CN113980013A - 一种基于花菁类染料的化合物及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物医药技术领域，涉及化学药品原料药，具体涉及一种小分子光热剂，更具体地涉及一种基于花菁类染料的化合物及其制备方法与应用。化学结构如式(I)所示：
Figure DDA0003305992070000011
本发明提供的化合物可同时抑制多种热休克蛋白，同时能够高效进行低温光热治疗，具有十分美好的应用前景。

Description

一种基于花菁类染料的化合物及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，涉及化学药品原料药，具体涉及一种小分子光热剂，更具体地涉及一种基于花菁类染料的化合物及其制备方法与应用。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
癌症是严重威胁人类健康的恶性疾病。相较于传统的化疗、放疗以及手术疗法，光热治疗具有外源可控性、高选择性、非侵袭性、治疗时间短、治疗效果明显以及可重复治疗等优势，已经受到了医学领域的广泛关注。由于近红外光穿透性好，目前已经被广泛运用光热治疗之中。而近红外的光热剂，则是目前光热治疗的关键媒介。在外加光源的照射下，光热剂吸收光的能量并将其转化为热量外放，引发局部高温，杀死肿瘤细胞。
无机纳米材料(包括金纳米颗粒、CuS纳米颗粒、碳量子点等材料)是目前被广泛使用的光敏剂材料之一。它具有良好的光热转换效果，并且很大一部分具有近红外吸收的优势，使得此类材料在光热治疗领域受到广泛的重视。但是这类材料也存在一些尚未能解决的缺点，包括潜在的生物毒性、结构不确定以及难代谢等，导致该类型材料难以在临床中得到进一步应用。而另外一种被广泛使用的光热剂材料，有机分子，由于生物安全性好、结构明确、易于设计修饰合成等优势，也引起了人们的广泛研究兴趣。因此在过去的几年内，关于有机小分子光热转换试剂的研究，得到快速的发展。人们从自然界存在的天然小分子入手，开发了许多光热小分子用于光热治疗，例如花菁类分子，半花菁类分子，D-A-D结构苯环大共轭类似结构的分子等等。一般来说，所使用的外加光源的功率越大，升温越高，治疗效果越好。但是考虑到大功率的光照射会对周围正常组织造成损伤，因此，发展一种可以在低功率光源照射下依然保持良好光热性能的新型的小分子光热试剂，实现肿瘤组织的高效杀伤，同时避免对正常组织的损伤，是目前该领域的研究热点问题。现阶段，光热小分子的设计一般是聚焦在：1，科学家们会选择光热转换效率较高的光热主体分子，进行合理的结构设计与优化。2，科学家们会从提高分子的靶向性方面入手，或是修饰基团对肿瘤组织进行靶向；对癌细胞进行靶向；对亚细胞器进行靶向。经过一代代科学家的努力，许多高光热转换效率的小分子已经被成功开发。即使是在低功率密度的近红外光照射下，依然可以产生足够的局部温度用以诱发癌细胞的凋亡，却不会对周围正常组织造成损伤。这种治疗方法被称为低温光热治疗。
但是在实际应用中，低温光热疗效甚微，不尽如人意。这是因为，在肿瘤微环境中，存在许许多多的修复机制，对热损癌细胞进行修复，使得其可以产生热耐受能力，逃过光热治疗的杀伤，得以继续繁殖。比如，热休克蛋白家族，是帮助癌细胞产生热耐受的主要元凶之一。当癌细胞遭受高温的时候，这类蛋白会迅速的被表达，对细胞中其他热损蛋白进行修复，提高癌细胞的热耐受能力，削弱光热治疗的效果。针对此，已经有不少学者进行了研究：1，利用纳米药物作为载体，负载能够进行热休克蛋白基因沉默治疗的小干扰RNA(siRNA)，联合光热试剂，进行光热治疗+基因沉默疗法；2，利用纳米药物作为载体，负载热休克蛋白的抑制剂(PES、GA等)，针对性的克制一种热休克蛋白，配合光热试剂，进行光热治疗+化疗等。然而，发明人研究发现，一方面是这些研究大多都是设计了复杂的纳米药物，结构成分不清晰，且存在体内生物安全性难题。另一方面，体内的热休克蛋白种类繁多，常见的就有HSP27,HSP60,HSP70,HSP90等，单一克制某种热休克蛋白，整体而言，提高光热治疗的效果不是特别显著。
发明内容
为了解决现有技术的不足，本发明的目的是提供一种基于花菁类染料的化合物及其制备方法与应用，本发明提供的化合物可同时抑制多种热休克蛋白，同时能够高效进行低温光热治疗，具有十分美好的应用前景。
为了实现上述目的，本发明的技术方案为：
一方面，一种基于花菁类染料的化合物，化学结构如式(I)所示：
Figure BDA0003305992050000031
另一方面，一种上述基于花菁类染料的化合物的制备方法，按照如下反应路线获得式(I)所示：
Figure BDA0003305992050000041
第三方面，一种药物组合物，含有上述基于花菁类染料的化合物或其药学上可接受的盐。
第四方面，一种上述基于花菁类染料的化合物或药物组合物在制备光热剂中的应用。
第五方面，一种光热剂，包括活性成分和载体，所述活性成分为上述基于花菁类染料的化合物或药物组合物。
第六方面，一种上述基于花菁类染料的化合物、药物组合物或光热剂在制备热休克蛋白抑制剂中的应用。
第七方面，一种上述基于花菁类染料的化合物、药物组合物或光热剂在制备治疗肿瘤药物中的应用。
本发明提供的基于花菁类染料的化合物具有多种功能，1、能够同时抑制细胞内存在的多种热休克蛋白(HSP27,HSP70和HSP90)；2、其光热能力在肿瘤组织处得到激活，而在正常细胞处光热能力较弱；3、药物分子可用于近红外光热治疗，而其本身几乎对正常细胞无毒性。一方面，细胞内固有多种热休克蛋白得到抑制，癌细胞失去了热耐受能力；另一方面，小分子光热试剂在乏氧的肿瘤组织处被激活(激活后命名为E-NH2)，光热能力增强，特异性杀伤癌细胞。而在正常组织处，由于小分子光热剂的光热能力较弱，未得到激活，则在低功率的光照下，不会损伤周围健康组织。最后通过体内体外的系列实验证明，本小分子光热剂在低功率的808nm(0.33W/cm2)激光照射下，在约43℃的低温环境中有效的诱导了癌细胞凋亡，大幅度抑制了肿瘤的生长，实现了良好的低温光热治疗，却不会对周围正常组织造成损伤。
本发明的有益效果为：
1.本发明的基于花菁类染料的化合物，具有生物毒性低、可抑制多种热休克蛋白、高光热转换效率(38.2％)等特点，能在低功率密度的照射下，有效抑制小鼠乳腺癌的生长，提高乳腺癌的治疗效率，可用于生物体的治疗；且本发明的光热分子具有肿瘤特异性杀伤能力，不会损伤周围正常细胞。
2.本发明的光热剂合成方法简单，材料成分是有机分子，不引入有毒成分，不存在有毒试剂残留问题，生物安全性高。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为本发明实施例1制备的化合物E-NO2的质谱图。
图2为本发明实施例1制备的化合物E-NO2的核磁谱图。
图3(a)为本发明实施例1制备的化合物E-NO2在加入还原性物质NTR酶(硝基还原酶，肿瘤处过表达)后的质谱图；(b)为E-NH2化合物的质谱图。
图4(a)为对实施例1制备得到的化合物E-NO2的紫外吸收谱图；(b)为对实施例1制备得到的化合物E-NO2(及其被激活后的光热剂E-NH2的光热性能表征。
图5为实施例3中细胞摄取实验的荧光共聚焦成像图；(a)为细胞核染料hoechst；(b)为式(I)化合物E-NO2；(c)为二者的叠加图。
图6为实施例3中式(I)化合物E-NO2对多种热休克蛋白的抑制情况(使用westernblot法)；4T1细胞分别进行不同组别的处理，其中1组：PBS；2组：NIR；3组：E-NO2+NIR；4组：E-NO2+NIR；5组：E-NO2；6组：E-NO2。材料浓度都是10μM。
图7为实施例3中细胞毒性实验结果图；(a)为4T1细胞孵育不同浓度的E-NO2材料后，进行光照/不光照处理，24小时之后细胞存活率结果；(b)4T1细胞分别进行不同组别的处理，24小时之后细胞存活率结果；其中1组：PBS；2组：50μM吲哚菁绿+NIR(ICG，一种商业化光热剂)；3组：100μM吲哚菁绿+NIR；4组：10μM E-NO2+NIR(常氧条件下)；5组：10μM E-NO2+NIR(乏氧条件下)；(c)使用活死细胞染色试剂盒处理的相应组的共聚焦显微镜图片。
图8为实施例3中E-NO2对比单一抑制剂+光热剂的组合，细胞毒性实验结果。
图9为实施例3中活体治疗期间小鼠肿瘤体积(a)和体重(b)的变化曲线图。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
本发明的一种典型实施方式，提供了一种基于花菁类染料的化合物，化学结构如式(I)所示：
Figure BDA0003305992050000071
本发明的另一种实施方式，提供了一种上述基于花菁类染料的化合物的制备方法，按照如下反应路线获得式(I)所示化合物：
Figure BDA0003305992050000081
该实施方式的一些实施例中，对溴甲基苯甲酸与1,1,2-三甲基-1H-苯并[e]吲哚反应制备化合物1的条件为：惰性气氛下，加热反应。
该实施方式的一些实施例中，对溴甲基苯甲酸与1,1,2-三甲基-1H-苯并[e]吲哚的摩尔比为1:0.9～1.1。
该实施方式的一些实施例中，化合物1与化合物2制备化合物3的条件为：加入无水醋酸钠，在惰性气氛下，加热反应。
该实施方式的一些实施例中，化合物1与化合物2的摩尔比为2:0.9～1.1。
本发明所述的化合物2可以通过市售获得，但是为了降低成本，该实施方式的一些实施例中，化合物2的合成方法为：环己酮在和三氯氧磷作用下生成化合物2。
该实施方式的一些实施例中，化合物3和化合物4进行缩合反应采用的试剂为HATU和DIPEA。
该实施方式的一些实施例中，化合物3和化合物4的摩尔比为1:2.5～3.5。
所述化合物4可以通过市售获得，也可以自行合成，其合成方法为：2,4-噻唑啉二酮、4-乙氧基苯甲醛和2-(叔丁氧基羰基胺基)乙基溴，在催化剂四丁基碘化铵和三氟乙酸作用下，反应生成。
该实施方式的一些实施例中，化合物5制备式(I)所示化合物的过程为：化合物5与对氨基苯硫酚先进行取代反应，然后添加4-硝基苄基氯甲酸酯进行缩合反应。在添加4-硝基苄基氯甲酸酯进行缩合反应的过程中，需要添加缚酸剂(三乙胺)。
本发明的第三种实施方式，提供了一种药物组合物，含有上述基于花菁类染料的化合物或其药学上可接受的盐。
本发明的第四种实施方式，提供了一种上述基于花菁类染料的化合物或药物组合物在制备光热剂中的应用。
本发明的第五种实施方式，提供了一种光热剂，包括活性成分和载体，所述活性成分为上述基于花菁类染料的化合物或药物组合物。
本发明所述的载体为一般药用载体，包括但不限于血清蛋白如人血清蛋白，缓冲物质如磷酸盐，甘油，山梨酯，山梨酸钾，饱和植物脂肪酸的部分甘油酯混合物，水，盐或电解质等。载体的在光热剂中的含量可以是1～98重量％。
本发明的第六种实施方式，提供了一种上述基于花菁类染料的化合物、药物组合物或光热剂在制备热休克蛋白抑制剂中的应用。
本发明的第七种实施方式，提供了一种上述基于花菁类染料的化合物、药物组合物或光热剂在制备治疗肿瘤药物中的应用。
该实施方式的一些实施例中，所述肿瘤为乳腺癌。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。
实施例1
式(I)化合物的合成：
(1)将对溴甲基苯甲酸和1,1,2-三甲基-1H-苯并[e]吲哚按1：1的摩尔比，室温下溶解于DMF溶液中，在氮气保护下，加热回流1小时。反应结束后，减压蒸馏除去溶剂，将沉淀溶于二氯甲烷中，使用乙醚析出，过滤，干燥，得到化合物1，为白色粉末。
(2)在250mL的三颈反应瓶中加入100mL的无水DMF，置于冰浴中。缓慢加入合计68mL的三氯氧磷，在0℃下搅拌30分钟。撤去冰浴，待溶液缓慢升温至室温后，缓慢加入合计20mL的新蒸无水环己酮(0.2mol)。使用油浴，将溶液缓慢加热至50℃，搅拌6小时。(溶液从淡黄色变成深红色)关掉加热，将溶液倒入提前准备好的300g的碎冰中，于-20℃下缓慢搅拌2小时。然后将溶液转移至-20℃的冰箱内，静置过夜。第二天过滤收集，得到黄色沉淀物，真空干燥后，得到化合物2，为黄色粉末。
(3)将化合物1、化合物2和无水醋酸钠，按2：1：2的摩尔比，溶解于乙酸酐溶液，氮气保护下，加热回流3小时。待反应结束后，减压蒸馏除去乙酸酐溶液，用硅胶色谱柱纯化粗产物，使用二氯甲烷/甲醇(v/v，5：1)作为洗脱液，得到化合物3，为绿色粉末。
(4)将2,4-噻唑啉二酮和4-乙氧基苯甲醛按1.6：1的摩尔比，溶解于无水乙醇中，回流16小时。随后加入相对于2,4-噻唑啉二酮1.5当量的2-(叔丁氧基羰基胺基)乙基溴，继续回流10小时。待反应结束后，减压蒸馏除去无水乙醇溶液后，使用二氯甲烷溶解沉淀，再加入2mL三氟乙酸，于室温下搅拌1小时。反应结束后，减压蒸馏除去二氯甲烷/三氟乙酸混合溶剂，将沉淀溶于微量二氯甲烷中，使用乙醚析出，过滤，干燥，得到化合物4，为白色粉末。
(5)将化合物3、化合物4、HATU和DIPEA按1：3：1：2的摩尔比，溶解于二氯甲烷溶液，室温搅拌3小时。反应结束后，减压蒸馏除去二氯甲烷溶剂，用硅胶色谱柱纯化粗产物，使用二氯甲烷/甲醇(v/v，10：1)作为洗脱液，得到化合物5，为绿色粉末。
(6)将化合物5和对氨基苯硫酚按1：5的摩尔比，溶解于无水DMF,室温搅拌2小时。反应结束后，减压蒸馏除去DMF溶剂，将沉淀溶于微量二氯甲烷中，使用乙醚析出，过滤，干燥，称重沉淀物。随后将沉淀物、4-硝基苄基氯甲酸酯和三乙胺按1：1.2：10的摩尔比溶解于无水DMF，室温下搅拌过夜。反应结束后，减压蒸馏除去DMF溶剂，用硅胶色谱柱纯化粗产物，使用二氯甲烷/甲醇(v/v，10：1)作为洗脱液，得到式(I)化合物，为绿色粉末，记为E-NO2，表征结果如图1～3所示。
实施例2
E-NO2的光热效率：
根据Tian,Q.W.；Jiang,F.R.；Zou,R.J.；Liu,Q.；Chen,Z.G.；Zhu,M.F.；Yang,S.P.；Wang,J.L.；Wang,J.H.；Hu,J.Q.ACS Nano 2011,5,9761–9771中所述的方法测量并计算光热转换效率(η)，测量结果如图4所示，不同浓度的材料在808nm激光器的照射下，温度随时间的变化情况。
根据图4并依据下列公式计算得到实施例1制备的E-NO2的光热转换效率为38.2％。
公式(S1)：
Figure BDA0003305992050000121
其中，h是传热系数，s是容器的表面积，hs的值由公式(S2)确定。QDis代表由溶剂和容器介导的激光散发的热量。I是激光功率，A是800nm处的吸光度。
公式(S2)：
Figure BDA0003305992050000122
其中，m是含有光敏材料的溶液的质量，C是溶液的比热容，τs是相关的时间常数，可由方程(S3)确定。
公式(S3)：t＝-τsIn(θ)
其中，θ是使用公式(S4)计算的无量纲参数，称为驱动力温度。
公式(S4)：
Figure BDA0003305992050000123
其中，Tmax和TSurr分别是最大稳态温度和环境温度。
实施例3
生物实验
1、细胞摄取实验
把实施例1制备的E-NO2和细胞核示踪染料(hoechst)对细胞进行孵育，通过荧光共聚焦成像的叠加图(图5c)来说明E-NO2的被摄取情况。从图5得出的结果可以看出，E-NO2的荧光信号(绿色)与细胞核示踪染料(蓝色)的荧光信号几乎无叠加，表明实施例1的E-NO2主要是在细胞质内滞留。
2、热休克蛋白抑制实验
将4T1细胞在细胞培养皿中养好，进行不同处理，然后消化下来，进行westernblot测试。选取GADPH为参比蛋白，测定在不同处理后，细胞内热休克蛋白27/70/90的变化。结果如图6显示，在经过E-NO2处理后的细胞组，其热休克蛋白27/70/90的含量明显下降，表明了E-NO2具有良好的热休克蛋白抑制作用。即便是在光照之后，热休克蛋白含量上升，在经过E-NO2处理后，热休克蛋白也得到明显的抑制。
3、细胞毒性实验
该实施例对实施例1制备的E-NO2进行了毒性试验，主要探究了E-NO2自身的毒性以及其在光照射条件下的生物毒性(即光毒性)。
光敏剂自身的毒性以及光毒性是通过在4T1(小鼠乳腺癌细胞)细胞中的3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)测定来测量的。分别用不同浓度的材料(浓度分别为0、5、10、15、20μM)与4T1(小鼠乳腺癌细胞)细胞孵育，每种浓度分为两组，两组分别进行不光照与光照(光照条件为：808nm,0.33W/cm2)处理，之后用MTT处理后测量相应吸光度。并且进行了相对应MTT实验的活死细胞染色实验。结果如图7所示。从图7中可以看出，E-NO2自身对细胞并无毒性；而在经过光照后，其可以对肿瘤细胞产生很强的毒性，10μM E-NO2在经过5min的照射细胞的存活率仅为22％/8％(常氧/乏氧条件下)，说明其对肿瘤细胞有很好的杀伤作用(设置乏氧条件模拟肿瘤环境，将E-NO2激活成光热效果更好的E-NH2)。从图7可看出，相比于商业化的光热剂ICG，E-NO2具有更低的IC50值(半抑制浓度)，说明其治疗效果更佳。且为了进一步体现同时抑制多种热休克蛋白对于光热疗法疗效的提高，本实施例还选取了单一抑制热休克蛋白的小分子：PES(HSP70抑制剂)和GA(HSP90抑制剂)，结合E-NO2的主体分子IR825，比较它们在相同情况下的细胞杀伤情况。结果如图8所示，光热分子IR825+单一抑制的小分子的组合在相同光照情况下，相比于E-NO2在光照情况下，细胞存活率较高，表明单一抑制热休克蛋白不如同时抑制多种热休克蛋白杀伤力强。
4、活体实验
该实施例探究了实施例1制备的E-NO2对活体的治疗效果，进行了小鼠活体实验。所有的动物实验的进行都按照中华人民共和国实验室动物护理原则进行。先将6-8周的Balb/c小鼠注射4T1(小鼠乳腺癌细胞)，并将其随机分成五组待其长到50mm3，对其进行治疗处理。第一组，只注射磷酸盐平衡生理盐水(PBS)；第二组，只进行光照(NIR)处理；第三组瘤内注射实施例1的E-NO2；第四组，瘤内注射实施例1的E-NO2并进行光照(E-NO2+NIR)；第五组，瘤内注射不含有抑制基团的材料并进行光照(IR-NO2+NIR)；第六组，瘤内注射相比于第三组的实施例1的E-NO2十倍摩尔量的商业化的光热剂吲哚菁绿(ICG)并进行光照(ICG+NIR)。所有需要进行光照的组，都是在注射相应材料24小时后，用808nm激光器(0.33W/cm2)照射5分钟。结果如图所示。从图9中可以看出，前三组肿瘤生长迅速，没有特别明显的抑制效果；而第4组实验组可以得出，肿瘤生长得到明显的抑制，肿瘤组织得以坏死。其相比于无抑制的材料第5组和商业化光热剂第6组而言，其治疗效果也更加的好。这也证明了E-NO2具有多种热休克蛋白抑制功能的有机小分子光热剂对肿瘤具有更加优异的治疗效果。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种基于花菁类染料的化合物，其特征是，化学结构如式(I)所示：
Figure FDA0003305992040000011
2.一种权利要求1所述的基于花菁类染料的化合物的制备方法，其特征是，按照如下反应路线获得式(I)所示化合物：
Figure FDA0003305992040000021
3.如权利要求2所述的基于花菁类染料的化合物的制备方法，其特征是，对溴甲基苯甲酸与1,1,2-三甲基-1H-苯并[e]吲哚反应制备化合物1的条件为：惰性气氛下，加热反应；
或，对溴甲基苯甲酸与1,1,2-三甲基-1H-苯并[e]吲哚的摩尔比为1:0.9～1.1；
或，化合物1与化合物2制备化合物3的条件为：加入无水醋酸钠，在惰性气氛下，加热反应；
或，化合物1与化合物2的摩尔比为2:0.9～1.1。
4.如权利要求2所述的基于花菁类染料的化合物的制备方法，其特征是，化合物3和化合物4进行缩合反应采用的试剂为HATU和DIPEA；
或，化合物3和化合物4的摩尔比为1:2.5～3.5；
或，化合物5制备式(I)所示化合物的过程为：化合物5与对氨基苯硫酚先进行取代反应，然后添加4-硝基苄基氯甲酸酯进行缩合反应。
5.一种药物组合物，其特征是，含有权利要求1所述的基于花菁类染料的化合物或其药学上可接受的盐。
6.一种权利要求1所述的基于花菁类染料的化合物或权利要求5所述的药物组合物在制备光热剂中的应用。
7.一种光热剂，其特征是，包括活性成分和载体，所述活性成分为权利要求1所述的基于花菁类染料的化合物或权利要求5所述的药物组合物。
8.一种权利要求1所述的基于花菁类染料的化合物、权利要求5所述的药物组合物或权利要求7所述的光热剂在制备热休克蛋白抑制剂中的应用。
9.一种上述权利要求1所述的基于花菁类染料的化合物、权利要求5所述的药物组合物或权利要求7所述的光热剂在制备治疗肿瘤药物中的应用。
10.如权利要求9所述的应用，其特征是，所述肿瘤为乳腺癌。
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