CN104313006A

CN104313006A - 一种酸酐修饰与海藻酸包埋联用的固定化漆酶及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN104313006A
Application number: CN201410594454.6A
Authority: CN
Inventors: 李娟�; 刘芳; 刘又年; 陈倩; 孙晓毅
Original assignee: Central South University
Current assignee: Central South University
Priority date: 2014-10-30
Filing date: 2014-10-30
Publication date: 2015-01-28

Abstract

本发明公开了一种酸酐修饰与海藻酸包埋联用的固定化漆酶及其制备方法。该固定化漆酶的制备过程包括：首先利用酸酐对漆酶进行修饰，然后用海藻酸对修饰化后的漆酶进行包埋，得到固定化漆酶。本工艺所制备的固定化漆酶可对废水中2，4-二氯苯酚进行去除。本发明方法拓宽了漆酶的pH、温度适用范围，增加了重复使用次数。在废水处理方面具有广阔的应用前景。

Description

一种酸酐修饰与海藻酸包埋联用的固定化漆酶及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及酶固定化及环境保护领域。具体涉及一种经酸酐修饰和海藻酸包埋联用的固定化漆酶及制备方法和应用。

背景技术

酶的固定化研究始于20世纪60年代，是指将水溶性的游离酶通过物理或者化学方法将其连接在一定的固相载体上，使其成为固定化酶。固定化酶在一定程度上弥补了上述游离酶不容易重复使用、成本高的不足，增加了酶的实际应用性。酶的固定化方法主要有：吸附法、包埋法、离子交换法、交联法、共价结合法等。遗憾的是，单一的固定化技术目前在提高酶的耐用性方面仍然存在很多局限性。例如，包埋法操作简单、酶活性损失小、酶包埋量大且固定化效率高，较适用于底物为小分子的酶的固定化。

漆酶(Laccase)是一类含多个铜离子的多酚氧化酶。在氧气存在的条件下，漆酶可以催化氧化多种底物，如酚类、芳香胺类、甾体、金属有机物等物质，被广泛应用于环境修复、造纸工业、能源领域、食品工业、生物检测等方面。例如，氯酚类物质2，4-二氯苯酚(DCP)是一种合成多种溶剂、医药和农药的中间体，难降解，易挥发，有较强的腐蚀性。目前DCP的去除主要有光降解、吸附、氧化还原、生物降解等方法。使用漆酶催化的生物降解DCP具有操作简单、条件温和、无二次污染等优点，受到了人们的重视。

根据漆酶来源的不同以及底物的不同，漆酶活性的最适pH差异较大。另一方面，不同来源的工业废水pH差异也很大。由于目前工业上漆酶的主要来源为漆树漆酶和真菌漆酶两大类，这两类漆酶的最适pH多在3～5，工业废水达标排放标准pH值在6～9。这些特性促使研究者开发新技术以拓宽漆酶的pH适用范围。文献报道漆酶用丁二酸酐修饰之后最适pH向碱性偏移[Chinese Journal ofCatalysis 2011，32(10)：1584-1591]；漆酶经邻苯二甲酸酐修饰后，pH适用范围得到拓宽[中国科技论文在线，2007，2：870-874]。然而，仅通过酸酐化学修饰漆酶仍然存在难以回收利用、不利于节约成本等不足。

此外，文献报道了单一海藻酸包埋来源放线菌的漆酶可以用于苯酚的降解，重复使用次数可以达到8次，主要用于造纸碱性废水的处理[World J Microbiol.Biotechnol.2008，24：1215-1222]。然而，由于海藻酸微球本身在碱性溶液中极易解离溶解，该方法为了克服这个问题使用了铜离子交联的海藻酸微球增强海藻酸微球的耐用性，但也导致了铜的二次污染。因此，开发稳定性更高(pH和温度适用范围更宽)、便于重复利用的漆酶固定化技术具有重要的现实意义。将化学修饰与物理包埋联用的固定化技术通过多重技术的互补结合，有可能弥补单一固定化技术的不足，有效提高酶的稳定性和循环使用性能。

发明内容

本发明的目的是提供一种化学修饰与物理包埋联用的固定化漆酶及其制备方法。具体涉及一种经酸酐修饰和海藻酸包埋联用的固定化漆酶及制备方法。

本发明中，漆酶可以为漆树漆酶或平菇漆酶，酸酐可以为丁二酸酐、马来酸酐或邻苯二甲酸酐。本发明制备固定化漆酶方法简单，只需两步：(1)利用酸酐修饰漆酶，得到羧基化漆酶；(2)将步骤(1)所得的羧基化漆酶溶液与海藻酸钠溶液混合，滴入CaCl₂溶液中进行交联，获得固定化漆酶微球。

上述方法的步骤(1)中，漆酶分子上的氨基与酸酐发生反应，制得羧基化漆酶。控制漆酶溶液浓度为0.5～50mg/mL，酸酐溶液浓度为5～500mM，反应时间为10min～24h。为了尽量减少反应中的酶活损失，反应体系采用冰浴；为了加快反应速度，采用磁力搅拌；反应时间优选为1h。反应结束后，利用pH为4.5的醋酸-醋酸钠缓冲溶液在4℃下对产物进行透析，除去未反应的酸酐分子。

所述步骤(2)中，用海藻酸对第一步制备的羧基化漆酶进行包埋固定化。羧基化漆酶与海藻酸钠混合均匀，所使用海藻酸钠浓度优选为2.5％，羧基化漆酶和海藻酸钠的体积比为1∶2，混合液于4℃下静置2～3h，待到混合液无气泡后，用注射器将混合液滴入CaCl₂溶液中。所用CaCl₂溶液的浓度优选为3％。钙离子与海藻酸分子上的羧基、漆酶分子上修饰的羧基具有强的络合作用，不仅能生成不溶于水的海藻酸钙微球，还能更大程度上有效包埋酶。研究发现，丁二酸酐修饰固定化漆酶微球的酶包埋率约为90％，未修饰微球的包埋率约为85％。钙离子交联的海藻酸微球还能保证所制备的固定化漆酶微球有良好的机械性能，不会出现酶泄露情况。在优化条件下所制备的固定化漆酶微球直径约为3mm。

本发明固定化漆酶的制备原理满足以下三点：第一，漆酶经酸酐修饰后，漆酶分子上带有较多的羧基，由于羧基与钙离子有较好的络合作用，从而能够有较多包埋在钙离子交联的海藻酸微球中；第二，漆酶经酸酐修饰后羧基含量的大大增加，保证漆酶的最适pH值向碱性偏移；第三，由于钙离子能够同时络合羧基化漆酶和海藻酸，提高了海藻酸在中性pH下的稳定性，从而固定化酶的耐用性和重复使用次数得到提高。

从上述操作步骤可知，本发明技术条件温和，不涉及苛刻的反应条件如高温高压等，有利于保持酶的构象，不损失酶的活力。研究发现丁二酸酐修饰后漆酶酶活回收率约为未修饰游离漆酶的1.5倍，丁二酸酐修饰固定化漆酶的酶活回收率约为未修饰固定化漆酶2～3倍。游离漆酶的pH和温度适用范围一般为pH 3～5，30～40℃。利用本发明制备的固定化漆酶有较宽的pH和温度适用范围，在pH 3～7、20～60℃范围内均有较高的活性。

氯酚类物质是废水中一类难降解的污染物。利用本发明的固定化漆酶微球对DCP进行降解，降解性能主要体现在pH近中性条件下具有较好的循环使用性能。由于pH过高会使微球溶解，使用此固定化漆酶时将pH控制在6左右。从图3可以看出，丁二酸酐修饰的固定化漆酶微球在pH 6进行DCP降解，循环使用12次之后，降解率仍达到30％以上，去除DCP性能优于其它对照体系。

本发明的优点在于：1)制备工艺简单，条件温和，不引入二次污染；2)所制备的固定化漆酶最适pH由酸性向碱性方向偏移，pH适用范围拓宽；3)所制备的固定化漆酶温度适用范围拓宽；4)在pH 6下用于去除DCP，满足较理想的重复使用次数。

附图说明

图1为实施例1中pH对游离漆树漆酶、丁二酸酐修饰漆酶、固定化漆酶活性的影响

图2为实施例1温度对游离漆树漆酶、丁二酸酐修饰漆酶、固定化漆酶活性的影响

图3为实施例3中游离平菇漆酶和修饰平菇漆酶经固定化后DCP降解实验

具体实施方式

下面结合实例对本发明作进一步说明，但本发明并不局限于此。

本发明中所用漆树漆酶(来源Rhus vernicifera)购自Sigma-Aldrich；

平菇漆酶(来源Pleurotus ostreatus)购自Sigma-Aldrich；

测定漆酶酶活的方法为2，2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(2，2′-Azinobis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate)，ABTS)法。

下述实施案例中，未修饰漆酶、被丁二酸酐(马来酸酐或邻苯二甲酸酐)修饰的漆酶、未修饰的固定化漆酶、被修饰的固定化漆酶以下分别用Lac、Lac-SA(Lac-MA或Lac-PA)、LacALG、Lac-SAALG(Lac-MAALG或Lac-PAALG)表示。

实施例1

1)Lac-SA的制备：取0.01g漆树漆酶于10mL pH 7.4磷酸盐缓冲溶液中，4℃下溶解1h后，在4℃、9000rpm下离心5min，得到漆酶溶液。取0.01g丁二酸酐(SA)溶于50mLpH 7.4的磷酸盐缓冲溶液中，得到2mM SA溶液。将漆酶溶液置于冰浴中，磁力搅拌下缓慢加入10mL SA溶液，反应1h。将反应后的溶液装于透析袋(截留分子量为3500)中，4℃下于醋酸缓冲溶液中透析过夜，得到Lac-SA溶液。修饰率约为50％。

2)Lac-SAALG的制备：称取3g CaCl₂溶于100mL水中，得到3％CaCl₂溶液。称取1.5g海藻酸钠溶于60mL蒸馏水中，得到2.5％海藻酸钠。将10mL Lac-SA与20mL 2.5％海藻酸钠混合均匀，置于4℃冰箱中，当混合液中无气泡时方可进行下一步包埋。将Lac-SA与海藻酸钠的混合液用注射器滴入3％CaCl₂溶液中，4℃下交联2h，得到Lac-SAALG微球。

3)LacALG的制备：与Lac-SAALG的制备方法相同，仅将Lac-SA溶液换为Lac溶液。

4)以ABTS为底物测定漆酶活性。以37℃下420nm处每分钟生成1μmol底物作为一个酶活力单位。

效果评价：

1.pH值适用范围

不同pH下测得相对酶活见图1，其中相对酶活是指不同pH条件下酶活，相对最适pH下酶活的百分比。结果表明，游离Lac最适pH为4.5，随着pH的增加，活性迅速减小，当pH增大到7时，相对酶活仅为10％左右；Lac-SA最适pH偏移到6，当pH增大到7时，相对酶活仍有80％左右；LacALG最适pH约为3.5，随着pH的增加相对酶活逐渐减小，当pH增加到7.0时，相对酶活为60％左右；Lac-SAALG最适pH向碱性方向偏移到了6.4，当pH为7.0时，相对酶活仍有约87％。

温度适用范围

不同温度下测得相对酶活见图2，其中相对酶活是指以各自条件下的酶活与最适温度下酶活的百分比。结果表明，Lac、Lac-SA的最适温度均为35℃，LacALG、Lac-SAALG的最适温度为45℃。Lac、Lac-SA随着温度的增加，酶活降低明显，LacALG、Lac-SAALG活性随温度改变没有太大变化。

实施例2

按照实施方案1的步骤，仅将原料中的丁二酸酐替换成马来酸酐或邻苯二甲酸酐。或将漆树漆酶替换成平菇漆酶。以ABTS法对漆酶的催化活性进行测定，效果评价总结为表1。

表1 酸酐修饰与海藻酸包埋联用固定化漆酶的性能结果

实施例3

分别取0.2g来源平菇漆酶制备的LacALG和Lac-SAALG微球，加入3mL pH 4.0和6.0的缓冲液，再加入1mL 360mg/L DCP溶液，37℃下反应1h后，测定在293nm处的吸光度。将反应完后的固定化酶洗涤回收，重新加入1mL 360mg/L DCP溶液，37℃下反应1h后，测定在293nm处的吸光度。依此类推，分别计算两种固定化漆酶对DCP的降解率。

图3显示了两种固定化酶降解DCP的重复使用性能。在pH 6多次循环使用过程中，Lac-SAALG对2，4-DCP的降解率明显高于其它几组。

Claims

1.一种酸酐修饰与海藻酸包埋联用的固定化漆酶及其制备方法，其特征在于化学修饰与物理包埋的联用，包括以下两个步骤：(1)化学修饰是指酸酐与漆酶分子上的氨基在缓冲溶液中反应，制备羧基化漆酶；(2)物理包埋是将羧基化漆酶与海藻酸钠溶液混合，然后逐滴滴入CaCl2溶液进行交联得到所述固定化漆酶。

2.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中漆酶具体来自漆树和平菇，所述酸酐为丁二酸酐、马来酸酐、邻苯二甲酸酐中的至少一种。

3.根据权利要求1所述步骤(1)的方法，其特征在于：漆酶溶液浓度为0.5～50mg/mL，酸酐溶液浓度为5～500mM，反应时间为10min～24h，反应温度为0～40℃；所述缓冲溶液的pH为3.0～8.0。

4.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于步骤(2)中所述物理包埋条件是羧基化漆酶浓度为0.1～5.0mg/mL，海藻酸钠的浓度为1％～5％，CaCl₂的浓度为1％～5％。

5.根据权利要求1所述的固定化漆酶形态为水凝胶微球，微球直径范围为1mm～10mm。

6.根据权利要求1所述，制备的固定化漆酶微球可直接用于废水中2，4-二氯苯酚的降解。

7.根据权利要求6所述，固定化漆酶微球对2，4-二氯苯酚的降解在pH4～6溶液中进行。