试方法，计算得到酶的剩余活性。
测试结果表明，固定化酶在60℃下保存1.5h后酶的剩余活性仍保持有75%以上；而游离漆酶的剩余活性不足70%。
以上说明描述本发明中的一个较佳的实施方式，不应将其看作为是对本发明权利要求保护范围的限制。在不脱离本发明原理和精神的情况下，任何修改、等效替换及改进，都应视为在本发明权利要求保护范围之内。

Claims (3)

1.一种离子液体修饰的复合材料固定化漆酶的方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）漆酶固定化载体的制备；
（2）漆酶的固定化；
其中，漆酶固定化载体的制备包括如下步骤：
S1、复合材料的制备：将除杂干燥后的累托石与去离子水混合，接着加入硫酸铁溶液并调节pH至中性；随后进行搅拌反应，反应完成后进行抽滤、洗涤、干燥处理，经研磨后于750~850℃下煅烧，即得复合材料；
S2、复合材料的酸化：将步骤S1得到的复合材料与稀盐酸溶液混合后，进行搅拌反应，反应完成后加入偶联剂溶液进行浸泡，浸泡完成后经洗涤、干燥处理，即得酸化复合材料；
S3、离子液体的修饰：将步骤S2得到的酸化复合材料分散到溶剂中，随后加入离子液体，接着加热回流反应一段时间，反应完成后经过滤、洗涤、干燥处理，即得漆酶固定化载体；
其中，步骤S2中偶联剂溶液通过以下方法制备得到：按照1~3%wt的浓度，将KH-550溶于体积比为1:4的水、丙酮混合溶液中即得；
其中，步骤S3中溶剂为氯仿、丙酮、乙醇中的一种或多种，离子液体为1-乙基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐离子液体，离子液体与酸化复合材料的质量比为10~20：1；
其中，步骤S3中回流反应温度为75~95℃，回流反应时间为18~36h；
其中，步骤S1中硫酸铁与累托石的质量比为1:1.5~2.5，硫酸铁的浓度为0.05~0.2g/g；
其中，步骤S2中稀盐酸的质量分数为8~12%，稀盐酸溶液与复合材料的质量比为3~6:1；
其中，步骤S2中搅拌反应温度为60~100℃，搅拌反应时间为1~3h；
其中，步骤（2）中漆酶的固定化包括如下步骤：室温下，取1.5mL pH为5.5的含漆酶的醋酸-醋酸钠缓冲液，随后加入0.5g漆酶固定化载体，室温下震荡2h，抽滤、洗涤后即得固定化漆酶；其中，漆酶的浓度为0.5g/L。
2.根据权利要求1所述的一种离子液体修饰的复合材料固定化漆酶的方法，其特征在于，步骤S1中搅拌反应的温度为室温，搅拌反应的时间为1~3.5h。
3.根据权利要求2所述的一种离子液体修饰的复合材料固定化漆酶的方法，其特征在于，步骤S1中煅烧时间为0.5~1.5h。
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