CN113945504A - 一种自身免疫性心肌炎标志物的联合检测系统 - Google Patents

一种自身免疫性心肌炎标志物的联合检测系统 Download PDF

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Abstract

本发明属于医学检测技术领域，具体涉及一种自身免疫性心肌炎标志物的联合检测系统。所述系统包括微球制备单元、流式微球检测单元、捕获微球单元、指标检测单元、计算存储单元；所述微球制备单元和计算存储单元数据连接，所述微球制备单元和流式微球检测单元数据连接，所述流式微球检测单元和捕获微球单元数据连接，所述捕获微球单元和指标检测单元数据连接，所述指标检测单元和计算存储单元数据连接；所述微球制备单元包括羧基化荧光编码微球模块、激活羧基化微球模块、抗体联结量修正模块、抗体微球偶联模块本发明将微球和流式分析技术相结合，可以对IL‑6、TNF‑α、MCP‑1等指标进行检查，及时反映自身免疫性心肌炎各阶段病情特征。

Description

一种自身免疫性心肌炎标志物的联合检测系统
技术领域
本发明属于医学检测技术领域，具体涉及一种自身免疫性心肌炎标志物的联合检测系统。
背景技术
心肌炎在儿童和青少年中并不少见，近年来病毒性心肌炎的相对发病率不断增加。最先出现原发感染的表现，病毒感染1-3周后，出现心肌炎症状，患者可出现心律失常，严重者可致扩张型心肌病，其至发展成为心功能不全。柯萨奇A、B组病毒，孤儿病毒，脊髓灰质炎病毒等病毒是心肌炎常见的病原体。病毒感染反复发生、迁延不愈，有一定的几率发展成导致扩张型心肌病(dilate cardiomyopathy，DCM)，DCM是以单侧或双侧心室扩大，伴心肌肥厚，心肌收缩功能减退为特征的疾病，常伴有充血性心力衰竭。发病原因至今不明，诸多研究表明:持续感染和感染后机体对心脏自身抗原的免疫反应，对DCM的发生发展起了重要的作用。急性心肌炎造成心肌损伤分为病毒性和自身免疫性损伤，均可引起心肌结构和功能的变化，不可避免地会引发机体产生针对心脏组织的自身抗体。在心肌损伤与重构的过程中，正常隐蔽的心肌组织成分可以被释放或暴露，从而形成自身免疫攻击的对象，也会进一步引发有关自身抗体的生成。自身免疫所致的损伤较病毒直接损伤发生时间晚，持续时间长，主要包括自身反应性杀伤性T细胞、自身反应性抗体(HRA)、细胞因子介导的心肌损伤。
自身免疫性心肌炎检查中主要采用对标志物的检查，但是当前技术中标志物检测不能进行自动化操作，人工操作中带来大量系统性误差和随机性误差，因此设计一种针对自身免疫性心肌炎指标的检测系统来提高监测的精确度极有必要。。
发明内容
本发明的目的在于：针对以上现有技术所述的现有自身免疫性心肌炎检测方法所存在的技术问题，本发明提供一种自身免疫性心肌炎标志物的联合检测系统及其检测方法，以精细化操作每一个检测步骤，将检测标志物的实验分析系统化，降低误差，提高检测效率。
一种自身免疫性心肌炎标志物的联合检测系统，所述系统包括微球制备单元、流式微球检测单元、捕获微球单元、指标检测单元、计算存储单元；所述微球制备单元和计算存储单元数据连接，所述微球制备单元和流式微球检测单元数据连接，所述流式微球检测单元和捕获微球单元数据连接，所述捕获微球单元和指标检测单元数据连接，所述指标检测单元和计算存储单元数据连接；所述微球制备单元包括羧基化荧光编码微球模块、激活羧基化微球模块、抗体联结量修正模块、抗体微球偶联模块。
一种自身免疫性心肌炎标志物的联合检测方法，所述检测方法具体步骤如下：
1)微球制备单元的羧基化荧光编码微球模块执行微球标记
针对所测标志物的捕获抗体与羧基化荧光编码微球偶联分别与血清中的标志物反应，再加入生物素标记的针对标志物的检测抗体和PE标记的亲和素检测血清中标志物的含量，流式细胞仪检测时每个羧基化荧光编码微球相当于一个细胞，顺次高速通过检测区，其羧基化荧光编码微球本身和PE指示染料的荧光和散射光将被相应的检测系统检测和记录下来，根据FL2和FL3的强度，可把各编码微球分开，而根据FL1的平均强度，可以定量分析血清中的三种标志物的浓度；
2)微球制备单元调动激活羧基化微球模块执行活化操作
将对应羧基化微球原液取出放置于室温，瞬时离心，漩涡振荡2-3分钟，使微球均匀悬浮于溶液中；具体操作为：每组取5个2mL离心管，向各管中分别加入对应羧基化微球原液100μL，再取一管加入羧基化微球原液1μL，用于阴性对照；②上述6管微球14500转/分，离心4分钟，小心弃上清；③每管分别加入100μL的微球洗涤缓冲液，漩涡振荡10秒，超声清洗10秒，14500转/分，离心4分钟，小心弃上清；④上述六管微球分别重悬于80μL微球激活缓冲液，漩涡振荡30秒，超声清洗30秒；⑤用微球激活缓冲液配置新鲜的EDC(1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐,50mg/mL)和Sulfo-NHS(硫化N-羟基琥珀酰亚胺，50mg/mL)，EDC和Sulfo-NHS拆封后，用5次后丢弃；⑥在激活微球(④中加入微球激活缓冲液后，称为激活微球)管内分别加入10μL EDC和Sulfo-NHS，室温避光震摇20分钟；⑦每管分别加入150μL 1×PBS，高速漩涡振荡10秒，14500转/分，离心4分钟，小心弃上清；⑧重悬微球于100μL 1×PBS，漩涡震荡30秒，超声清洗15秒；
3)微球制备单元调动抗体联结量修正模块执行活化最佳联接量的计算
将各组捕获抗体与微球相对应，管用1×PBS调节最终体积大约至500μL，室温避光摇震2小时；14500转/分,离心4分钟，小心弃上清；再加入500μL 1×PBS，14500转/分,离心4分钟，小心弃上清；重悬微球于250μL微球封闭缓冲液中，漩涡振荡15秒，室温避光摇震30分钟；14500转/分,离心4分钟，小心弃上清；加入500μL微球储存缓冲液，14500转/分,离心6分钟，小心弃上清；重悬于200μL微球储存缓冲液；
在取制备好的微球，用血细胞计数板在显微镜下计数，检测微球的浓度。每份微球取约10000个于流式管内，加入浓度25μg/mL的FITC标记羊抗鼠IgG50μL，室温避光摇震120分钟，用洗涤缓冲液洗涤一次，通过流式细胞仪检测FITC荧光强度中位数MFI(medianfluorescence intensity)，制着剂量反应曲线，计算其单克隆抗体加入量；
4)微球制备单元调动抗体微球偶联模块融合抗体
加入经步骤2)选定加入量的单克隆抗体到100μL已激活的微球中，用1×PBS调节最终体积至500μL；室温避光摇震2小时；14500转/分,离心4分钟，小心弃上清；加入500μL1×PBS，14500转/分，离心4分钟，小心弃上清；重悬微球于250μL微球封闭缓冲液中，漩涡振荡15秒，室温避光摇震30分钟；14500转/分,离心4分钟，小心弃上清；加入500μL微球储存缓冲液，14500转/分,离心6分钟，小心弃上清；重悬于200μL微球储存缓冲液。然后用血细胞计数板计算微球的浓度，4℃避光保存备用；
5)流式微球检测单元构建反应参数
通过正交试验优化试验条件调整反应参数具体操作为：①校准品的稀释：由于在摸索条件时加入的校准品保证过量，所以取10ng/mL的校准品；取出IL-6校准品(保存于4℃冰箱)，瞬时离心；再取出1个7mL离心管，标记为S，向S管中加入1×PBS 4999.5μL；取浓度为100μg/mL IL-6校准品0.5μL于S管中，混匀后S管中含有10ng/mL的IL-6校准品；②生物素标记抗体的倍比稀释：取出浓度为0.2mg/mL生物素标记的羊抗人IL-6抗体(保存于4℃冰箱)放置于室温，瞬时离心；在取出五个5mL离心管，标记B1-B5，向B1管中加入1×PBS 2950μL，B2-B5管中加入1×PBS 2000μL；取浓度为0.2mg/mL生物素标记的羊抗人IL-6抗体50μL于B1管中，混匀后取1000μL于B2管中，类似操作，直到取1000μL于B5管中；B1-B5管中分别含有1:60、1:180、1:540、1:1620、1:4860的生物素标记的羊抗人IL-6抗体；③PE标记亲和素的倍比稀释：取出浓度为0.2mg/mL PE标记亲和素(保存于4℃冰箱)放置于室温，瞬时离心；在取出五个5mL离心管，标记A1-A5，向A1管中加入1×PBS 3984μL，A2-A5管中加入1×PBS 2000μL；取浓度为0.2mg/mL PE标记亲和素16μL于A1管中，混匀后取2000μL于A2管中，类似操作，直到取2000μL于A5管中；A1-A5管中分别含有1:250、1:500、1:1000、1:2000、1:4000的PE标记亲和素，整个过程需避光；④具体实验过程：取出25个流式管，标记为1-25,与正交试验表的1-25试验号相对应；每管均加入做1:10000稀释的IL-6校准品25μL，再加入步骤2.2.1.3确定的偶联有IL-6捕获抗体的微球10000个；再加入一定稀释倍数的生物素标记抗体(按照正交试验表)50μL；再避光震摇孵育一定时间(按照正交试验表)后，再按一定次数(按照正交试验表)用1mL 1×PBS洗涤；再加入一定稀释倍数的PE标记亲和素(按照正交试验表)50μL；再避光震摇孵育一定时间(按照正交试验表)后，再按一定次数(按照正交试验表)用1mL 1×PBS洗涤；500μL 1×PBS重悬微球后上流式细胞仪检测每管的MFI；⑤重复实验：由于在正交试验表中没有设定空白项，因此需做重复试验来计算误差，本实验重复五次。对于IL-6流式微球检测条件优化而言，将出现125个MFI，然后通过SPSS13.0软件对125个MFI进行方差分析，得出IL-6流式微球检测最佳组合；
6)捕获微球单元根据上一步骤所得参数混合反应，将所得样品通过指标检测单元检测出具体参数发送至计算存储单元进行真实度分析存储。所述指标检测单元为流式细胞仪。
作为一种优选方案，步骤2)中所述羧基化微球原液中含有1.25×106个微球。
作为一种优选方案，步骤2)所述羧基化微球原液中含有1.25×104个微球。
作为一种优选方案，步骤2)中所述阴性对照，用于排出微球自带的荧光干扰及证明微球与捕获抗体是否联接成功。
作为一种优选方案，步骤2)中；所述微球洗涤缓冲液为PBS+5％Tween-20；所述微球激活缓冲液为0.1mol/L NaH2PO4，PH 6.2。
相较于现有技术，本发明的有益效果是：
(1)本发明提供了一种自身免疫性心肌炎标志物的联合检测系统，该检测方法将微球和流式分析技术相结合，可以对IL-6、TNF-α、MCP-1等指标进行检查，及时反映自身免疫性心肌炎各阶段病情特征；
(2)该检测方法通过在检测中及时校准反应参数，充分采集不同环境不同时段下的反应条件指标，可以避免系统自身的计算误差，使得检测参数更接近客观事实；
(3)该检测方法中，系统集成多种单元模块，通过各个部分之间的密切配合，显著提高检测精度，避免人为操作带来的系统误差。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，对本发明进行进一步详细说明。
一种自身免疫性心肌炎标志物的联合检测系统，所述系统包括微球制备单元、流式微球检测单元、捕获微球单元、指标检测单元、计算存储单元；所述微球制备单元和计算存储单元数据连接，所述微球制备单元和流式微球检测单元数据连接，所述流式微球检测单元和捕获微球单元数据连接，所述捕获微球单元和指标检测单元数据连接，所述指标检测单元和计算存储单元数据连接；所述微球制备单元包括羧基化荧光编码微球模块、激活羧基化微球模块、抗体联结量修正模块、抗体微球偶联模块。
本实施例所述的自身免疫性心肌炎标志物的联合检测系统的检测方法，所述检测方法具体步骤如下：
1)微球制备单元的羧基化荧光编码微球模块执行微球标记
针对所测标志物的捕获抗体与羧基化荧光编码微球偶联分别与血清中的标志物反应，再加入生物素标记的针对标志物的检测抗体和PE标记的亲和素检测血清中标志物的含量，流式细胞仪检测时每个羧基化荧光编码微球相当于一个细胞，顺次高速通过检测区，其羧基化荧光编码微球本身和PE指示染料的荧光和散射光将被相应的检测系统检测和记录下来，根据FL2和FL3的强度，可把各编码微球分开，而根据FL1的平均强度，可以定量分析血清中的三种标志物的浓度；
2)微球制备单元调动激活羧基化微球模块执行活化操作
所述羧基化微球原液中含有1.25×106个微球；所述羧基化微球原液中含有1.25×104个微球；所述阴性对照，用于排出微球自带的荧光干扰及证明微球与捕获抗体是否联接成功；所述微球洗涤缓冲液为PBS+5％Tween-20；所述微球激活缓冲液为0.1mol/LNaH2PO4，PH 6.2；
将对应羧基化微球原液取出放置于室温，瞬时离心，漩涡振荡2-3分钟，使微球均匀悬浮于溶液中；具体操作为：每组取5个2mL离心管，向各管中分别加入对应羧基化微球原液100μL，再取一管加入羧基化微球原液1μL，用于阴性对照；②上述6管微球14500转/分，离心4分钟，小心弃上清；③每管分别加入100μL的微球洗涤缓冲液，漩涡振荡10秒，超声清洗10秒，14500转/分，离心4分钟，小心弃上清；④上述六管微球分别重悬于80μL微球激活缓冲液，漩涡振荡30秒，超声清洗30秒；⑤用微球激活缓冲液配置新鲜的EDC(1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐,50mg/mL)和Sulfo-NHS(硫化N-羟基琥珀酰亚胺，50mg/mL)，EDC和Sulfo-NHS拆封后，用5次后丢弃；⑥在激活微球(④中加入微球激活缓冲液后，称为激活微球)管内分别加入10μL EDC和Sulfo-NHS，室温避光震摇20分钟；⑦每管分别加入150μL 1×PBS，高速漩涡振荡10秒，14500转/分，离心4分钟，小心弃上清；⑧重悬微球于100μL 1×PBS，漩涡震荡30秒，超声清洗15秒；
3)微球制备单元调动抗体联结量修正模块执行活化最佳联接量的计算
将各组捕获抗体与微球相对应，管用1×PBS调节最终体积大约至500μL，室温避光摇震2小时；14500转/分,离心4分钟，小心弃上清；再加入500μL 1×PBS，14500转/分,离心4分钟，小心弃上清；重悬微球于250μL微球封闭缓冲液中，漩涡振荡15秒，室温避光摇震30分钟；14500转/分,离心4分钟，小心弃上清；加入500μL微球储存缓冲液，14500转/分,离心6分钟，小心弃上清；重悬于200μL微球储存缓冲液；
在取制备好的微球，用血细胞计数板在显微镜下计数，检测微球的浓度。每份微球取约10000个于流式管内，加入浓度25μg/mL的FITC标记羊抗鼠IgG50μL，室温避光摇震120分钟，用洗涤缓冲液洗涤一次，通过流式细胞仪检测FITC荧光强度中位数MFI(medianfluorescence intensity)，制着剂量反应曲线，计算其单克隆抗体加入量；
4)微球制备单元调动抗体微球偶联模块融合抗体
加入经步骤2)选定加入量的单克隆抗体到100μL已激活的微球中，用1×PBS调节最终体积至500μL；室温避光摇震2小时；14500转/分,离心4分钟，小心弃上清；加入500μL1×PBS，14500转/分，离心4分钟，小心弃上清；重悬微球于250μL微球封闭缓冲液中，漩涡振荡15秒，室温避光摇震30分钟；14500转/分,离心4分钟，小心弃上清；加入500μL微球储存缓冲液，14500转/分,离心6分钟，小心弃上清；重悬于200μL微球储存缓冲液。然后用血细胞计数板计算微球的浓度，4℃避光保存备用；
5)流式微球检测单元构建反应参数
通过正交试验优化试验条件调整反应参数具体操作为：①校准品的稀释：由于在摸索条件时加入的校准品保证过量，所以取10ng/mL的校准品；取出IL-6校准品(保存于4℃冰箱)，瞬时离心；再取出1个7mL离心管，标记为S，向S管中加入1×PBS 4999.5μL；取浓度为100μg/mL IL-6校准品0.5μL于S管中，混匀后S管中含有10ng/mL的IL-6校准品；②生物素标记抗体的倍比稀释：取出浓度为0.2mg/mL生物素标记的羊抗人IL-6抗体(保存于4℃冰箱)放置于室温，瞬时离心；在取出五个5mL离心管，标记B1-B5，向B1管中加入1×PBS 2950μL，B2-B5管中加入1×PBS 2000μL；取浓度为0.2mg/mL生物素标记的羊抗人IL-6抗体50μL于B1管中，混匀后取1000μL于B2管中，类似操作，直到取1000μL于B5管中；B1-B5管中分别含有1:60、1:180、1:540、1:1620、1:4860的生物素标记的羊抗人IL-6抗体；③PE标记亲和素的倍比稀释：取出浓度为0.2mg/mL PE标记亲和素(保存于4℃冰箱)放置于室温，瞬时离心；在取出五个5mL离心管，标记A1-A5，向A1管中加入1×PBS 3984μL，A2-A5管中加入1×PBS 2000μL；取浓度为0.2mg/mL PE标记亲和素16μL于A1管中，混匀后取2000μL于A2管中，类似操作，直到取2000μL于A5管中；A1-A5管中分别含有1:250、1:500、1:1000、1:2000、1:4000的PE标记亲和素，整个过程需避光；④具体实验过程：取出25个流式管，标记为1-25,与正交试验表的1-25试验号相对应；每管均加入做1:10000稀释的IL-6校准品25μL，再加入步骤2.2.1.3确定的偶联有IL-6捕获抗体的微球10000个；再加入一定稀释倍数的生物素标记抗体(按照正交试验表)50μL；再避光震摇孵育一定时间(按照正交试验表)后，再按一定次数(按照正交试验表)用1mL 1×PBS洗涤；再加入一定稀释倍数的PE标记亲和素(按照正交试验表)50μL；再避光震摇孵育一定时间(按照正交试验表)后，再按一定次数(按照正交试验表)用1mL 1×PBS洗涤；500μL 1×PBS重悬微球后上流式细胞仪检测每管的MFI；⑤重复实验：由于在正交试验表中没有设定空白项，因此需做重复试验来计算误差，本实验重复五次。对于IL-6流式微球检测条件优化而言，将出现125个MFI，然后通过SPSS13.0软件对125个MFI进行方差分析，得出IL-6流式微球检测最佳组合；
6)捕获微球单元根据上一步骤所得参数混合反应，将所得样品通过指标检测单元检测出具体参数发送至计算存储单元进行真实度分析存储。
指标检测单元通过流式微球联合检测具体操作步骤：
标本的加入:向样品管中加入待测血清25μL；向标准曲线管中依次加入系列稀释的混合校准品25μL；向空白管中加入1×PBS 25μL。
向各管中均加入混合微球25μL，包括空白管。
向各管中均加入1:540稀释的混合的生物素标记的抗体50μL，包括空白管。
充分混合后，室温避光孵育2小时。然后向各管中加入1mL 1×PBS，200*g离心5分钟。小心的移除上清液。重复步骤一次。
向各管中均加入1:1000稀释的PE标记的亲和素50μL，包括空白管。
充分混合后，室温避光孵育1小时。向各管中加入1mL 1×PBS，200*g离心5分钟。小心的移除上清液。
向各管中加入500μL 1×PBS。各管上流式细胞仪检测。
以上所述实施例仅表达了本申请的具体实施方式，应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请技术方案构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本申请的保护范围。

Claims (6)

1.一种自身免疫性心肌炎标志物的联合检测系统，其特征在于，所述系统包括微球制备单元、流式微球检测单元、捕获微球单元、指标检测单元、计算存储单元；所述微球制备单元和计算存储单元数据连接，所述微球制备单元和流式微球检测单元数据连接，所述流式微球检测单元和捕获微球单元数据连接，所述捕获微球单元和指标检测单元数据连接，所述指标检测单元和计算存储单元数据连接；所述微球制备单元包括羧基化荧光编码微球模块、激活羧基化微球模块、抗体联结量修正模块、抗体微球偶联模块。
2.根据权利要求1所述的自身免疫性心肌炎标志物的联合检测方法，其特征在于，所述检测方法具体步骤如下：
1)微球制备单元的羧基化荧光编码微球模块执行微球标记
针对所测标志物的捕获抗体与羧基化荧光编码微球偶联分别与血清中的标志物反应，再加入生物素标记的针对标志物的检测抗体和PE标记的亲和素检测血清中标志物的含量，流式细胞仪检测时每个羧基化荧光编码微球相当于一个细胞，顺次高速通过检测区，其羧基化荧光编码微球本身和PE指示染料的荧光和散射光将被相应的检测系统检测和记录下来，根据FL2和FL3的强度，可把各编码微球分开，而根据FL1的平均强度，可以定量分析血清中的三种标志物的浓度；
2)微球制备单元调动激活羧基化微球模块执行活化操作
将对应羧基化微球原液取出放置于室温，瞬时离心，漩涡振荡2-3分钟，使微球均匀悬浮于溶液中；具体操作为：每组取5个2mL离心管，向各管中分别加入对应羧基化微球原液100μL，再取一管加入羧基化微球原液1μL，用于阴性对照；②上述6管微球14500转/分，离心4分钟，小心弃上清；③每管分别加入100μL的微球洗涤缓冲液，漩涡振荡10秒，超声清洗10秒，14500转/分，离心4分钟，小心弃上清；④上述六管微球分别重悬于80μL微球激活缓冲液，漩涡振荡30秒，超声清洗30秒；⑤用微球激活缓冲液配置新鲜的EDC(1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐,50mg/mL)和Sulfo-NHS(硫化N-羟基琥珀酰亚胺，50mg/mL)，EDC和Sulfo-NHS拆封后，用5次后丢弃；⑥在激活微球(④中加入微球激活缓冲液后，称为激活微球)管内分别加入10μL EDC和Sulfo-NHS，室温避光震摇20分钟；⑦每管分别加入150μL 1×PBS，高速漩涡振荡10秒，14500转/分，离心4分钟，小心弃上清；⑧重悬微球于100μL 1×PBS，漩涡震荡30秒，超声清洗15秒；
3)微球制备单元调动抗体联结量修正模块执行活化最佳联接量的计算
将各组捕获抗体与微球相对应，管用1×PBS调节最终体积大约至500μL，室温避光摇震2小时；14500转/分,离心4分钟，小心弃上清；再加入500μL 1×PBS，14500转/分,离心4分钟，小心弃上清；重悬微球于250μL微球封闭缓冲液中，漩涡振荡15秒，室温避光摇震30分钟；14500转/分,离心4分钟，小心弃上清；加入500μL微球储存缓冲液，14500转/分,离心6分钟，小心弃上清；重悬于200μL微球储存缓冲液；
在取制备好的微球，用血细胞计数板在显微镜下计数，检测微球的浓度。每份微球取约10000个于流式管内，加入浓度25μg/mL的FITC标记羊抗鼠IgG50μL，室温避光摇震120分钟，用洗涤缓冲液洗涤一次，通过流式细胞仪检测FITC荧光强度中位数MFI(medianfluorescence intensity)，制着剂量反应曲线，计算其单克隆抗体加入量；
4)微球制备单元调动抗体微球偶联模块融合抗体
加入经步骤2)选定加入量的单克隆抗体到100μL已激活的微球中，用1×PBS调节最终体积至500μL；室温避光摇震2小时；14500转/分,离心4分钟，小心弃上清；加入500μL1×PBS，14500转/分，离心4分钟，小心弃上清；重悬微球于250μL微球封闭缓冲液中，漩涡振荡15秒，室温避光摇震30分钟；14500转/分,离心4分钟，小心弃上清；加入500μL微球储存缓冲液，14500转/分,离心6分钟，小心弃上清；重悬于200μL微球储存缓冲液。然后用血细胞计数板计算微球的浓度，4℃避光保存备用；
5)流式微球检测单元构建反应参数
通过正交试验优化试验条件调整反应参数具体操作为：①校准品的稀释：由于在摸索条件时加入的校准品保证过量，所以取10ng/mL的校准品；取出IL-6校准品(保存于4℃冰箱)，瞬时离心；再取出1个7mL离心管，标记为S，向S管中加入1×PBS 4999.5μL；取浓度为100μg/mL IL-6校准品0.5μL于S管中，混匀后S管中含有10ng/mL的IL-6校准品；②生物素标记抗体的倍比稀释：取出浓度为0.2mg/mL生物素标记的羊抗人IL-6抗体(保存于4℃冰箱)放置于室温，瞬时离心；在取出五个5mL离心管，标记B1-B5，向B1管中加入1×PBS 2950μL，B2-B5管中加入1×PBS 2000μL；取浓度为0.2mg/mL生物素标记的羊抗人IL-6抗体50μL于B1管中，混匀后取1000μL于B2管中，类似操作，直到取1000μL于B5管中；B1-B5管中分别含有1:60、1:180、1:540、1:1620、1:4860的生物素标记的羊抗人IL-6抗体；③PE标记亲和素的倍比稀释：取出浓度为0.2mg/mL PE标记亲和素(保存于4℃冰箱)放置于室温，瞬时离心；在取出五个5mL离心管，标记A1-A5，向A1管中加入1×PBS 3984μL，A2-A5管中加入1×PBS 2000μL；取浓度为0.2mg/mL PE标记亲和素16μL于A1管中，混匀后取2000μL于A2管中，类似操作，直到取2000μL于A5管中；A1-A5管中分别含有1:250、1:500、1:1000、1:2000、1:4000的PE标记亲和素，整个过程需避光；④具体实验过程：取出25个流式管，标记为1-25,与正交试验表的1-25试验号相对应；每管均加入做1:10000稀释的IL-6校准品25μL，再加入步骤2.2.1.3确定的偶联有IL-6捕获抗体的微球10000个；再加入一定稀释倍数的生物素标记抗体(按照正交试验表)50μL；再避光震摇孵育一定时间(按照正交试验表)后，再按一定次数(按照正交试验表)用1mL 1×PBS洗涤；再加入一定稀释倍数的PE标记亲和素(按照正交试验表)50μL；再避光震摇孵育一定时间(按照正交试验表)后，再按一定次数(按照正交试验表)用1mL 1×PBS洗涤；500μL 1×PBS重悬微球后上流式细胞仪检测每管的MFI；⑤重复实验：由于在正交试验表中没有设定空白项，因此需做重复试验来计算误差，本实验重复五次。对于IL-6流式微球检测条件优化而言，将出现125个MFI，然后通过SPSS13.0软件对125个MFI进行方差分析，得出IL-6流式微球检测最佳组合；
6)捕获微球单元根据上一步骤所得参数混合反应，将所得样品通过指标检测单元检测出具体参数发送至计算存储单元进行真实度分析存储。
3.根据权利要求2所述的一种自身免疫性心肌炎标志物的联合检测方法，其特征在于，步骤2)中所述羧基化微球原液中含有1.25×106个微球。
4.根据权利要求2所述的一种自身免疫性心肌炎标志物的联合检测方法，其特征在于，步骤2)所述羧基化微球原液中含有1.25×104个微球。
5.根据权利要求2所述的一种自身免疫性心肌炎标志物的联合检测方法，其特征在于，步骤2)中所述阴性对照，用于排出微球自带的荧光干扰及证明微球与捕获抗体是否联接成功。
6.根据权利要求2所述的一种自身免疫性心肌炎标志物的联合检测系统，其特征在于，步骤2)中；所述微球洗涤缓冲液为PBS+5％Tween-20；所述微球激活缓冲液为0.1mol/LNaH2PO4，PH 6.2。
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