CN113943738B - 雄激素受体突变体ARv33及其在前列腺癌药物开发中的应用 - Google Patents

雄激素受体突变体ARv33及其在前列腺癌药物开发中的应用 Download PDF

Info

Publication number
CN113943738B
CN113943738B CN202111149867.XA CN202111149867A CN113943738B CN 113943738 B CN113943738 B CN 113943738B CN 202111149867 A CN202111149867 A CN 202111149867A CN 113943738 B CN113943738 B CN 113943738B
Authority
CN
China
Prior art keywords
arv
androgen receptor
arv33
leu
gly
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202111149867.XA
Other languages
English (en)
Other versions
CN113943738A (zh
Inventor
王荣浩
代荣阳
程波
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Southwest Medical University
Original Assignee
Southwest Medical University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Southwest Medical University filed Critical Southwest Medical University
Priority to CN202111149867.XA priority Critical patent/CN113943738B/zh
Publication of CN113943738A publication Critical patent/CN113943738A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN113943738B publication Critical patent/CN113943738B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/72—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for hormones
    • C07K14/721—Steroid/thyroid hormone superfamily, e.g. GR, EcR, androgen receptor, oestrogen receptor
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1138—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against receptors or cell surface proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407—Specifically defined cancers
    • G01N33/57434—Specifically defined cancers of prostate
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/577—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor involving monoclonal antibodies binding reaction mechanisms characterised by the use of monoclonal antibodies; monoclonal antibodies per se are classified with their corresponding antigens
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/74—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving hormones or other non-cytokine intercellular protein regulatory factors such as growth factors, including receptors to hormones and growth factors
    • G01N33/743—Steroid hormones
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/106—Pharmacogenomics, i.e. genetic variability in individual responses to drugs and drug metabolism
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/136—Screening for pharmacological compounds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/72—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants for hormones
    • G01N2333/723—Steroid/thyroid hormone superfamily, e.g. GR, EcR, androgen receptor, oestrogen receptor
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/52—Predicting or monitoring the response to treatment, e.g. for selection of therapy based on assay results in personalised medicine; Prognosis
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/70—Mechanisms involved in disease identification
    • G01N2800/7023—(Hyper)proliferation
    • G01N2800/7028—Cancer

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)

Abstract

本发明公开了一种雄激素受体突变基因ARv33及其用途，与野生型雄激素受体(AR)基因相比，所述雄激素受体突变基因ARv33具有一个连续重复的第3号外显子；所述雄激素受体突变基因ARv33在(1)或(2)的应用：(1)作为靶点在制备用于预测受试者用药敏感性的检测试剂中的应用，所述用药敏感性为与雄激素受体相关的药物的敏感性；(2)作为靶点在筛选药物中的应用，所述药物为抑制雄激素受体的抗雄药物。

Description

雄激素受体突变体ARv33及其在前列腺癌药物开发中的应用
技术领域
本发明属于动物细胞基因领域，涉及人体变异基因，具体涉及雄激素受体突变基因ARv33及其在前列腺癌药物开发中的应用。
背景技术
前列腺癌是一种常见的男性肿瘤。研究发现雄激素受体(androgen receptor，AR)在原发性和转移性前列腺癌的发展过程中发挥关键作用。雄激素剥夺疗法(ADT)通过减少雄激素生成达到抑制AR信号通路的目的，是临床上治疗前列腺癌的标准疗法。但是，多数患者最终将发展到去势抵抗性前列腺癌(CRPC)阶段。近年来，业界新开发治疗CRPC的抗雄激素受体药物恩杂鲁胺(enzalutamide，Enz)能够更好的阻断雄激素与AR的结合，提高晚期患者生存期。然而，经过一段时间治疗后，患者不可避免会出现Enz耐药，导致治疗失败。研究者提出了几种解释这一现象的机制。但目前仅有AR的一种剪接突变(ARv7)得到确切的临床证据支持。临床研究发现，接受Enz治疗的CRPC患者具有更高的ARv7表达水平，ARv7变异体因为缺少配体结合域导致Enz耐药。但这一理论不足以解释所有CRPC患者Enz耐药现象，因为仅有30％的Enz耐药患者体内出现了ARv7变异，甚至部分ARv7阴性患者也出现了Enz耐药。有一些研究者认为其他类型的AR突变体如AR-F876、ARv9也与Enz耐药的发生有关。不过Enz耐药的完整发生机制还不清楚。
本申请的发明人偶然发现了一种AR的新型突变体，这种突变体的编码基因多出了一个重复的外显子3，故将其命名为ARv33突变体。研究发现其与Enz耐药的发生有关。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的之一在于提供雄激素受体突变基因ARv33。其技术方案如下：
一种雄激素受体突变基因ARv33，其关键在于，与野生型雄激素受体(AR)基因相比，所述雄激素受体突变基因ARv33具有一个连续重复的第3号外显子。
上述ARv33基因的编码序列如SEQ ID NO:1所示。
本发明的目的之二在于提供雄激素受体突变基因ARv33在与前列腺癌相关药物检测中的应用。其技术方案如下：
如上所述的雄激素受体突变基因ARv33在(1)或(2)的应用：(1)作为检测靶点在制备用于预测受试者用药敏感性的检测试剂中的应用，所述用药敏感性为与雄激素受体相关的药物的敏感性；(2)作为靶点在筛选药物中的应用，所述药物为抑制雄激素受体的抗雄药物。
所述(1)的应用中，所述用药敏感性指受试者对恩杂鲁胺(enzalutamide)的敏感性；所述(2)的应用中，所述药物为治疗去势抵抗性前列腺癌的药物。
本发明的目的之三在于提供一种突变型雄激素受体。其技术方案如下：
一种突变型雄激素受体，由如上所述的雄激素受体突变基因ARv33编码。
如上所述的突变型雄激素受体的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
本发明的目的之四在于提供ARv33型雄激素受体的用途。其技术方案如下：
如上所述的突变型雄激素受体在(3)或(4)的应用：(3)作为靶点在制备用于预测受试者用药敏感性的检测试剂中的应用，所述用药敏感性为与雄激素受体相关的药物的敏感性；(4)作为靶点在筛选药物中的应用，所述药物为抑制雄激素受体的抗雄药物。
所述(3)的应用中，所述用药敏感性指受试者对恩杂鲁胺(enzalutamide)的敏感性；所述(4)的应用中，所述药物为治疗去势抵抗性前列腺癌的药物。
本发明的目的之五在于提供特异性靶向雄激素受体突变基因ARv33的mRNA的短发夹RNA(shRNA)或小干扰RNA(siRNA)。其技术方案如下：
一种特异性靶向雄激素受体突变基因ARv33的mRNA的短发夹RNA(shRNA)或小干扰RNA(siRNA)，所述shRNA的靶向核苷酸序列为以下任意一种：ACTCTGGGAGGGAAACAGAAG(SEQID NO:21)；CTGGGAGGGAAACAGAAGTAC(SEQ ID NO:22)；GATGACTCTGGGAGGGAAACA(SEQ IDNO:23)；
所述siRNA的核苷酸序列为5'-CUGGCACAAUAACGUGCUACAUACCC-3'(SEQ ID NO:24)。
本发明的目的之六在于提供特异性靶向雄激素受体突变基因ARv33的mRNA的短发夹RNA(shRNA)或小干扰RNA(siRNA)用途。其技术方案如下：
特异性降低雄激素受体突变基因ARv33表达的短发夹RNA(shRNA)或小干扰RNA(siRNA)在制备治疗恩杂鲁胺耐药型去势抵抗性前列腺癌的药物中的应用。
附图说明
图1为ARv33突变发现过程示意(a)及反向PCR分析初步确认ARv33的存在(b)，以及推测得到的ARv33基因中连续重复的第3外显子序列(c)；
图2为使用巢式PCR反应从EnzR1-C4-2细胞cDNA中扩增DNA产物的结果，其中第一轮反应分别于不同温度进行，结果显示从EnzR1-C4-2细胞cDNA中得到一种特定的DNA产物(367bp)，而作为阴性对照的AR cDNA扩增后未得到这种DNA产物；
图3为使用巢式PCR反应对EnzR1-C4-2细胞进行扩增反应的结果，其中第一轮反应上下游引物以AR的各个外显子为基础设计，第二轮反应的上游引物和下游引物分别以连续重复的两个第3外显子为基础设计；该反应以AR cDNA作为阴性对照；
图4为采用针对ARv2的特异性引物进行PCR反应，检测各种前列腺癌细胞的mRNA的结果，结果显示在EnzR1-C4-2细胞中未检测到ARv2的mRNA的存在；
图5为采用能够特异性检测ARv33的引物对和Taqman探针，以实时荧光定量PCR方法检测多种PCa细胞系中ARv33的mRNA的表达水平，显示了各种PCa细胞系Cq值的差异；
图6为荧光定量PCR检测得出三种PCa细胞中ARv33与ARv7的mRNA表达量之比；
图7为采用RT-PCR检测几种PCa细胞内ARv33的mRNA的结果，显示了不同细胞中ARv33的表达水平；
图8为蛋白质免疫印迹结果，显示以连接肽(SEQ ID NO:25)作为抗原制备的单克隆抗体能够特异性识别ARv33受体；
图9为蛋白质免疫印迹结果，显示ARv33蛋白在EnzR1-C4-2、VCaP和EnzR3-CWR22Rv1细胞中表达；
图10为使用PCR检测人前列腺病理组织样本中ARv33表达的结果，样本中良性前列腺增生5例(B1～B5)，前列腺癌(PCa)11例(C1～C11)；
图11为使用能够特异性靶向两个第3外显子连接区域的三种不同短发夹RNA(shRNA)转染EnzR1-C4-2细胞和EnzR4-C4-2B细胞后，蛋白印迹实验检测ARv33、AR和ARv7基因的表达情况；
图12为使用携载shRNA的慢病毒颗粒感染敲低EnzR1-C4-2细胞和EnzR4-C4-2B细胞中ARv33基因的表达后，不同浓度的Enz对细胞存活率的影响，以空白质粒载体pLKO产生的病毒颗粒作为对照；
图13为蛋白质免疫印迹结果，显示ARv33型雄激素受体比野生型雄激素受体AR具有更强的与ARv7型雄激素受体结合的能力；
图14为不同类型的雄激素受体或雄激素受体复合物对EnzS1-C4-2细胞的Enz敏感性的影响；
图15为不同类型的雄激素受体或雄激素受体复合物对EnzS4-C4-2B细胞的Enz敏感性的影响；
图16为小鼠腹腔注射siAR-v33后对EnzR4-C4-2B肿瘤生长的影响，对照组小鼠腹腔注射siNC；
图17为小鼠腹腔注射siAR-v33或siNC后，EnzR4-C4-2B肿瘤组织中Ki67表达情况；
图18为蛋白印迹结果，显示注射siAR-v33后，小鼠EnzS4-C4-2B肿瘤组织中AR-v33的表达情况。
具体实施方式
以下结合实施例和附图对本发明作进一步说明。
在本文中所使用的表达方式“编码ARv33突变体的核酸”，是指与编码ARv33突变体的基因相对应的核酸物质，即核酸的类型不受特别限制，可以是任何包含与ARv33突变体的编码基因相对应的脱氧核糖核苷酸和/或核糖核苷酸的聚合物，包括但不限于DNA、RNA或cDNA。
对于本发明说明书和权利要求书中所提及的核酸，本领域技术人员应当理解，实际包括互补双链的任意一条，或者两条。在本说明书和权利要求书中，虽然多数情况下只给出了一条链，但本领域技术人员还可以理解，利用一条链可以检测另一条链，反之亦然，也就是说，公开一条链实际上也意味着公开了与之互补的另一条链。例如，提及SEQ ID NO：1，实际包括其互补序列。
本申请中的基因序列包括DNA形式或RNA形式，公开其中一种，意味着另一种也被公开。例如提及ARv33基因的cDNA序列，实际也包括相应的RNA序列。
(一)实验材料和方法
1.1细胞培养
LNCaP、Du145、EnzS1-C4-2、EnzR1-C4-2、EnzS4-C4-2B、EnzR4-C4-2B、EnzR3-CWR22Rv1和PC3细胞使用添加有10％胎牛血清(FBS)、100单位/mL青霉素和100μg/mL链霉素的RPMI1640培养基培养。VCaP细胞使用含10％FBS、1.5g/L NaHCO3、100单位/mL青霉素、100μg/mL链霉素的DMEM培养基培养。293T细胞用10％DMEM培养基培养。细胞培养在37℃、含5％CO2的细胞培养箱中。瞬时转染实验，使用Lipofectamine 3000试剂(Invitrogen，GrandIsland，NY)。
1.2恩杂鲁胺耐药细胞的诱导培养
耐药细胞EnzR1-C4-2由EnzS1-C4-2细胞经过10μM、20μM、40μM恩杂鲁胺各处理2个月获得，6个月后，EnzR1-C4-2保持在10μM恩杂鲁胺条件下培养。EnzR4-C4-2B细胞由加州大学戴维斯分校Allen Gao博士赠送。
LNCaP、EnzS1-C4-2、EnzS4-C4-2B、EnzR3-CWR22Rv1、293T、DU145细胞均购买于美国模式培养物集存库(ATCC)。
1.3 RNA提取与qRT-PCR测定
使用Trizol试剂(Invitrogen)分离总RNA，取1μg总RNA，使用Superscript III转录酶(Invitrogen)进行逆转录，得到cDNA模板。使用Bio-Rad CFX96实时荧光定量PCR系统进行qRT-PCR实验，荧光染料为SYBR green，以确定目标基因的mRNA表达水平。
使用特异性的Taqman探针检测ARv33和ARv7的表达，以GAPDH的mRNA水平作为内参。
1.4 ARv33特异性抗体的制备
ARv33的特异性抗体委托北京ABACE生物公司生产。连接肽AGMETTLGGKQKYLCA(SEQID NO:25)用作免疫抗原，并以寡肽1CKVFFKRAAEGKQKYLCA(SEQ ID NO:26)和寡肽2AGMETTLGARKLKKLGN(SEQ ID NO:27)作为阴性对照产生单克隆抗体。
1.5蛋白质免疫印迹(WB/IB)
细胞用预冷的裂解缓冲液(20mmol/L Tris-HCl/pH 7.5、150mmol/L NaCl、1mmol/L EDTA、1mmol/L EGTA、1％Triton X-100、2.5mmol/L焦磷酸钠、1mmol/Lβ-甘油磷酸酯、1mmol/L Na3VO4和1mM苯甲基磺酰氟)裂解，超声破碎细胞，离心后，测定蛋白浓度，取20μg的蛋白质上样到8％变性SDS-PAGE凝胶上进行电泳。用一抗在4℃下孵育过夜，然后在室温下用相应的二抗孵育1小时。其中部分抗体AR(N20，Santa Cruz，Dallas，Texas)，GAPDH(8C2，Santa Cruz，Dallas，Texas)，AR-v7(AG10008，Precision Antibody，Columbia，MD)均外购，ARv33抗体委托北京安必奇生物科技有限公司制备。
对于肿瘤组织样本，取1mg组织加入预冷的裂解缓冲液，经过组织捣碎机捣碎后，超声破碎，离心后测蛋白浓度，取20μg蛋白进行蛋白印迹实验。
1.6基于MTT方法检测细胞对Enz的敏感性
在用短发夹RNA(shRNA)或cDNA处理目的基因后，将1×104个细胞加入24孔板中培养。细胞用不同浓度的恩杂鲁胺处理6天，使用MTT试剂(Sigma)进行细胞数计数，以原始加入的细胞数为标准计算每组细胞数目。
1.7体内异种移植小鼠模型的建立以及检测
将1×106个EnzR4-C4-2B细胞与Matrigel以1:1的体积比注射到6周龄裸鼠皮下。肿瘤生长到适当大小后，用阴性对照siNC(8mg/kg)或siARv33(8mg/kg)处理4周。按照文献(Wang R,Sun Y,Li L,et al.Preclinical Study using Malat1 Small Interfering RNAor Androgen Receptor Splicing Variant 7Degradation Enhancer
Figure BDA0003286582100000051
toSuppress Enzalutamide-resistant Prostate Cancer Progression.Eur Urol.2017Nov；72(5):835-844.)描述方法，使用Invivofectamine 2.0试剂盒(#1377501，Invitrogen)导入siRNA。恩杂鲁胺(30mg/kg)用玉米油稀释后，注入小鼠腹腔。每周测量肿瘤大小，然后处死并取出肿瘤进行免疫组织化学(IHC)染色和蛋白质印迹分析。
1.8免疫组织化学(IHC)染色
经脱蜡和水化处理的组织切片在室温下用过氧化物酶封闭缓冲液预处理20分钟。通过将切片在柠檬酸盐缓冲液(pH 6.0)中煮沸30分钟来进行抗原修复。在室温下用封闭缓冲液(含有5％山羊血清的PBS)预孵育1小时后，与Ki-67在4℃下孵育过夜。然后再加入生物素标记的二抗孵育30分钟，然后加入链霉亲和素(PK-4000，Vectastain，Burlingame，CA)孵育30分钟，通过DAB(SK-4100，Vectastain，Burlingame，CA)显色。
1.9统计处理
所有测得值均以平均值±方差表示，不同组之间的比较均采用t检验或单因素方差分析结合t检验进行。
(二)实施例
实施例1ARv33突变的发现和鉴定
如图1，发明人在筛选EnzR1-C4-2细胞中雄激素受体相关cirRNA时，偶然发现在经核糖核酸酶R(RNase R)消化处理后“AR-circRNA2(ARC2)”消失了，说明这一“ARC2”并非环状RNA，而是线性RNA。因为用于“ARC2”扩增的引物是基于雄激素受体第3外显子设计的反向引物，故推测这一未探明的RNA产物是一种含有额外重复的第3外显子的AR突变，因此命名为ARv33。
反向引物R1为：GGCGCACAGGTACTTCTGTTTCC(SEQ ID NO:28)；
反向引物F1为：TGAAGCAGGGATGACTCTGGGAG(SEQ ID NO:29)。
2.1EnzR1-C4-2细胞的巢式PCR分析
实验方法：实验方法如1.3部分所述。实验组分别使用EnzR1-C4-2细胞和EnzR3-CWR22Rv1细胞提取总RNA后进行逆转录，获得cDNA，分别记作EnzR1-C4-2 cDNA和EnzR3-CWR22Rv1 cDNA，进行后续巢式PCR反应；对照组使用野生型AR作为模板，进行巢式PCR分析。巢式PCR反应使用两对(F1+R1，F2+R2)引物扩增完整的片段，第二对引物称为巢式引物，它以第一次PCR产物为模板并结合在第一次PCR产物内部，扩增出来的第二次PCR扩增片段短于第一次扩增片段。反应条件为：95℃，5mins；95℃30s，60℃10s，72℃30s，35cycles；72℃，2mins。
巢式PCR的引物分别为：
第一轮上游引物F1序列：GGGATGACTCTGGGAGGGAAACAG(SEQ ID NO:3)；下游引物R1序列：TGGTCGTCCACGTGTAAGTTGC(SEQ ID NO:4)；
第二轮上游引物F2序列：GGAGGGAAACAGAAGTACCTGTGCG(SEQ ID NO:5)；下游引物R2序列：GCTGTCTCTCTCCCAGTTCATTGAGG(SEQ ID NO:6)。
第一个循环时，于不同梯度温度进行退火，Tm温度分别为60℃、61.4℃、63.3℃、65.5℃、68.8℃、71.3℃，多次重复PCR反应过程。
最后进行序列分析。
实验结果：如图1，EnzR1-C4-2细胞的巢式PCR产物序列分析证实，AR转录本确实存在重复的第3外显子。
如图2，使用退火时连接到两个外显子3连接处的引物进行巢式PCR反应，能够从EnzR1-C4-2细胞cDNA(AR cDNA作为阴性对照)中扩增出一种特定的DNA产物(367bp)。然而，当第一轮反应的退火温度高于60℃时，不能得到上述特定的DNA产物，说明第二轮的PCR产物源于第一轮的PCR模板，间接证明两个外显子3的存在。测序，分析证实这种特定的DNA产物是AR的第3外显子，表明第3外显子重复的现象存在于EnzR1-C4-2细胞中。
2.2巢式PCR分析进一步确认ARv33突变体的分子结构
实验方法：实验方法如1.3部分所述。实验组分别提取EnzR1-C4-2细胞总RNA，阴性对照组使用AR cDNA。
根据野生型AR mRNA序列，结合推测得到的ARv33突变体序列，设计多组引物对扩增得到对应不同外显子的多个AR mRNA片段，如图3所示。
第一轮PCR扩增使用的各组引物对的上游引物以AR的第2外显子为基础设计，其序列为：
5 UTR F：GTAGGTGGAAGATTCAGCCAAGCTCA(SEQ ID NO:30)；
Exon 1F：GTCAAAAGCGAAATGGGCCCCTG(SEQ ID NO:31)；
Exon 2F：GGAGATGAAGCTTCTGGGTGTCAC(SEQ ID NO:7)；
下游引物以AR的第4～8外显子为基础设计，其序列分别为：
Exon 4R：GCCTCTCCTTCCTCCTGTAGTT(SEQ ID NO:8)；
Exon 5R：GTCCACGTGTAAGTTGCGGAAGC(SEQ ID NO:9)；
Exon 6R：TCGGACACACTGGCTGTACATCC(SEQ ID NO:10)；
Exon 7R：GCGTCTTGAGCAGGATGTGGGAT(SEQ ID NO:11)；
Exon 8R：GAACTGATGCAGCTCTCTCGCAAT(SEQ ID NO:12)；
3UTR R:GGGTGGGGAAATAGGGTTTCCA(SEQ ID NO:32)；
接着，将第一轮产物稀释100倍，以另一组引物对进行第二轮PCR扩增，以检测重复的第3外显子。第二轮所用引物为ARv33特异性引物，其序列分别为：
上游引物ARv33-forward：GTGCGCCAGCAGAAATGATTG(SEQ ID NO:13)；
下游引物ARv33-reverse：TCCGAAGACGACAAGATGGA(SEQ ID NO:14)。
最后进行序列分析。
实验结果：如图3所示，第一轮PCR产物经过稀释100倍后，经过第二轮PCR扩增中后，Cq值均在16-20之间，说明这些AR片段均含有重复的第3外显子，测序进一步证实。而作为阴性对照，AR cDNA经过两轮PCR后，其Cq在40左右。，结果表明新的AR突变体ARv33的转录本除包含有完整的AR mRNA片段，还含有额外重复的第3外显子。
2.3排除AR突变体中重复的第3外显子来源于ARv2的可能性
早期研究报道，由于基因重组，EnzR3-CWR22Rv1细胞的完整AR和ARv2基因也含有重复的第3外显子(Lu C,Luo J.Decoding the androgen receptor splicevariants.Transl Androl Urol.2013；2(3):178-186.)。ARv2是一种AR突变类型，也含有重复的第3外显子，但没有完整的第4～8外显子。为排除本研究发现的ARv33是因为细胞污染的可能性，设计了针对ARv2的特异性引物来检测所培养的细胞系。
实验方法：采用如1.3部分描述方法提取EnzR3-CWR22Rv1细胞的mRNA进行RT-PCR检测。所使用的针对ARv2的特异性引物为：
上游引物：TGTCACTATGGAGCTCTCACATGTGG(SEQ ID NO:19)；
下游引物：CACCTCTCAAATATGCTAGACGAATCTGT(SEQ ID NO:20)。
实验结果：如图4，实验结果显示，EnzR3-CWR22Rv1细胞中未检测到ARv2 mRNA的存在。这一结果说明，EnzR3-CWR22Rv1细胞中发现的ARv33突变体是源于长期的Enz处理，而非细胞污染。
实施例2靶向AR重复第3外显子的特异性Taqman探针检测ARv33突变
2.4人前列腺癌细胞系ARv33的表达水平
2.4.1荧光定量PCR(qPCR)方法检测mRNA表达水平
首先，使用如2.2部分所描述的能够特异性检测ARv33的引物对，并设计能够特异性检测ARv33的两个重复的第3外显子的Taqman探针，采用实时荧光定量PCR(qPCR)方法检测ARv33的mRNA在多种PCa细胞系中的表达水平，这些PCa细胞系包括：Du145，LNcap，EnzS1-C4-2，EnzR1-C4-2，EnzR4-C4-2B，VCap，EnzR3-CWR22Rv1。同时，以另一种引起前列腺癌细胞Enz耐药性的AR突变——ARv7的mRNA表达水平作为参照。
用于扩增ARv33引物对的序列为：
上游引物ARv33-forward：GTGCGCCAGCAGAAATGATTG(SEQ ID NO:13)；
下游引物ARv33-reverse：TCCGAAGACGACAAGATGGA (SEQ ID NO:14)；
Taqman探针(SEQ ID NO:15)：
5’-(FAM)GGATGACTCTGGGAGGGAAACAGAAGT(MGB)-3’，其中5’端为荧光报告基团FAM，3’端为荧光淬灭基团MGB。
用于扩增ARv7引物对的序列为：
上游引物：CCATCTTGTCGTCTTCGGAAATGTTA (SEQ ID NO:16)；
下游引物：TTTGAATGAGGCAAGTCAGCCTTTCT(SEQ ID NO:17)；
Taqman探针(SEQ ID NO:18)：
5’-(FAM)TTCCGGGTTGGCAATTGCAAGCATCTCA(MGB)-3’，其中5’端为荧光报告基团FAM，3’端为荧光淬灭基团MGB。
实验方法：实验方法参照1.3部分。使用2×Taqman PCR MasterMix试剂盒(北京索莱宝科技有限公司)进行PCR反应。该试剂盒含有常温下完全封闭Taq酶活性的化学修饰法热启动HS Taq DNA Polymerase，以及qPCR专用缓冲液。本领域人员应当认识到，使用其他常用的商业化RT-PCR试剂盒也可以完成本实验。仪器平台为LightCycler 480II(Roche)。
具体步骤如下：
(1)提取细胞总RNA，逆转录得到cDNA模板，稀释10倍后取1μL进行PCR反应；
(2)配置PCR反应体系，以15μL反应体系计，组成如下：
2XTaqman MasterMix 7.5μL
上游引物ARv33-forward(10μM) 1μL
下游引物ARv33-reverse(10μM) 1μL
Taqman探针(3μM) 1μL
cDNA 1μL
ddH2O 补足至15μL
(3)PCR反应过程为：
①热启动：95℃，5min，单个循环；
②变性：95℃，10s；
③退火：60℃，10s；
④延伸：72℃，30s；
重复步骤②～④，共40个循环。
(4)数据处理与分析。
当用于待测样品中ARv33的检测时，还可以预先在试剂盒中置入ARv33基因的cDNA内标，该内标的PCR反应结果作为待测样品的PCR结果的对照。
实验结果：如图5所示，在被检测的几种细胞中，EnzR3-CWR22Rv1细胞的ARv33的mRNA表达水平最高，EnzR1-C4-2细胞的ARv33的mRNA表达水平次之，其余细胞中ARv33的mRNA表达水平较低。
如图6，在EnzR1-C4-2细胞中，ARv33与ARv7的mRNA表达量之比为1:6.9；在EnzR4-C4-2B细胞中，ARv33与ARv7的mRNA表达量之比为1:35.7。
如图7，RT-PCR结果显示，EnzR3-CWR22Rv1、VCap、EnzR1-C4-2表达丰富的ARv33mRNA，Du145和LNcap基本不表达ARv33 mRNA，EnzS1-C4-2表达微量ARv33 mRNA。
2.4.2蛋白质表达水平
实验方法：ARv33基因由于含有重复的第3外显子，因此其表达的蛋白质序列(SEQID NO:2)必然存在对应于重复的两个第3外显子的片段，故首先针对该重复的第3外显子连接处片段(前一个第3外显子3’端与后一个第3外显子5’端连接处)设计了单克隆抗体。如1.4部分所述，单克隆抗体采用杂交瘤技术制备，以连接肽(SEQ ID NO:25)作为免疫原，以与该连接肽部分序列相同的寡肽1(SEQ ID NO:26)和寡肽2(SEQ ID NO:27)作为阴性对照。
虽然ARv2突变体也含有重复的第3外显子序列，其突变受体也能够与该单克隆抗体相结合，但由于ARv2突变体缺少完整的第4～8外显子，因此ARv2型雄激素受体的分子量为81KD，远小于ARv33型雄激素受体的分子量121kD，二者易于区分。
单克隆抗体特异性通过蛋白质免疫印迹法确认，实验过程参照1.5部分。
首先取携载野生型wtAR(购买于Addgene)或ARv33(以wtAR为模板，通过插入突变法在wtAR中插入一个外显子3)目的基因的质粒，通过CaCl2转染法转染到6cm培养皿中293T细胞，实验在1.5mL eppendorf管中进行：将2μg质粒溶于180μL水中，混匀，加入20μL 2.5MCaCl2于底部，再缓慢加入200μL 2XHBS(280mM NaCl,10mM KCl,1.5mM Na2HPO4,50mMHEPES,12mM Glucose),反复吹气泡10次。接着通过前述单克隆抗体检测多种PCa细胞系中ARv33的蛋白表达水平，这些PCa细胞系包括：Du145，LNcap，EnzS1-C4-2，EnzR1-C4-2，VCap，EnzR3-CWR22Rv1。
实验结果：如图8所示，以连接肽(SEQ ID NO:25)制备的单克隆抗体能够特异性地识别ARv33受体。
如图9，蛋白质免疫印迹结果显示，ARv33蛋白在EnzR3-CWR22Rv1细胞中大量表达，在EnzR1-C4-2细胞中可以检测到ARv33蛋白的表达。这一结果与由RT-PCR实验测得的ARv33突变基因mRNA表达水平一致。
2.5人前列腺组织样本中ARv33的表达水平
样本收集：在2014-2019年期间，收集美国罗切斯特大学医学院穿刺获取的人前列腺病理组织样本16例，所有患者Gleason评分>7，病理结果显示其中良性前列腺增生(BPH)5例，分别编号为B1～B5，前列腺癌(PCa)11例，分别编号为C1～C11。所有患者均知情同意。
实验方法：组织样本经破碎后提取总RNA。采用荧光定量PCR(qPCR)方法分析ARv33的mRNA表达水平，实验过程参照2.4.1部分。
实验结果：如图10所示，良性前列腺增生病理组织样本中均未检测到ARv33，而11例前列腺癌病理组织样本中有3例(编号分别为C4、C7、C10)检测到ARv33，表明晚期前列腺癌组织中可能出现ARv33的突变。
上述研究表明，ARv33基因是一种新的AR基因突变体，其与野生型AR基因相比，多出了一个重复的第3外显子。根据序列分析结合野生型AR基因的序列，得到ARv33基因的编码序列(CDS)如SEQ ID NO:1所示。
采用本发明设计的ARv33特异性引物以及Taqman探针，通过qPCR方法能够准确检测细胞样本或组织样本中ARv33的mRNA表达水平。
实施例3 ARv33突变与Enz耐药性
2.6靶向ARv33基因对CRPC细胞的Enz敏感性影响的体外实验
为研究ARv33的表达对CRPC细胞耐药性的影响，设计了三种不同的ARv33特异性短发夹RNA(shRNA)来敲低ARv33基因的表达。如图11所示，这三种特异性shRNA仅靶向两个第3外显子的连接区域。研究敲低ARv33基因对CRPC细胞的Enz敏感性和细胞生长的影响。
实验方法：
首先，以PLKO(购买于Addgene)为模板，构建三种shRNA，分别记为ARv33-shRNA#1、ARv33-shRNA#2、ARv33-shRNA#3，其靶向序列分别为：
ARv33-shRNA#1：ACTCTGGGAGGGAAACAGAAG(SEQ ID NO:21)；
ARv33-shRNA#2：CTGGGAGGGAAACAGAAGTAC(SEQ ID NO:22)；
ARv33-shRNA#3：GATGACTCTGGGAGGGAAACA(SEQ ID NO:23)。
构建shRNA的方法为：将含有靶向序列的多聚核苷酸(安徽通用生物有限公司合成)进行退火，其中20mM正向引物1μL,20mM反向引物1μL，10XT4链接酶缓冲液1μL，10mM ATP1μL，T4 PNK 0.5μL，补水到10μL，37℃反应30分钟，95℃反应5分钟,然后慢慢降温至常温使正反向多聚核苷酸结合，最后通过T4连接酶连接到pLKO载体上(经过EcoR I和Age I双酶切处理)。将pLKO，ARv33-shRNA#1，ARv33-shRNA#2，ARv33-shRNA#3分别与慢病毒包装质粒psPAX2(购买于Addgene)、pMD2.G(购买于Addgene)一起通过CaCl2转染法转染到10cm培养皿中的293T细胞株中制备病毒，体系为：慢病毒载体20μg，包装载体psPAX2和pMD2.G各10μg，补水到450μl，50μl 2.5M CaCl2，500μL 2XHBS。
细胞转染48小时后，收取病毒上清，用0.45μm大小的滤器过滤，取1ml病毒液跟1ml新鲜培养基混匀后感染EnzR1-C4-2和EnzR4-C4-2B细胞，感染细胞时加入8μg/ml的polybrene来增强感染效果。携载shRNA慢病毒的实验组分别记为ShARv33#1组、ShARv33#2组、ShARv33#3组，转染空白pLKO质粒的空白对照组记为pLKO组。
参照1.5部分所描述的方法，通过蛋白质免疫印迹(IB/WB)分别检测细胞中ARv33、AR和AR7的蛋白质表达水平。
参照1.6部分所描述的方法，将转染后的细胞培养于添加有不同浓度Enz的培养基中，通过细胞计数检测细胞生长情况。
实验结果：如图11所示，三种shRNA都能降低ARv33型雄激素受体(121kD)的表达，但AR型雄激素受体(110kD)和AR7型雄激素受体(75kD)的表达不受影响。
同时发现，使用ARv33-shRNA#2敲低细胞ARv33表达后，提高了细胞对Enz的药物敏感性，细胞生长受到Enz抑制。对于EnzR1-C4-2细胞，如图12，在10μM Enz作用6天后，转染空白质粒的对照组(pLKO)细胞数量降低了23.5％，而经ARv33-shRNA#2敲低处理的细胞数量降低了46.7％。对于EnzR4-C4-2B细胞，在20μM Enz作用6天后，转染空白质粒的对照组细胞数量降低了19.7％，而经ARv33-shRNA#2敲低处理的细胞数量降低了40.1％。
这一研究表明，前列腺癌细胞系中ARv33型雄激素受体的表达与细胞对Enz的耐药性有关。
2.7 ARv33与ARv7相互作用提高CRPC细胞对Enz的耐药性
近期有研究证明(Cato L.,de Tribolet-Hardy J.,Lee I.,et al.ARv7Represses Tumor-Suppressor Genes in Castration-Resistant ProstateCancer.Cancer Cell.2019Mar 18；35(3):401–413.e6.)，ARv7与野生型AR的相互作用能够更好地诱导Enz耐药性。受此启发，本研究考察ARv7是否也能与ARv33相互作用以诱导CRPC细胞对Enz的耐药性。
实验方法：分别将PWPI-Flag-AR、PWPI-Flag-ARv33和PWPI-AR-v7通过CaCl2转染法转染到6cm培养皿的293T细胞中，体系为：PWPI-Flag-AR或者PWPI-Flag-ARv33 2μg，PWPI-AR-v7 4μg，补水到180μL，20μl 2.5M CaCl2，200μL 2XHBS。24小时候后，超声破碎细胞，用Anti-Flag抗体跟蛋白裂解液在4℃孵育2小时，然后采用protein A/G磁珠将蛋白复合物调取出来，煮沸进行WB检测。
同时，制备带有Flag-AR、AR-v33和AR-v7的慢病毒，方法同制备shAR33慢病毒，48小时候后，将病毒感染EnzS1-C4-2和EnzS4-C4-2B细胞。待细胞感染ARv33/ARv7和AR/ARv7后，取5000个细胞于24孔培养皿中，加入含10μL恩杂鲁胺的培养基进行培养，分别在第0d、2d、4d和6d，通过MTT细胞计数检测细胞生长情况，细胞数目分别与DMSO处理组相比较，以计算细胞对Enz的药物敏感性。
实验结果：如图13所示，蛋白免疫印迹检测结果表明，ARv33型雄激素受体跟野生型AR相比，前者与ARv7型雄激素受体的结合能力更强。
如图14所示，培养第6天时，在EnzS1-C4-2细胞中，ARv33/ARv7复合物能够诱导更高的Enz耐药性，细胞对Enz的敏感性为27.2％，该敏感性数据低于单独的ARv33组(对Enz的敏感性为44.9％)或单独的ARv7组(对Enz的敏感性为40.2％)。
如图15所示，当用EnzS4-C4-2B细胞进行实验时，也获得了类似的结果，即ARv33/ARv7复合物组细胞对Enz的敏感性为17.3％，而单独的ARv33组细胞对Enz的敏感性为41.5％，单独的ARv7组细胞对Enz的敏感性为26.2％。
这一研究结果证实，ARv33突变型雄激素受体与ARv7突变型雄激素受体相互作用提高了CRPC细胞对Enz的耐药性。
2.8靶向ARv33对CRPC细胞Enz耐药性的动物实验
体外研究发现使用shRNA敲低ARv33基因表达对EnzR4-C4-2B和EnzR1-C4-2细胞生长具有明显抑制作用。在体外研究基础上，以小鼠模型研究靶向ARv33基因表达对CRPC肿瘤生长的影响。
实验方法：购买敲低ARv33基因表达的体内小干扰RNA，命名为ARv33-siRNA(购买于Thermofisher)，其正义链序列为5'-CUGGCACAAUAACGUGCUACAUACCC-3'，反义链为5'-GGGUAUGUAGCACGUUAUUGUGCCAGAU-3'。同时，以siNC(购买于Thermofisher)作为ARv33-siRNA的阴性对照。
参照1.7部分的描述，将EnzR4-C4-2B细胞植入SCID小鼠皮下以建立耐药肿瘤体内模型。四周后，将ARv33-siRNA以8mg/kg浓度注入小鼠腹腔，并检测敲低ARv33是否可以提高Enz疗效，抑制耐Enz的肿瘤生长。小鼠分为两组，每组6只，其中实验组给予Enz+ARv33-siRNA，对照组给予Enz+siNC，给药频次为Enz隔天一次，siRNA每两周一次，持续给药1个月。在干预的同时，每周监测肿瘤生长情况。
为确认ARv33-siRNA是否成功到达肿瘤部位，处死小鼠后，提取肿瘤组织蛋白，通过蛋白质免疫印迹检测ARv33的蛋白表达。
参照1.8部分的描述，肿瘤组织行免疫组织化学(IHC)染色，观察细胞增殖标志物Ki67的表达情况。
实验结果：如图16，与给予Enz+siNC(购买于Thermofisher)的对照组比较，给予Enz+ARv33-siRNA的实验组肿瘤生长速度较慢，说明ARv33-siRNA能够抑制耐药肿瘤的生长。如图17所示，肿瘤组织中Ki67的表达情况也与两组肿瘤生长曲线结果一致，进一步证实了上述结论。
如图18，蛋白质免疫印迹结果显示，ARv33-siRNA能够有效沉默肿瘤组织中ARv33的表达。结合肿瘤生长情况，可以判断在耐药肿瘤组织中靶向沉默ARv33的表达，确实能够提高肿瘤细胞对Enz的敏感性，抑制肿瘤生长。
综上，体外研究表明，ARv33突变型雄激素受体通过与ARv7突变型雄激素受体相互作用，提高了CRPC细胞对Enz的耐药性；体外实验和体内实验表明，靶向ARv33基因以降低其表达，能够提高CRPC细胞的Enz敏感性，这一干预途径具有作为增强去势抵抗性前列腺癌的药物敏感性的潜在用途。
最后需要说明的是，上述描述仅仅为本发明的优选实施例，本领域的普通技术人员在本发明的启示下，在不违背本发明宗旨及权利要求的前提下，可以做出多种类似的表示，这样的变换均落入本发明的保护范围之内。
<110> 西南医科大学
<120> 雄激素受体突变体ARv33及其在前列腺癌药物开发中的应用
<160> 32
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 2880
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 1
atggaagtgc agttagggct gggaagggtc taccctcggc cgccgtccaa gacctaccga 60
ggagctttcc agaatctgtt ccagagcgtg cgcgaagtga tccagaaccc gggccccagg 120
cacccagagg ccgcgagcgc agcacctccc ggcgccagtt tgctgctgct gcagcagcag 180
cagcagcagc agcagcagca gcagcagcag cagcagcagc agcagcagca gcagcagcaa 240
gagactagcc ccaggcagca gcagcagcag cagggtgagg atggttctcc ccaagcccat 300
cgtagaggcc ccacaggcta cctggtcctg gatgaggaac agcaaccttc acagccgcag 360
tcggccctgg agtgccaccc cgagagaggt tgcgtcccag agcctggagc cgccgtggcc 420
gccagcaagg ggctgccgca gcagctgcca gcacctccgg acgaggatga ctcagctgcc 480
ccatccacgt tgtccctgct gggccccact ttccccggct taagcagctg ctccgctgac 540
cttaaagaca tcctgagcga ggccagcacc atgcaactcc ttcagcaaca gcagcaggaa 600
gcagtatccg aaggcagcag cagcgggaga gcgagggagg cctcgggggc tcccacttcc 660
tccaaggaca attacttagg gggcacttcg accatttctg acaacgccaa ggagttgtgt 720
aaggcagtgt cggtgtccat gggcctgggt gtggaggcgt tggagcatct gagtccaggg 780
gaacagcttc ggggggattg catgtacgcc ccacttttgg gagttccacc cgctgtgcgt 840
cccactcctt gtgccccatt ggccgaatgc aaaggttctc tgctagacga cagcgcaggc 900
aagagcactg aagatactgc tgagtattcc cctttcaagg gaggttacac caaagggcta 960
gaaggcgaga gcctaggctg ctctggcagc gctgcagcag ggagctccgg gacacttgaa 1020
ctgccgtcta ccctgtctct ctacaagtcc ggagcactgg acgaggcagc tgcgtaccag 1080
agtcgcgact actacaactt tccactggct ctggccggac cgccgccccc tccgccgcct 1140
ccccatcccc acgctcgcat caagctggag aacccgctgg actacggcag cgcctgggcg 1200
gctgcggcgg cgcagtgccg ctatggggac ctggcgagcc tgcatggcgc gggtgcagcg 1260
ggacccggtt ctgggtcacc ctcagccgcc gcttcctcat cctggcacac tctcttcaca 1320
gccgaagaag gccagttgta tggaccgtgt ggtggtggtg ggggtggtgg cggcggcggc 1380
ggcggcggcg gcggcggcgg cggcggcggc ggcggcggcg aggcgggagc tgtagccccc 1440
tacggctaca ctcggccccc tcaggggctg gcgggccagg aaagcgactt caccgcacct 1500
gatgtgtggt accctggcgg catggtgagc agagtgccct atcccagtcc cacttgtgtc 1560
aaaagcgaaa tgggcccctg gatggatagc tactccggac cttacgggga catgcgtttg 1620
gagactgcca gggaccatgt tttgcccatt gactattact ttccacccca gaagacctgc 1680
ctgatctgtg gagatgaagc ttctgggtgt cactatggag ctctcacatg tggaagctgc 1740
aaggtcttct tcaaaagagc cgctgaaggg aaacagaagt acctgtgcgc cagcagaaat 1800
gattgcacta ttgataaatt ccgaaggaaa aattgtccat cttgtcgtct tcggaaatgt 1860
tatgaagcag ggatgactct gggagggaaa cagaagtacc tgtgcgccag cagaaatgat 1920
tgcactattg ataaattccg aaggaaaaat tgtccatctt gtcgtcttcg gaaatgttat 1980
gaagcaggga tgactctggg agcccggaag ctgaagaaac ttggtaatct gaaactacag 2040
gaggaaggag aggcttccag caccaccagc cccactgagg agacaaccca gaagctgaca 2100
gtgtcacaca ttgaaggcta tgaatgtcag cccatctttc tgaatgtcct ggaagccatt 2160
gagccaggtg tagtgtgtgc tggacacgac aacaaccagc ccgactcctt tgcagccttg 2220
ctctctagcc tcaatgaact gggagagaga cagcttgtac acgtggtcaa gtgggccaag 2280
gccttgcctg gcttccgcaa cttacacgtg gacgaccaga tggctgtcat tcagtactcc 2340
tggatggggc tcatggtgtt tgccatgggc tggcgatcct tcaccaatgt caactccagg 2400
atgctctact tcgcccctga tctggttttc aatgagtacc gcatgcacaa gtcccggatg 2460
tacagccagt gtgtccgaat gaggcacctc tctcaagagt ttggatggct ccaaatcacc 2520
ccccaggaat tcctgtgcat gaaagcactg ctactcttca gcattattcc agtggatggg 2580
ctgaaaaatc aaaaattctt tgatgaactt cgaatgaact acatcaagga actcgatcgt 2640
atcattgcat gcaaaagaaa aaatcccaca tcctgctcaa gacgcttcta ccagctcacc 2700
aagctcctgg actccgtgca gcctattgcg agagagctgc atcagttcac ttttgacctg 2760
ctaatcaagt cacacatggt gagcgtggac tttccggaaa tgatggcaga gatcatctct 2820
gtgcaagtgc ccaagatcct ttctgggaaa gtcaagccca tctatttcca cacccagtga 2880
<210> 2
<211> 959
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 2
Met Glu Val Gln Leu Gly Leu Gly Arg Val Tyr Pro Arg Pro Pro Ser
1 5 10 15
Lys Thr Tyr Arg Gly Ala Phe Gln Asn Leu Phe Gln Ser Val Arg Glu
20 25 30
Val Ile Gln Asn Pro Gly Pro Arg His Pro Glu Ala Ala Ser Ala Ala
35 40 45
Pro Pro Gly Ala Ser Leu Leu Leu Leu Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln
50 55 60
Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln
65 70 75 80
Glu Thr Ser Pro Arg Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gly Glu Asp Gly Ser
85 90 95
Pro Gln Ala His Arg Arg Gly Pro Thr Gly Tyr Leu Val Leu Asp Glu
100 105 110
Glu Gln Gln Pro Ser Gln Pro Gln Ser Ala Leu Glu Cys His Pro Glu
115 120 125
Arg Gly Cys Val Pro Glu Pro Gly Ala Ala Val Ala Ala Ser Lys Gly
130 135 140
Leu Pro Gln Gln Leu Pro Ala Pro Pro Asp Glu Asp Asp Ser Ala Ala
145 150 155 160
Pro Ser Thr Leu Ser Leu Leu Gly Pro Thr Phe Pro Gly Leu Ser Ser
165 170 175
Cys Ser Ala Asp Leu Lys Asp Ile Leu Ser Glu Ala Ser Thr Met Gln
180 185 190
Leu Leu Gln Gln Gln Gln Gln Glu Ala Val Ser Glu Gly Ser Ser Ser
195 200 205
Gly Arg Ala Arg Glu Ala Ser Gly Ala Pro Thr Ser Ser Lys Asp Asn
210 215 220
Tyr Leu Gly Gly Thr Ser Thr Ile Ser Asp Asn Ala Lys Glu Leu Cys
225 230 235 240
Lys Ala Val Ser Val Ser Met Gly Leu Gly Val Glu Ala Leu Glu His
245 250 255
Leu Ser Pro Gly Glu Gln Leu Arg Gly Asp Cys Met Tyr Ala Pro Leu
260 265 270
Leu Gly Val Pro Pro Ala Val Arg Pro Thr Pro Cys Ala Pro Leu Ala
275 280 285
Glu Cys Lys Gly Ser Leu Leu Asp Asp Ser Ala Gly Lys Ser Thr Glu
290 295 300
Asp Thr Ala Glu Tyr Ser Pro Phe Lys Gly Gly Tyr Thr Lys Gly Leu
305 310 315 320
Glu Gly Glu Ser Leu Gly Cys Ser Gly Ser Ala Ala Ala Gly Ser Ser
325 330 335
Gly Thr Leu Glu Leu Pro Ser Thr Leu Ser Leu Tyr Lys Ser Gly Ala
340 345 350
Leu Asp Glu Ala Ala Ala Tyr Gln Ser Arg Asp Tyr Tyr Asn Phe Pro
355 360 365
Leu Ala Leu Ala Gly Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro His Pro His
370 375 380
Ala Arg Ile Lys Leu Glu Asn Pro Leu Asp Tyr Gly Ser Ala Trp Ala
385 390 395 400
Ala Ala Ala Ala Gln Cys Arg Tyr Gly Asp Leu Ala Ser Leu His Gly
405 410 415
Ala Gly Ala Ala Gly Pro Gly Ser Gly Ser Pro Ser Ala Ala Ala Ser
420 425 430
Ser Ser Trp His Thr Leu Phe Thr Ala Glu Glu Gly Gln Leu Tyr Gly
435 440 445
Pro Cys Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
450 455 460
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Glu Ala Gly Ala Val Ala Pro
465 470 475 480
Tyr Gly Tyr Thr Arg Pro Pro Gln Gly Leu Ala Gly Gln Glu Ser Asp
485 490 495
Phe Thr Ala Pro Asp Val Trp Tyr Pro Gly Gly Met Val Ser Arg Val
500 505 510
Pro Tyr Pro Ser Pro Thr Cys Val Lys Ser Glu Met Gly Pro Trp Met
515 520 525
Asp Ser Tyr Ser Gly Pro Tyr Gly Asp Met Arg Leu Glu Thr Ala Arg
530 535 540
Asp His Val Leu Pro Ile Asp Tyr Tyr Phe Pro Pro Gln Lys Thr Cys
545 550 555 560
Leu Ile Cys Gly Asp Glu Ala Ser Gly Cys His Tyr Gly Ala Leu Thr
565 570 575
Cys Gly Ser Cys Lys Val Phe Phe Lys Arg Ala Ala Glu Gly Lys Gln
580 585 590
Lys Tyr Leu Cys Ala Ser Arg Asn Asp Cys Thr Ile Asp Lys Phe Arg
595 600 605
Arg Lys Asn Cys Pro Ser Cys Arg Leu Arg Lys Cys Tyr Glu Ala Gly
610 615 620
Met Thr Leu Gly Gly Lys Gln Lys Tyr Leu Cys Ala Ser Arg Asn Asp
625 630 635 640
Cys Thr Ile Asp Lys Phe Arg Arg Lys Asn Cys Pro Ser Cys Arg Leu
645 650 655
Arg Lys Cys Tyr Glu Ala Gly Met Thr Leu Gly Ala Arg Lys Leu Lys
660 665 670
Lys Leu Gly Asn Leu Lys Leu Gln Glu Glu Gly Glu Ala Ser Ser Thr
675 680 685
Thr Ser Pro Thr Glu Glu Thr Thr Gln Lys Leu Thr Val Ser His Ile
690 695 700
Glu Gly Tyr Glu Cys Gln Pro Ile Phe Leu Asn Val Leu Glu Ala Ile
705 710 715 720
Glu Pro Gly Val Val Cys Ala Gly His Asp Asn Asn Gln Pro Asp Ser
725 730 735
Phe Ala Ala Leu Leu Ser Ser Leu Asn Glu Leu Gly Glu Arg Gln Leu
740 745 750
Val His Val Val Lys Trp Ala Lys Ala Leu Pro Gly Phe Arg Asn Leu
755 760 765
His Val Asp Asp Gln Met Ala Val Ile Gln Tyr Ser Trp Met Gly Leu
770 775 780
Met Val Phe Ala Met Gly Trp Arg Ser Phe Thr Asn Val Asn Ser Arg
785 790 795 800
Met Leu Tyr Phe Ala Pro Asp Leu Val Phe Asn Glu Tyr Arg Met His
805 810 815
Lys Ser Arg Met Tyr Ser Gln Cys Val Arg Met Arg His Leu Ser Gln
820 825 830
Glu Phe Gly Trp Leu Gln Ile Thr Pro Gln Glu Phe Leu Cys Met Lys
835 840 845
Ala Leu Leu Leu Phe Ser Ile Ile Pro Val Asp Gly Leu Lys Asn Gln
850 855 860
Lys Phe Phe Asp Glu Leu Arg Met Asn Tyr Ile Lys Glu Leu Asp Arg
865 870 875 880
Ile Ile Ala Cys Lys Arg Lys Asn Pro Thr Ser Cys Ser Arg Arg Phe
885 890 895
Tyr Gln Leu Thr Lys Leu Leu Asp Ser Val Gln Pro Ile Ala Arg Glu
900 905 910
Leu His Gln Phe Thr Phe Asp Leu Leu Ile Lys Ser His Met Val Ser
915 920 925
Val Asp Phe Pro Glu Met Met Ala Glu Ile Ile Ser Val Gln Val Pro
930 935 940
Lys Ile Leu Ser Gly Lys Val Lys Pro Ile Tyr Phe His Thr Gln
945 950 955
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gggatgactc tgggagggaa acag 24
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tggtcgtcca cgtgtaagtt gc 22
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ggagggaaac agaagtacct gtgcg 25
<210> 6
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gctgtctctc tcccagttca ttgagg 26
<210> 7
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ggagatgaag cttctgggtg tcac 24
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gcctctcctt cctcctgtag tt 22
<210> 9
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
gtccacgtgt aagttgcgga agc 23
<210> 10
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
tcggacacac tggctgtaca tcc 23
<210> 11
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
gcgtcttgag caggatgtgg gat 23
<210> 12
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
gaactgatgc agctctctcg caat 24
<210> 13
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
gtgcgccagc agaaatgatt g 21
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
tccgaagacg acaagatgga 20
<210> 15
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
ggatgactct gggagggaaa cagaagt 27
<210> 16
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
ccatcttgtc gtcttcggaa atgtta 26
<210> 17
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
tttgaatgag gcaagtcagc ctttct 26
<210> 18
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
ttccgggttg gcaattgcaa gcatctca 28
<210> 19
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
tgtcactatg gagctctcac atgtgg 26
<210> 20
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
cacctctcaa atatgctaga cgaatctgt 29
<210> 21
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
actctgggag ggaaacagaa g 21
<210> 22
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
ctgggaggga aacagaagta c 21
<210> 23
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
gatgactctg ggagggaaac a 21
<210> 24
<211> 26
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
cuggcacaau aacgugcuac auaccc 26
<210> 25
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
Ala Gly Met Glu Thr Thr Leu Gly Gly Lys Gln Lys Tyr Leu Cys Ala
1 5 10 15
<210> 26
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
Cys Lys Val Phe Phe Lys Arg Ala Ala Glu Gly Lys Gln Lys Tyr Leu
1 5 10 15
Cys Ala
<210> 27
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
Ala Gly Met Glu Thr Thr Leu Gly Ala Arg Lys Leu Lys Lys Leu Gly
1 5 10 15
Asn
<210> 28
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
ggcgcacagg tacttctgtt tcc 23
<210> 29
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
tgaagcaggg atgactctgg gag 23
<210> 30
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
gtaggtggaa gattcagcca agctca 26
<210> 31
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
gtcaaaagcg aaatgggccc ctg 23
<210> 32
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
gggtggggaa atagggtttc ca 22

Claims (7)

1.一种雄激素受体突变基因ARv33，其特征在于：与野生型雄激素受体（AR）基因相比，所述雄激素受体突变基因ARv33具有一个连续重复的第3号外显子，该ARv33基因的编码序列如SEQ ID NO:1所示。
2.如权利要求1所述的雄激素受体突变基因ARv33在（1）或（2）的应用：（1）作为检测靶点在制备用于预测受试者用药敏感性的检测试剂中的应用，所述用药敏感性为与雄激素受体相关的药物恩杂鲁胺（enzalutamide）的敏感性；（2）作为靶点在筛选药物中的应用，所述药物为抑制ARv33型雄激素受体的抗雄药物，该抗雄药物能够靶向降低ARv33基因的表达。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述（2）的应用中，所述药物为治疗去势抵抗性前列腺癌的药物。
4.如权利要求1所述的雄激素受体突变基因ARv33编码的突变型雄激素受体。
5.如权利要求4所述的突变型雄激素受体在（3）或（4）的应用：（3）作为检测靶点在制备用于预测受试者用药敏感性的检测试剂中的应用，所述用药敏感性为与雄激素受体相关的药物恩杂鲁胺（enzalutamide）的敏感性；（4）作为靶点在筛选药物中的应用，所述药物为抑制ARv33型雄激素受体的抗雄药物。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述（4）的应用中，所述药物为治疗去势抵抗性前列腺癌的药物。
7. 一种特异性靶向雄激素受体突变基因ARv33的mRNA的短发夹RNA（shRNA），所述shRNA的靶向序列为以下任意一种： SEQ ID NO:21，SEQ ID NO:22，或SEQ ID NO:23；
所述ARv33基因的编码序列如SEQ ID NO:1所示。
CN202111149867.XA 2021-09-29 2021-09-29 雄激素受体突变体ARv33及其在前列腺癌药物开发中的应用 Active CN113943738B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202111149867.XA CN113943738B (zh) 2021-09-29 2021-09-29 雄激素受体突变体ARv33及其在前列腺癌药物开发中的应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202111149867.XA CN113943738B (zh) 2021-09-29 2021-09-29 雄激素受体突变体ARv33及其在前列腺癌药物开发中的应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN113943738A CN113943738A (zh) 2022-01-18
CN113943738B true CN113943738B (zh) 2023-06-13

Family

ID=79329264

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202111149867.XA Active CN113943738B (zh) 2021-09-29 2021-09-29 雄激素受体突变体ARv33及其在前列腺癌药物开发中的应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN113943738B (zh)

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014130932A2 (en) * 2013-02-25 2014-08-28 Novartis Ag Novel androgen receptor mutation
CN108866052A (zh) * 2018-07-13 2018-11-23 天津市泌尿外科研究所 Ar-v7可变剪切序列在抗去势抵抗性肿瘤中的应用

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8133724B2 (en) * 2008-09-17 2012-03-13 University Of Maryland, Baltimore Human androgen receptor alternative splice variants as biomarkers and therapeutic targets
WO2013130748A1 (en) * 2012-02-29 2013-09-06 The Regents Of The University Of Michigan Prostate cancer markers and uses thereof
CN106902112B (zh) * 2017-03-07 2019-06-04 中国医学科学院医药生物技术研究所 Imb-a6作为雄激素受体拮抗剂的应用
CN114015772A (zh) * 2021-09-29 2022-02-08 西南医科大学 检测ARv33基因表达的引物、taqman探针、RT-PCR试剂盒及检测方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014130932A2 (en) * 2013-02-25 2014-08-28 Novartis Ag Novel androgen receptor mutation
CN108866052A (zh) * 2018-07-13 2018-11-23 天津市泌尿外科研究所 Ar-v7可变剪切序列在抗去势抵抗性肿瘤中的应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN113943738A (zh) 2022-01-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11447796B2 (en) Circular RNA for translation in eukaryotic cells
RU2771110C2 (ru) Онколитические вирусные векторы и их применение
TWI516592B (zh) 用於在原核細胞內使用真核第二型聚合酶啟動子驅動之轉錄作用的可誘導之基因表現組成物及其應用
CN107760784B (zh) 环状RNA circ-FOXP1的用途
US20170191057A1 (en) Rna editing biomarkers for diagnosis, pharmacological screening and prognostication in cancer
TW200908998A (en) Compositions and methods of treating cancer
CN107523569A (zh) Pdcd1基因的用途及其相关药物
JP2014502606A (ja) 黒色腫の処置
CN114015772A (zh) 检测ARv33基因表达的引物、taqman探针、RT-PCR试剂盒及检测方法
CN113943738B (zh) 雄激素受体突变体ARv33及其在前列腺癌药物开发中的应用
JP2019525903A (ja) 転移性癌の診断及び治療の方法
WO2020093575A1 (zh) 一种用于肿瘤治疗的多聚核苷酸及其应用
US11643656B2 (en) Antisense therapies for treating cancer
CN104994883A (zh) miR-494通过BIM下调来调节TRAIL诱导的细胞凋亡的用途
CN104245936B (zh) 用于抑制TGF-β2表达的shRNA
CN101787374A (zh) 一种基于微小rna调控可在肿瘤细胞内特异性增殖的重组腺病毒载体、其构建方法及其用途
CN110279706B (zh) hnRNPC基因C1和/或C2亚型作为药物靶标在筛选抗癌药物中的应用
CN109295220B (zh) miR-495-5p在制备诊断、预后、预防或治疗胰腺癌的产品中的应用
CN114364799A (zh) 编辑造血干/祖细胞中bcl11a基因的方法
WO2019157154A2 (en) Method of identifying tumor specific macromolecular isoforms
KR20190005727A (ko) 난소과립막세포암 또는 자궁내막암의 진단 및 치료를 위한 마이크로rna-1236의 용도
CN108950001B (zh) 一种与直肠腺癌发生发展相关的分子标志物
CN111647658B (zh) Linc00963相关致癌轴在前列腺癌远处转移的早期诊断和治疗中的应用
WO2022052909A1 (zh) 编辑造血干/祖细胞中bcl11a基因的方法
EP3397259B1 (en) Compositions and methods for screening and diagnosis of prostate cancer

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant