CN113956985A - 一种怀牛膝根部消毒表面并分离培养其内生真菌的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种怀牛膝根部消毒表面并分离培养其内生真菌的方法，属于真菌分离培养技术领域，包括以下步骤:选取1年生的健康怀牛膝根部，对其依次采用75％乙醇浸泡30‑50s,3‑5wt％次氯酸钠振荡洗涤6‑8min,无菌水漂洗3‑5次进行消毒处理；将经上述消毒处理后的怀牛膝根部材料的周围组织裁剪丢弃，将剩余的中部组织接种到含青霉素和链霉素的PDA培养基和怀牛膝浸提液的PDA培养基上进行培养。本发明的方法对怀牛膝组织表面进行消毒，在保证消毒效果的同时，保护内生真菌不受伤害。
Description
技术领域
本发明属于真菌分离培养技术领域，具体涉及一种怀牛膝根部表面消毒并分离培养其内生真菌的方法。
背景技术
怀牛膝(Achyranthes bidentata Blume.)为苋科(Achyranthes)牛膝属深根系草本植物，生长于海拔200-1750米的山坡林下，主产于河南省焦作地区的武陟、沁阳、孟州、博爱、修武、温县一带(古怀庆府所辖)。该区域独特的地理地貌和气候特征，保证和保存了物种的生物遗传独立性。因此，怀庆府牛膝可能存在与其它地区、其它物种完全不同的潜在内生真菌物种资源。
从植物组织中分离得到内生真菌，是研究其功能以及多样性等性能的基础，大量关于内生真菌的研究都涉及从宿主植物中分离内生真菌。而在分离植物内生真菌的过程中，消毒方法和培养基选择是影响分离效果的关键因素。表面消毒不彻底，会造成宿主附生菌污染，而消毒剂浓度过高或者消毒时间过长，会造成内生真菌损伤严重。同时，内生真菌分离培养时的培养基选择不当，会使得内生真菌不易生长、挑取、辨认。因此，必须设计合理的表面消毒方法、检测表面消毒的效果，建立适宜的培养条件，筛选和优化培养基组成，保证植物内生真菌的分离效果。但迄今为止，国内外均未见针对怀牛膝根部表面消毒及其内生真菌分离方法的相关研究报告。
发明内容
本发明的目的在于:针对上述现有技术中存在的关于怀牛膝根部内生真菌研究的空白，以怀庆府道地药材怀牛膝为基础研究对象，提供一种能够广泛适用于怀牛膝根部表面消毒并分离培养其内生真菌的方法。
本发明采用的技术方案如下:
一种怀牛膝根部内生真菌的分离培养方法，包括以下步骤:
选取一年生健康怀牛膝，采集根部对其依次采用75％乙醇浸泡30-50s,3-5wt％次氯酸钠振荡洗涤6-8min,无菌水漂洗3-5次进行消毒处理。
进一步地，对根部依次采用75％乙醇浸泡50s,4wt％次氯酸钠振荡洗涤8min,无菌水漂洗5次进行消毒处理。
一种怀牛膝根部内生真菌的分离培养方法，包括以下步骤:
将经上述消毒处理后的材料的周围组织切剪丢弃，将剩余的中部组织接种到含青霉素和链霉素且含有怀牛膝浸提液的PDA培养基。
将上述怀牛膝根部中部组织剪成1.5-2.5mm的小段根。
上述含青霉素和链霉素的PDA培养基由PDA培养基中加入0.03-0.150g/L青霉素和0.02-0.125g/L链霉素得到，青霉素的优选量为0.08g/L，链霉素的优选量为0.06g/L。
上述青霉素和链霉素且含有怀牛膝浸提液的PDA培养基中怀牛膝浸提液的含量为80-120mL/L,青霉素的含量为0.03-0.150g/L，链霉素的含量为0.02-0.125g/L；怀牛膝浸提液含量优选为90mL/L,青霉素的优选量为0.08g/L，链霉素的优选量为0.06g/L；其中怀牛膝浸提液为水提液，将200怀牛膝整株切碎为约1*3cm的小块，加入1000mL蒸馏水中，加热煮沸30min，再补充蒸馏水至1L得到。
综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是:
在分离植物内生真菌的过程中，消毒方法和培养基条件是影响分离效果的关键因素。表面消毒不彻底，会造成宿主表生菌污染，而消毒剂浓度过高或者消毒时间过长，又会造成内生真菌损伤严重。因此要选择合适的表面消毒剂、确定合适的消毒方式并且设定合适的消毒剂浓度以及消毒时间，在保证消毒效果的同时又要保护内生真菌不受损伤。
首先需要确定表面消毒剂的种类，选用安全无毒以及更易清洗的次氯酸钠作为消毒剂，本发明经过实验处理发现，75％乙醇与一定浓度的次氯酸钠配合使用能够获得较好的的消毒效果。对于怀牛膝根部组织的表面消毒，选用三步法，即乙醇-次氯酸钠-无菌水，为避免消毒效果不彻底或怀牛膝根部组织出现褐化，确定了75％乙醇浸泡40s,4％次氯酸钠震荡洗涤根6min的消毒方式，并在次氯酸钠震荡洗涤后采用无菌水进行漂洗，使得本发明的方法能够充分而彻底地对怀牛膝根部组织的表面进行消毒，防止表面菌类对后续内生真菌分离培养的影响，同时也避免了组织褐化，怀牛膝根部内部组织受到损伤及其内生真菌被杀灭，影响内生真菌的多样性研究。
在怀牛膝根部内生真菌分离的过程中，培养基的营养条件是很关键的因素。如果培养基选择不当，可能会使某些内生真菌生长缓慢甚至不生长，或长出的内生真菌不易辨认、挑取和分离等。因此，选用合适的含有怀牛膝营养成分的内生真菌分离培养基，对保证怀牛膝根部内生真菌的分离效果是非常必要的。本发明通过前期对怀牛膝根部和其内生真菌的相关研究、合理推测及实验验证，最终确定了采用适合培养怀牛膝根部组织内生真菌生长的培养基，且长出的菌落容易辨认、挑取和分离。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步阐释。
实施例一：
本发明较佳的实施例提供一种怀牛膝根部表面消毒并分离培养其内生真菌的方法，具体步骤如下:
选取一年生健康怀牛膝，采集根部对其依次采用75％乙醇浸泡40s,4wt％次氯酸钠振荡洗涤6min,无菌水漂洗3次进行消毒处理。将消毒处理后的材料周围组织切剪丢弃，将剩余的怀牛膝根部中部组织剪成1.5-2.5mm的小段接种到含青霉素和链霉素且含有怀牛膝浸提液的PDA培养基即可，其中青霉素的含量为0.08g/L，链霉素的含量为0.06g/L，怀牛膝浸提液含量为90mL/L。
实施例二：
选取一年生健康怀牛膝，采集根部对其依次采用75％乙醇浸泡30s,3wt％次氯酸钠振荡洗涤7min,无菌水漂洗4次进行消毒处理。将消毒处理后的材料周围组织切剪丢弃，将剩余的怀牛膝根部中部组织剪成1.5-2.5mm的小段接种到含青霉素和链霉素且含有怀牛膝浸提液的PDA培养基即可，其中青霉素的含量为0.07g/L，链霉素的含量为0.07g/L，怀牛膝浸提液含量为100mL/L。
实施例三：
选取一年生健康怀牛膝，采集根部对其依次采用75％乙醇浸泡50s,5wt％次氯酸钠振荡洗涤8min,无菌水漂洗5次进行消毒处理。将消毒处理后的材料周围组织切剪丢弃，将剩余的怀牛膝根部中部组织剪成1.5-2.5mm的小段接种到含青霉素和链霉素且含有怀牛膝浸提液的PDA培养基即可，其中青霉素的含量为0.04g/L，链霉素的含量为0.05g/L，怀牛膝浸提液含量为120mL/L。
本发明不局限于上述可选的实施方式，任何人在本发明的启示下都可得出其他各种形式的产品。上述具体实施方式不应理解成对本发明的保护范围的限制，本发明的保护范围应当以权利要求书中界定的为准，并且说明书可以用于解释权利要求书。
Claims (8)
1.一种怀牛膝根部表面消毒的方法，其特征在于，包括以下步骤:
选取1年生的健康的怀牛膝，采集根部依次采用75％乙醇浸泡30-50s,3-5wt％次氯酸钠振荡洗涤6-8min,无菌水漂洗3-5次进行消毒处理。
2.根据权利要求1所述的怀牛膝根部表面消毒的方法，其特征在于，对根部依次采用75％乙醇浸泡30s,3wt％次氯酸钠振荡洗涤6min,无菌水漂洗3次进行消毒处理。
3.根据权利要求1所述的怀牛膝根部表面消毒的方法，其特征在于，对根部依次采用75％乙醇浸泡40s,4wt％次氯酸钠振荡洗涤7min,无菌水漂洗4次进行消毒处理。
4.根据权利要求1所述的怀牛膝根部表面消毒的方法，其特征在于，对根部依次采用75％乙醇浸泡50s,4wt％次氯酸钠振荡洗涤8min,无菌水漂洗5次进行消毒处理。
5.一种怀牛膝根部内生真菌的分离培养方法，其特征在于，包括以下步骤:将经权利要求1消毒处理后的材料的周围组织切剪丢弃，将剩余的中部组织接种到含青霉素和链霉素且含有怀牛膝浸提液的PDA培养基。
6.根据权利要求5所述的怀牛膝根部内生真菌的分离培养方法，其特征在于，中部组织剪成1.5-2.5mm的小段根。
7.根据权利要求5所述的怀牛膝根部内生真菌的分离培养方法，其特征在于，含青霉素和链霉素的PDA培养基由PDA培养基中加入0.03-0.150g/L青霉素和0.02-0.125g/L链霉素得到。
8.根据权利要求5所述的怀牛膝根部内生真菌的分离培养方法，其特征在于，含青霉素和链霉素以及怀牛膝根部浸提液的PDA培养基中怀牛膝根部浸提液含量为80-120mL/L,青霉素和链霉素的含量分别为0.03-0.150g/L和0.02-0.125g/L。
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