CN113943784A - 一种特异性识别iyvlvmlvl肽段的荧光pcr引物组及其应用 - Google Patents

一种特异性识别iyvlvmlvl肽段的荧光pcr引物组及其应用 Download PDF

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CN113943784A CN202111470985.0A CN202111470985A CN113943784A CN 113943784 A CN113943784 A CN 113943784A CN 202111470985 A CN202111470985 A CN 202111470985A CN 113943784 A CN113943784 A CN 113943784A
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银霜
周杰
吴海阳
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
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Abstract

本发明属于基因工程技术领域，尤其涉及一种特异性识别IYVLVMLVL肽段的荧光PCR引物组及其应用。本申请的引物组是根据HLAA24分型，EBV病毒抗原肽段IYVLVMLVL的TCR设计的包括位点为L24‑49和/或L24‑2引物对。本申请的引物组能特异性的识别HLAA24分型患者体内EBV病毒抗原肽段IYVLVMLVL的TCR，为追踪监测患者体内TCR‑T细胞药物提供依据。

Description

一种特异性识别IYVLVMLVL肽段的荧光PCR引物组及其应用
本发明要求申请号为202110687266.8，申请日为2021年06月21日，发明名称为“一种特异性识别IYVLVMLVL肽段的荧光PCR引物组及其应用”的中国专利的优选权。
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种特异性识别IYVLVMLVL肽段的荧光PCR引物组及其应用。
背景技术
EBV是可以感染人类的疱疹病毒家族的一员。EBV感染与某些类型的癌症有关。这些因EBV病毒感染所导致的癌症患者有望在TCR-T细胞治疗中获益。
TCR-T细胞治疗是有望治疗实体肿瘤的新一代免疫细胞疗法。在TCR-T细胞治疗的过程中，需要不断监测被输注到病人体内的药用TCR-T细胞的生长和续存的情况。能实现此目的技术手段中，荧光定量PCR(qPCR)是检测灵敏度很高的技术手段。利用qPCR监测TCR-T细胞，需要针对TCR-T细胞的特定TCR基因序列设计qPCR引物。然而现有技术并未发现针对TCR基因序列所设计的qPCR引物组应用于检测TCR-T细胞在病人体内生长和续存状况中。
发明内容
针对现有技术的缺陷，本发明的目的在于提供一种特异灵敏的追踪TCR-T细胞药物的引物组，尤其涉及一种特异性识别IYVLVMLVL肽段的荧光PCR引物组及其应用。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种TCR引物组，包括位点为L24-2和/或L24-49的引物对。
作为优选，所述引物组依据HLAA24分型，EBV病毒抗原肽段IYVLVMLVL的TCR设计。
作为优选，位点为L24-2的TCR引物对的序列如SEQ ID NO.1～2所示；
位点为L24-49的TCR引物对的序列如SEQ ID NO.3～4所示。
作为优选，位点为L24-2的TCR引物对的序列还如SEQ ID NO.6～7所示；
位点为L24-49的TCR引物对的序列还如SEQ ID NO.8～9所示。
本发明还提供了所述的引物组在制备特异性检测HLAA24分型患者体内EBV病毒抗原肽段IYVLVMLVL的TCR产品中的应用。
作为优选，所述产品为试剂盒产品。
作为优选，所述试剂盒为荧光定量PCR试剂盒。
本发明提供了一种特异性识别IYVLVMLVL肽段的荧光PCR引物组及其应用。本申请的引物组是根据HLAA24分型，EBV病毒抗原肽段IYVLVMLVL的TCR设计的。将本申请的引物组制备成荧光定量PCR试剂盒，追踪患者体内TCR-T细胞药物时，能特异的检测到药物的灵敏度为27个拷贝数的基因片段。
附图说明
图1为L24-2位点质粒DNA标准品的扩增曲线(从左到右质粒DNA标准品的稀释度分别为108拷贝、107拷贝、106拷贝、105拷贝、104拷贝、103拷贝、102拷贝、101拷贝的基因片段)。
图2为L24-2位点质粒DNA标准品扩增产物的电泳图(从左到右质粒DNA标准品的稀释度分别108拷贝、107拷贝、106拷贝、105拷贝、104拷贝、103拷贝、102拷贝、101拷贝的基因片段)。
图3为L24-2位点质粒DNA标准品的标准曲线图。
图4为L24-2位点的TCR-T细胞药的基因组DNA的扩增曲线(从左到右，基因组DNA的稀释度分别为原液、10倍稀释、100倍稀释、1000倍稀释、10000倍稀释)。
图5为L24-2位点的TCR-T细胞药的基因组DNA扩增产物的电泳图(从左到右基因组DNA的稀释度分别为原液、10倍稀释、100倍稀释、1000倍稀释、10000倍稀释)。
具体实施方式
在本发明中，所述位点为L24-2的TCR引物对的模板序列如SEQ ID NO.10所示；
所述位点为L24-49的TCR引物对的模板序列如SEQ ID NO.11所示。
本发明实施例中所述的TCR质粒标准品的构建方法为：
(1)将每个位点对应的TCR基因片段克隆至SEQ ID NO.5所示的质粒载体中，得到含有特定TCR基因片段的质粒载体；
(2)将含有特定TCR基因片段的质粒载体在大肠杆菌内扩增，提纯质粒DNA，得到相应位点的TCR质粒标准品。
在本发明实施例中以L24-2位点为例设计方案，其余位点的检测方法与之相同。
在本发明实施例中所述的TCR-T细胞药的基因组DNA为从相应的TCR-T药物细胞中提取的基因组DNA。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1引物设计
根据HLAA24分型，EBV病毒抗原肽段IYVLVMLVL的L24-2和L24-49位点设计得到的TCR引物。得到的引物的序列如SEQ ID NO.1～4和SEQ ID NO.6～9所示。
实施例2标准曲线建立
以TCR的L24-2位点为例设计方案。
取L24-2位点的质粒DNA标准品的108个拷贝数稀释液、107个拷贝数稀释液、106个拷贝数稀释液、105个拷贝数稀释液、104个拷贝数稀释液、103个拷贝数稀释液、102个拷贝数稀释液、101个拷贝数稀释液，按照下述的反应体系和反应程序设置实时荧光PCR。
反应体系：PCR预混液10μl；正向引物0.4μl，引物浓度：10μm/μl；反向引物0.4μl，引物浓度：10μm/μl；ROX Reference Dye(50×)0.2μl；TCR-T细胞药的基因组DNA2μl，浓度50ng/μl，或TCR的质粒标准品DNA2μl；Nuclease-Free Water 7μl；总反应体系共20μl。
PCR反应程序：95℃，30s；(95℃，5s；60℃，20s)40个循环。设置参比荧光为ROX，选择反应类型为SYBR Green Reagents，选择荧光检测通道SYBR，设置在60℃时采集荧光信号。
经实时荧光PCR扩增得到的L24-2位点质粒DNA标准品的扩增曲线如图1所示。
将每个稀释度的质粒DNA标准品的扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图2所示。
以扩增曲线的Ct值为纵坐标，质粒DNA标准品的log以10为底的基因片段拷贝数为横坐标建立标准曲线，标准曲线的结果如图3所示。计算公式为：y＝-3.5555x+41.485(R2＝0.9981)
由于计算公式中的R2≥0.95，则证明本实施例的标准曲线有效。
实施例3灵敏度检测
将针对L24-2位点的TCR-T细胞药的基因组DNA原液、10倍稀释液、100倍稀释液、1000倍稀释液、10000倍稀释液，根据实施例2实时荧光PCR的反应体系和程序进行扩增。得到针对L24-2位点的TCR-T细胞药的基因组DNA的扩增曲线如图4所示。将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图5所示。
将得到的每个稀释度的TCR-T细胞药的基因组DNA的Ct值代到实施例2的标准曲线中，可以计算得到每个稀释度的TCR-T细胞药的基因组DNA的拷贝数。
经过计算，针对L24-2位点的TCR-T细胞药基因组DNA原液的拷贝数为46766个拷贝，10倍稀释液的拷贝数为7998个拷贝、100倍稀释液的拷贝数为873个拷贝、1000倍稀释液的拷贝数为125个拷贝、10000倍稀释液的拷贝数为27个拷贝。由此可以得出，本实施例1得到的引物对于检测L24-2位点的TCR-T细胞药的灵敏度能达到27个拷贝。即，在实际应用中，引物在患者外周血样的基因组DNA中最低可以检测到27个拷贝的TCR基因片段。
将L24-49位点的引物按照本实施例3的灵敏度的检测方法检测相对应位点的TCR-T细胞药，所得到的灵敏度均能达到27个拷贝。
实施例4
按照SEQ ID NO.12所示的质粒载体设置L24-2和L24-49位点对应的TCR基因片段，得到SEQ ID NO.13～14所示的基因片段，所述L24-2位点对应SEQ ID NO.13，L24-49位点对应SEQ ID NO.14。利用这两个位点设计引物来检测相应位点的TCR-T细胞药物，同样能得到实施例1～3所述引物和效果。
由以上实施例可知，本发明提供了一种特异性识别IYVLVMLVL肽段的荧光PCR引物组及其应用。本申请的引物组是根据HLAA24分型，EBV病毒抗原肽段IYVLVMLVL的TCR设计的。将本申请的引物组制备成荧光定量PCR试剂盒，追踪患者体内TCR-T细胞药物时，能特异的检测到27个拷贝数的TCR-T细胞药物。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 重庆天科雅生物科技有限公司
<120> 一种特异性识别IYVLVMLVL肽段的荧光PCR引物组及其应用
<150> 202110687266.8
<151> 2021-06-21
<160> 14
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gccaccacca tgttctggta 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ttgtcactgt cagggtgctc 20
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cacaggcagc agaacatct 19
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
taccagaaca tggtggtggc 20
<210> 5
<211> 7314
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tggtagctct tgatccggca aacaaaccac cgctggtagc ggtggttttt ttgtttgcaa 60
gcagcagatt acgcgcagaa aaaaaggatc tcaagaagat cctttgatct tttctacggg 120
gtctgacgct cagtggaacg aaaactcacg ttaagggatt ttggtcatga gattatcaaa 180
aaggatcttc acctagatcc ttttaaatta aaaatgaagt tttaaatcaa tctaaagtat 240
atatgagtaa acttggtctg acagttacca atgcttaatc agtgaggcac ctatctcagc 300
gatctgtcta tttcgttcat ccatagttgc ctgactcccc gtcgtgtaga taactacgat 360
acgggagggc ttaccatctg gccccagtgc tgcaatgata ccgcgagacc cacgctcacc 420
ggctccagat ttatcagcaa taaaccagcc agccggaagg gccgagcgca gaagtggtcc 480
tgcaacttta tccgcctcca tccagtctat taattgttgc cgggaagcta gagtaagtag 540
ttcgccagtt aatagtttgc gcaacgttgt tgccattgct acaggcatcg tggtgtcacg 600
ctcgtcgttt ggtatggctt cattcagctc cggttcccaa cgatcaaggc gagttacatg 660
atcccccatg ttgtgcaaaa aagcggttag ctccttcggt cctccgatcg ttgtcagaag 720
taagttggcc gcagtgttat cactcatggt tatggcagca ctgcataatt ctcttactgt 780
catgccatcc gtaagatgct tttctgtgac tggtgagtac tcaaccaagt cattctgaga 840
atagtgtatg cggcgaccga gttgctcttg cccggcgtca atacgggata ataccgcgcc 900
acatagcaga actttaaaag tgctcatcat tggaaaacgt tcttcggggc gaaaactctc 960
aaggatctta ccgctgttga gatccagttc gatgtaaccc actcgtgcac ccaactgatc 1020
ttcagcatct tttactttca ccagcgtttc tgggtgagca aaaacaggaa ggcaaaatgc 1080
cgcaaaaaag ggaataaggg cgacacggaa atgttgaata ctcatactct tcctttttca 1140
atattattga agcatttatc agggttattg tctcatgagc ggatacatat ttgaatgtat 1200
ttagaaaaat aaacaaatag gggttccgcg cacatttccc cgaaaagtgc cacctgacgt 1260
ctaagaaacc attattatca tgacattaac ctataaaaat aggcgtatca cgaggccctt 1320
tcgtctcgcg cgtttcggtg atgacggtga aaacctctga cacatgcagc tcccggagac 1380
ggtcacagct tgtctgtaag cggatgccgg gagcagacaa gcccgtcagg gcgcgtcagc 1440
gggtgttggc gggtgtcggg gctggcttaa ctatgcggca tcagagcaga ttgtactgag 1500
agtgcaccat atgcggtgtg aaataccgca cagatgcgta aggagaaaat accgcatcag 1560
gcgccattcg ccattcaggc tgcgcaactg ttgggaaggg cgatcggtgc gggcctcttc 1620
gctattacgc cagctggcga aagggggatg tgctgcaagg cgattaagtt gggtaacgcc 1680
agggttttcc cagtcacgac gttgtaaaac gacggccagt gaattagtac tctagcttaa 1740
gtaacgccat tttgcaaggc atggaaaata cataactgag aatagagaag ttcagatcaa 1800
ggttaggaac agagagacag cagaatatgg gccaaacagg atatctgtgg taagcagttc 1860
ctgccccggc tcagggccaa gaacagttgg aacagcagaa tatgggccaa acaggatatc 1920
tgtggtaagc agttcctgcc ccggctcagg gccaagaaca gatggtcccc agatgcggtc 1980
ccgccctcag cagtttctag agaaccatca gatgtttcca gggtgcccca aggacctgaa 2040
atgaccctgt gccttatttg aactaaccaa tcagttcgct tctcgcttct gttcgcgcgc 2100
ttctgctccc cgagctcaat aaaagagccc acaacccctc actcggcgcg ccagtcctcc 2160
gatagactgc gtcgcccggg tacccgtatt cccaataaag cctcttgctg tttgcatccg 2220
aatcgtggac tcgctgatcc ttgggagggt ctcctcagat tgattgactg cccacctcgg 2280
gggtctttca tttggaggtt ccaccgagat ttggagaccc ctgcccaggg accaccgacc 2340
cccccgccgg gaggtaagct ggccagcggt cgtttcgtgt ctgtctctgt ctttgtgcgt 2400
gtttgtgccg gcatctaatg tttgcgcctg cgtctgtact agttggctaa ctagatctgt 2460
atctggcggt cccgcggaag aactgacgag ttcgtattcc cggccgcagc ccctgggaga 2520
cgtcccagcg gcctcggggg cccgttttgt ggcccattct gtatcagtta acctacccga 2580
gtcggacttt ttggagctcc gccactgtcc gaggggtacg tggctttgtt gggggacgag 2640
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gccgcgcgtc ttgtctgctg cagcatcgtt ctgtgttgtc tctgtctgac tgtgtttctg 2760
tatttgtctg aaaattagct cgacaaagtt aagtaatagt ccctctctcc aagctcactt 2820
acaggcggcc gcgccaccat ggccacaggc agcagaacat ctctgctgct ggccttcgga 2880
ctgctgtgtc tgccttggct gcaagaagcc agcgccagaa aagaggtgga acaggacccc 2940
ggacctttca atgtgcctga aggcgccacc gtggccttca actgcaccta cagcaatagc 3000
gccagccaga gcttcttctg gtacagacag gactgccgga aagaacccaa gctgctgatg 3060
agcgtgtaca gcagcggcaa cgaggacggc agattcacag cccagctgaa cagagccagc 3120
cagtacatca gcctgctgat ccgggatagc aagctgagcg atagcgccac ctacctgtgt 3180
gtcgtgcggg gctacaactt caacaagttc tacttcggca gcggcaccaa gctgaacgtg 3240
aagcctgaca ttcagaatcc cgaacccgcc gtgtaccagc tgaaggaccc taggagccag 3300
gactctaccc tctgcctgtt caccgacttc gacagccaga tcaacgtgcc caagacaatg 3360
gagagcggca ccttcatcac cgacaagacc gtgctggaca tgaaggctat ggacagcaag 3420
agcaacggag ccatcgcttg gagcaaccag accagcttca cttgccagga catcttcaag 3480
gagaccaacg cttgctaccc ctctagcgac gtgccttgcg acgccacact gacagagaag 3540
agcttcgaga ccgacatgaa cctgaacttc cagaacctga gcgtgatggg cctgagaatc 3600
ctgctgctga aggtggccgg attcaacctg ctgatgaccc tgaggctgtg gtcttcccga 3660
gctaaacgag gctcaggcgc gacgaacttt agtttgctga agcaagctgg tgacgttgag 3720
gaaaatccgg gacccatggc cacaggcagc agaacatctc tgctgctggc cttcggactg 3780
ctgtgcctgc cttgtctgca agagggatct gccggtgctg tggtgtctca gcacccttct 3840
tgggtcatct gcaagtccgg caccagcgtg aagatcgagt gcagaagcct ggacttccag 3900
gccaccacca tgttctggta cagacagttc cccaagcaga gcctgatgct gatggccacc 3960
tctaacgagg gcagcaaggc cacatatgag cagggcgtcg agaaggacaa gttcctgatc 4020
aaccacgcca gcctgacact gagcaccctg acagtgacaa gcgcccatcc tgaggacagc 4080
agcttctaca tctgcagcgc cagaggaccc agaatcaccg acagcagcac cgacacacag 4140
tacttcggcc ctggcaccag actgacagtt ctggaggacc tacgtaacgt gacccctccc 4200
aaggtgtccc tgttcgagcc tagcaaggcc gagatcgcca acaagcagaa ggccacactc 4260
gtctgcctgg ctagaggctt cttcccagac cacgtggagc tgtcttggtg ggtgaacggc 4320
aaggaggtgc actcaggagt gtctaccgac cctcaggcct acaaggagag caactacagc 4380
tactgcctgt cctccagact cagggtctgc gccacctttt ggcacaaccc tcggaaccac 4440
ttccgctgtc aggtccagtt ccacggcctg tccgaggaag acaagtggcc agagggctct 4500
cctaagccag tgacacagaa catcagcgcc gaggcttggg gaagagccga ttgcggaatc 4560
accagcgcct cttaccagca gggagtgctg tcagctacca tcctgtacga gatcctgctg 4620
ggcaaggcca cactgtacgc agtgctggtg tccactctgg tcgtgatggc tatggtgaag 4680
cggaagaaca gctaggaatt cgagcatctt accgccattt attcccatat ttgttctgtt 4740
tttcttgatt tgggtataca tttaaatgtt aataaaacaa aatggtgggg caatcattta 4800
cattttatgg gatatgtaat tactagttca ggtgtattgc cacaagacaa acatgttaag 4860
aaactttccc gttatttacg ctctgttcct gttaatcaac ctctggatta caaaatttgt 4920
gaaagattga ctgatattct taactatgtt gctcctttta cgctgtgtgg atatgctgct 4980
ttaatgcctc tgtatcatgc tattgcttcc cgtacggctt tcgttttctc ctccttgtat 5040
aaatcctggt tgctgtctct ttatgaggag ttgtggcccg ttgtccgtca acgtggcgtg 5100
gtgtgctctg tgtttgctga cgcaaccccc actggctggg gcattgccac cacctgtcaa 5160
ctcctttctg ggactttcgc tttccccctc ccgatcgcca cggcagaact catcgccgcc 5220
tgccttgccc gctgctggac aggggctagg ttgctgggca ctgataattc cgtggtgttg 5280
tcggggaagc tgacgtcctt tccatggctg ctcgcctgtg ttgccaactg gatcctgcgc 5340
gggacgtcct tctgctacgt cccttcggct ctcaatccag cggacctccc ttcccgaggc 5400
cttctgccgg ttctgcggcc tctcccgcgt cttcgctttc ggcctccgac gagtcggatc 5460
tccctttggg ccgcctcccc gcctgtttcg cctcggcgtc cggtccgtgt tgcttggtcg 5520
tcacctgtgc agaattgcga accatggatt ccaccgtgaa ctttgtctcc tggcatgcaa 5580
atcgtcaact tggcatgcca agaataattc ggatccaagc ttaggcctgc tcgctttctt 5640
gctgtcccat ttctattaaa ggttcctttg ttccctaagt ccaactacta aactggggga 5700
tattatgaag ggccttgagc atctggattc tgcctagcgc taagcttaac acgagccata 5760
gatagaataa aagattttat ttagtctcca gaaaaagggg ggaatgaaag accccacctg 5820
taggtttggc aagctagctt aagtaacgcc attttgcaag gcatggaaaa tacataactg 5880
agaatagaga agttcagatc aaggttagga acagagagac agcagaatat gggccaaaca 5940
ggatatctgt ggtaagcagt tcctgccccg gctcagggcc aagaacagtt ggaacagcag 6000
aatatgggcc aaacaggata tctgtggtaa gcagttcctg ccccggctca gggccaagaa 6060
cagatggtcc ccagatgcgg tcccgccctc agcagtttct agagaaccat cagatgtttc 6120
cagggtgccc caaggacctg aaatgaccct gtgccttatt tgaactaacc aatcagttcg 6180
cttctcgctt ctgttcgcgc gcttctgctc cccgagctca ataaaagagc ccacaacccc 6240
tcactcggcg cgccagtcct ccgatagact gcgtcgcccg ggtacccgtg ttctcaataa 6300
accctcttgc agttgcatcc gactcgtggt ctcgctgttc cttgggaggg tctcctctga 6360
gtgattgact gcccacctcg ggggtctttc attctcgagc agcttggcgt aatcatggtc 6420
atagctgttt cctgtgtgaa attgttatcc gctcacaatt ccacacaaca tacgagccgg 6480
aagcataaag tgtaaagcct ggggtgccta atgagtgagc taactcacat taattgcgtt 6540
gcgctcactg cccgctttcc agtcgggaaa cctgtcgtgc cagctgcatt aatgaatcgg 6600
ccaacgcgcg gggagaggcg gtttgcgtat tgggcgctct tccgcttcct cgctcactga 6660
ctcgctgcgc tcggtcgttc ggctgcggcg agcggtatca gctcactcaa aggcggtaat 6720
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tctcaataaa ccctcttgca gttgcatccg actcgtggtc tcgctgttcc ttgggagggt 6300
ctcctctgag tgattgactg cccacctcgg gggtctttca ttctcgagca gcttggcgta 6360
atcatggtca tagctgtttc ctgtgtgaaa ttgttatccg ctcacaattc cacacaacat 6420
acgagccgga agcataaagt gtaaagcctg gggtgcctaa tgagtgagct aactcacatt 6480
aattgcgttg cgctcactgc ccgctttcca gtcgggaaac ctgtcgtgcc agctgcatta 6540
atgaatcggc caacgcgcgg ggagaggcgg tttgcgtatt gggcgctctt ccgcttcctc 6600
gctcactgac tcgctgcgct cggtcgttcg gctgcggcga gcggtatcag ctcactcaaa 6660
ggcggtaata cggttatcca cagaatcagg ggataacgca ggaaagaaca tgtgagcaaa 6720
aggccagcaa aaggccagga accgtaaaaa ggccgcgttg ctggcgtttt tccataggct 6780
ccgcccccct gacgagcatc acaaaaatcg acgctcaagt cagaggtggc gaaacccgac 6840
aggactataa agataccagg cgtttccccc tggaagctcc ctcgtgcgct ctcctgttcc 6900
gaccctgccg cttaccggat acctgtccgc ctttctccct tcgggaagcg tggcgctttc 6960
tcatagctca cgctgtaggt atctcagttc ggtgtaggtc gttcgctcca agctgggctg 7020
tgtgcacgaa ccccccgttc agcccgaccg ctgcgcctta tccggtaact atcgtcttga 7080
gtccaacccg gtaagacacg acttatcgcc actggcagca gccactggta acaggattag 7140
cagagcgagg tatgtaggcg gtgctacaga gttcttgaag tggtggccta actacggcta 7200
cactagaaga acagtatttg gtatctgcgc tctgctgaag ccagttacct tcggaaaaag 7260
agt 7263
<210> 14
<211> 7314
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
tggtagctct tgatccggca aacaaaccac cgctggtagc ggtggttttt ttgtttgcaa 60
gcagcagatt acgcgcagaa aaaaaggatc tcaagaagat cctttgatct tttctacggg 120
gtctgacgct cagtggaacg aaaactcacg ttaagggatt ttggtcatga gattatcaaa 180
aaggatcttc acctagatcc ttttaaatta aaaatgaagt tttaaatcaa tctaaagtat 240
atatgagtaa acttggtctg acagttacca atgcttaatc agtgaggcac ctatctcagc 300
gatctgtcta tttcgttcat ccatagttgc ctgactcccc gtcgtgtaga taactacgat 360
acgggagggc ttaccatctg gccccagtgc tgcaatgata ccgcgagacc cacgctcacc 420
ggctccagat ttatcagcaa taaaccagcc agccggaagg gccgagcgca gaagtggtcc 480
tgcaacttta tccgcctcca tccagtctat taattgttgc cgggaagcta gagtaagtag 540
ttcgccagtt aatagtttgc gcaacgttgt tgccattgct acaggcatcg tggtgtcacg 600
ctcgtcgttt ggtatggctt cattcagctc cggttcccaa cgatcaaggc gagttacatg 660
atcccccatg ttgtgcaaaa aagcggttag ctccttcggt cctccgatcg ttgtcagaag 720
taagttggcc gcagtgttat cactcatggt tatggcagca ctgcataatt ctcttactgt 780
catgccatcc gtaagatgct tttctgtgac tggtgagtac tcaaccaagt cattctgaga 840
atagtgtatg cggcgaccga gttgctcttg cccggcgtca atacgggata ataccgcgcc 900
acatagcaga actttaaaag tgctcatcat tggaaaacgt tcttcggggc gaaaactctc 960
aaggatctta ccgctgttga gatccagttc gatgtaaccc actcgtgcac ccaactgatc 1020
ttcagcatct tttactttca ccagcgtttc tgggtgagca aaaacaggaa ggcaaaatgc 1080
cgcaaaaaag ggaataaggg cgacacggaa atgttgaata ctcatactct tcctttttca 1140
atattattga agcatttatc agggttattg tctcatgagc ggatacatat ttgaatgtat 1200
ttagaaaaat aaacaaatag gggttccgcg cacatttccc cgaaaagtgc cacctgacgt 1260
ctaagaaacc attattatca tgacattaac ctataaaaat aggcgtatca cgaggccctt 1320
tcgtctcgcg cgtttcggtg atgacggtga aaacctctga cacatgcagc tcccggagac 1380
ggtcacagct tgtctgtaag cggatgccgg gagcagacaa gcccgtcagg gcgcgtcagc 1440
gggtgttggc gggtgtcggg gctggcttaa ctatgcggca tcagagcaga ttgtactgag 1500
agtgcaccat atgcggtgtg aaataccgca cagatgcgta aggagaaaat accgcatcag 1560
gcgccattcg ccattcaggc tgcgcaactg ttgggaaggg cgatcggtgc gggcctcttc 1620
gctattacgc cagctggcga aagggggatg tgctgcaagg cgattaagtt gggtaacgcc 1680
agggttttcc cagtcacgac gttgtaaaac gacggccagt gaattagtac tctagcttaa 1740
gtaacgccat tttgcaaggc atggaaaata cataactgag aatagagaag ttcagatcaa 1800
ggttaggaac agagagacag cagaatatgg gccaaacagg atatctgtgg taagcagttc 1860
ctgccccggc tcagggccaa gaacagttgg aacagcagaa tatgggccaa acaggatatc 1920
tgtggtaagc agttcctgcc ccggctcagg gccaagaaca gatggtcccc agatgcggtc 1980
ccgccctcag cagtttctag agaaccatca gatgtttcca gggtgcccca aggacctgaa 2040
atgaccctgt gccttatttg aactaaccaa tcagttcgct tctcgcttct gttcgcgcgc 2100
ttctgctccc cgagctcaat aaaagagccc acaacccctc actcggcgcg ccagtcctcc 2160
gatagactgc gtcgcccggg tacccgtatt cccaataaag cctcttgctg tttgcatccg 2220
aatcgtggac tcgctgatcc ttgggagggt ctcctcagat tgattgactg cccacctcgg 2280
gggtctttca tttggaggtt ccaccgagat ttggagaccc ctgcccaggg accaccgacc 2340
cccccgccgg gaggtaagct ggccagcggt cgtttcgtgt ctgtctctgt ctttgtgcgt 2400
gtttgtgccg gcatctaatg tttgcgcctg cgtctgtact agttggctaa ctagatctgt 2460
atctggcggt cccgcggaag aactgacgag ttcgtattcc cggccgcagc ccctgggaga 2520
cgtcccagcg gcctcggggg cccgttttgt ggcccattct gtatcagtta acctacccga 2580
gtcggacttt ttggagctcc gccactgtcc gaggggtacg tggctttgtt gggggacgag 2640
agacagagac acttcccgcc cccgtctgaa tttttgcttt cggttttacg ccgaaaccgc 2700
gccgcgcgtc ttgtctgctg cagcatcgtt ctgtgttgtc tctgtctgac tgtgtttctg 2760
tatttgtctg aaaattagct cgacaaagtt aagtaatagt ccctctctcc aagctcactt 2820
acaggcggcc gcgccaccat ggccacaggc agcagaacat ctctgctgct ggccttcgga 2880
ctgctgtgtc tgccttggct gcaagaagcc agcgccagaa aagaggtgga acaggacccc 2940
ggacctttca atgtgcctga aggcgccacc gtggccttca actgcaccta cagcaatagc 3000
gccagccaga gcttcttctg gtacagacag gactgccgga aagaacccaa gctgctgatg 3060
agcgtgtaca gcagcggcaa cgaggacggc agattcacag cccagctgaa cagagccagc 3120
cagtacatca gcctgctgat ccgggatagc aagctgagcg atagcgccac ctacctgtgt 3180
gtcgtgcggg gctacaactt caacaagttc tacttcggca gcggcaccaa gctgaacgtg 3240
aagcctgaca ttcagaatcc cgaacccgcc gtgtaccagc tgaaggaccc taggagccag 3300
gactctaccc tctgcctgtt caccgacttc gacagccaga tcaacgtgcc caagacaatg 3360
gagagcggca ccttcatcac cgacaagacc gtgctggaca tgaaggctat ggacagcaag 3420
agcaacggag ccatcgcttg gagcaaccag accagcttca cttgccagga catcttcaag 3480
gagaccaacg cttgctaccc ctctagcgac gtgccttgcg acgccacact gacagagaag 3540
agcttcgaga ccgacatgaa cctgaacttc cagaacctga gcgtgatggg cctgagaatc 3600
ctgctgctga aggtggccgg attcaacctg ctgatgaccc tgaggctgtg gtcttcccga 3660
gctaaacgag gctcaggcgc gacgaacttt agtttgctga agcaagctgg ggatgtagag 3720
gaaaatccgg gtcccatggc cacaggcagc agaacatctc tgctgctggc cttcggactg 3780
ctgtgcctgc cttgtctgca agagggatct gccggtgctg tggtgtctca gcacccttct 3840
tgggtcatct gcaagtccgg caccagcgtg aagatcgagt gcagaagcct ggacttccag 3900
gccaccacca tgttctggta cagacagttc cccaagcaga gcctgatgct gatggccacc 3960
tctaacgagg gcagcaaggc cacatatgag cagggcgtcg agaaggacaa gttcctgatc 4020
aaccacgcca gcctgacact gagcaccctg acagtgacaa gcgcccatcc tgaggacagc 4080
agcttctaca tctgcagcgc cagaggaccc agaatcaccg acagcagcac cgacacacag 4140
tacttcggcc ctggcaccag actgacagtt ctggaggacc tacgtaacgt gacccctccc 4200
aaggtgtccc tgttcgagcc tagcaaggcc gagatcgcca acaagcagaa ggccacactc 4260
gtctgcctgg ctagaggctt cttcccagac cacgtggagc tgtcttggtg ggtgaacggc 4320
aaggaggtgc actcaggagt gtctaccgac cctcaggcct acaaggagag caactacagc 4380
tactgcctgt cctccagact cagggtctgc gccacctttt ggcacaaccc tcggaaccac 4440
ttccgctgtc aggtccagtt ccacggcctg tccgaggaag acaagtggcc agagggctct 4500
cctaagccag tgacacagaa catcagcgcc gaggcttggg gaagagccga ttgcggaatc 4560
accagcgcct cttaccagca gggagtgctg tcagctacca tcctgtacga gatcctgctg 4620
ggcaaggcca cactgtacgc agtgctggtg tccactctgg tcgtgatggc tatggtgaag 4680
cggaagaaca gctaggaatt cgagcatctt accgccattt attcccatat ttgttctgtt 4740
tttcttgatt tgggtataca tttaaatgtt aataaaacaa aatggtgggg caatcattta 4800
cattttatgg gatatgtaat tactagttca ggtgtattgc cacaagacaa acatgttaag 4860
aaactttccc gttatttacg ctctgttcct gttaatcaac ctctggatta caaaatttgt 4920
gaaagattga ctgatattct taactatgtt gctcctttta cgctgtgtgg atatgctgct 4980
ttaatgcctc tgtatcatgc tattgcttcc cgtacggctt tcgttttctc ctccttgtat 5040
aaatcctggt tgctgtctct ttatgaggag ttgtggcccg ttgtccgtca acgtggcgtg 5100
gtgtgctctg tgtttgctga cgcaaccccc actggctggg gcattgccac cacctgtcaa 5160
ctcctttctg ggactttcgc tttccccctc ccgatcgcca cggcagaact catcgccgcc 5220
tgccttgccc gctgctggac aggggctagg ttgctgggca ctgataattc cgtggtgttg 5280
tcggggaaat catcgtcctt tccttggctg ctcgcctgtg ttgccaactg gatcctgcgc 5340
gggacgtcct tctgctacgt cccttcggct ctcaatccag cggacctccc ttcccgaggc 5400
cttctgccgg ttctgcggcc tctcccgcgt cttcgctttc ggcctccgac gagtcggatc 5460
tccctttggg ccgcctcccc gcctgtttcg cctcggcgtc cggtccgtgt tgcttggtcg 5520
tcacctgtgc agaattgcga accatggatt ccaccgtgaa ctttgtctcc tggcatgcaa 5580
atcgtcaact tggcatgcca agaataattc ggatccaagc ttaggcctgc tcgctttctt 5640
gctgtcccat ttctattaaa ggttcctttg ttccctaagt ccaactacta aactggggga 5700
tattatgaag ggccttgagc atctggattc tgcctagcgc taagcttaac acgagccata 5760
gatagaataa aagattttat ttagtctcca gaaaaagggg ggaatgaaag accccacctg 5820
taggtttggc aagctagctt aagtaacgcc attttgcaag gcatggaaaa tacataactg 5880
agaatagaga agttcagatc aaggttagga acagagagac agcagaatat gggccaaaca 5940
ggatatctgt ggtaagcagt tcctgccccg gctcagggcc aagaacagtt ggaacagcag 6000
aatatgggcc aaacaggata tctgtggtaa gcagttcctg ccccggctca gggccaagaa 6060
cagatggtcc ccagatgcgg tcccgccctc agcagtttct agagaaccat cagatgtttc 6120
cagggtgccc caaggacctg aaatgaccct gtgccttatt tgaactaacc aatcagttcg 6180
cttctcgctt ctgttcgcgc gcttctgctc cccgagctca ataaaagagc ccacaacccc 6240
tcactcggcg cgccagtcct ccgatagact gcgtcgcccg ggtacccgtg ttctcaataa 6300
accctcttgc agttgcatcc gactcgtggt ctcgctgttc cttgggaggg tctcctctga 6360
gtgattgact gcccacctcg ggggtctttc attctcgagc agcttggcgt aatcatggtc 6420
atagctgttt cctgtgtgaa attgttatcc gctcacaatt ccacacaaca tacgagccgg 6480
aagcataaag tgtaaagcct ggggtgccta atgagtgagc taactcacat taattgcgtt 6540
gcgctcactg cccgctttcc agtcgggaaa cctgtcgtgc cagctgcatt aatgaatcgg 6600
ccaacgcgcg gggagaggcg gtttgcgtat tgggcgctct tccgcttcct cgctcactga 6660
ctcgctgcgc tcggtcgttc ggctgcggcg agcggtatca gctcactcaa aggcggtaat 6720
acggttatcc acagaatcag gggataacgc aggaaagaac atgtgagcaa aaggccagca 6780
aaaggccagg aaccgtaaaa aggccgcgtt gctggcgttt ttccataggc tccgcccccc 6840
tgacgagcat cacaaaaatc gacgctcaag tcagaggtgg cgaaacccga caggactata 6900
aagataccag gcgtttcccc ctggaagctc cctcgtgcgc tctcctgttc cgaccctgcc 6960
gcttaccgga tacctgtccg cctttctccc ttcgggaagc gtggcgcttt ctcatagctc 7020
acgctgtagg tatctcagtt cggtgtaggt cgttcgctcc aagctgggct gtgtgcacga 7080
accccccgtt cagcccgacc gctgcgcctt atccggtaac tatcgtcttg agtccaaccc 7140
ggtaagacac gacttatcgc cactggcagc agccactggt aacaggatta gcagagcgag 7200
gtatgtaggc ggtgctacag agttcttgaa gtggtggcct aactacggct acactagaag 7260
aacagtattt ggtatctgcg ctctgctgaa gccagttacc ttcggaaaaa gagt 7314

Claims (7)

1.一种TCR引物组，其特征在于，包括位点为L24-2和/或L24-49的引物对。
2.根据权利要求1所述的引物组，其特征在于，所述引物组依据HLAA24分型，EBV病毒抗原肽段IYVLVMLVL的TCR设计。
3.根据权利要求1所述的引物组，其特征在于，位点为L24-2的TCR引物对的序列如SEQID NO.1～2所示；
位点为L24-49的TCR引物对的序列如SEQ ID NO.3～4所示。
4.根据权利要求1所述的引物组，其特征在于，位点为L24-2的TCR引物对的序列还如SEQ ID NO.6～7所示；
位点为L24-49的TCR引物对的序列还如SEQ ID NO.8～9所示。
5.权利要求1～4任意一项所述的引物组在制备特异性检测HLAA24分型患者体内EBV病毒抗原肽段IYVLVMLVL的TCR产品中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述产品为试剂盒产品。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述试剂盒为荧光定量PCR试剂盒。
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