CN113940378A - 一种u118细胞抑制剂及其应用 - Google Patents

一种u118细胞抑制剂及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种U118细胞抑制剂及其应用。其中，U118细胞抑制剂的制备原料包括木姜叶柯活性成分。本发明的U118细胞抑制剂由于对制备原料的调整，能够在最小程度影响正常细胞的前提下，抑制U118细胞的增殖。

Description

一种U118细胞抑制剂及其应用
技术领域
本发明属于医药和食品技术领域，具体涉及一种U118细胞抑制剂及其应用。
背景技术
脑干肿瘤(脑干胶质瘤)占颅内肿瘤的1.4％。主要为神经胶质瘤，其中以星形细胞瘤和极性成胶质细胞瘤较为多见，其次是少枝胶质细胞瘤、室管膜胶质瘤、髓母细胞瘤，此外还可见到血管瘤、囊肿、畸胎瘤、结核瘤、转移性肿瘤等。胶质细胞瘤的生长特点为浸润性生长，与正常脑组织无明显界限，多数不限于一个脑叶，向脑组织外呈指状深入破坏脑组织，偏良性者生长缓慢，病程较长，恶性者瘤体生长快，病程短。现在对于胶质瘤的治疗普遍为手术、中医药、放疗、化疗、X刀、和γ刀。
木姜叶柯作为茶叶型饮料已有千余年历史，也被成为甜茶，味道甘甜清爽，具有生津止渴的作用。木姜叶柯叶中含有丰富的氨基酸、维生素和微量元素；其中氨基酸的种类不小于16种，总含量高达6％，均优于一般茶叶；维生素的种类包括VC、VE、VA、VB1、VB2等；微量元素的种类包括Fe、Mn、Zn、Se等。此外，木姜叶柯叶中咖啡碱含量较低，多饮也不会出现神经系统兴奋，无失眠等副作用。
木姜叶柯中还含有黄酮类物质和三萜类化合物，具体主要包括根皮苷，三叶苷和3-羟基根皮苷三种二氢查尔酮葡萄糖苷，其中三叶苷含量最高，甜度约为蔗糖的300倍。上述物质的含量随着木姜叶柯叶的生长而变化，嫩叶含有大量三叶苷，因此常被作为茶产品，而老叶中含有大量的根皮苷，作为茶产品口感不佳，因此大多被废弃。
由于木姜叶柯中含有丰富的上述营养物质，现已经被证实具有清除人体自由基(抗氧化)、抑菌、抑制骨质疏松、抗过敏等药理作用。对糖尿病、高血脂、高血压这“三高”也有良好的辅助疗效。综上，木姜叶柯甜茶是一种药食两用，兼有茶、糖、药三种功能的珍贵天然植物，是无毒、低热、高糖的天然饮品。但目前未见木姜叶柯有对胶质瘤细胞抑制作用的相关研究。
由于现阶段胶质瘤的治疗过程中，患者的身体负担较重，若可开发一种植物来源的，可有效抑制胶质瘤细胞增殖、增长的抑制剂具有重要意义。
发明内容
本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种U118细胞抑制剂，由于对制备原料的调整，能够在最小程度影响正常细胞的前提下，抑制U118细胞的增殖。
本发明还提出一种具有上述U118细胞抑制剂的饮料。
本发明还提出一种具有上述U118细胞抑制剂的药物。
根据本发明的一个方面，提出了一种U118细胞抑制剂，制备原料包括木姜叶柯活性成分。
根据本发明的一种优选的实施方式，至少具有以下有益效果：
U118细胞是人胶质细胞瘤细胞，其非正常增殖会引起胶质瘤，严重影响人体健康；
木姜叶柯是一种传统的药食同源的植物，常被作为甜茶饮用，经实践验证，安全性较高，对人体无危害；
本发明以木姜叶柯活性成分为原料制备的U118细胞抑制剂，可有效抑制U118细胞的增殖，但是并不会明显影响人体正常细胞的增殖，可以制备预防、治疗胶质瘤的药物，为该病的质量提供了一种有效途径。
在本发明的一些实施方式中，所述U118细胞抑制剂可以只包括所述木姜叶柯活性成分，也可以还包括具有或不具有生物活性的其他物质。
在本发明的一些实施方式中，所述木姜叶柯活性成分的提取方法包括以下步骤：
S1.对所述木姜叶柯的叶进行前处理；
S2.以乙醇-水混合液提取步骤S1所得木姜叶柯的叶；
S3.浓缩步骤S2所得提取液后冻干即得。
在本发明的一些实施方式中，步骤S1中，所述木姜叶柯的叶采自湖南怀化，芷江县侗族自治区富农茶厂。
在本发明的一些实施方式中，步骤S1中，所述木姜叶柯的叶中，老叶和嫩叶的质量比为4：(3～5)。
在本发明的一些优选的实施方式中，步骤S1中，所述木姜叶柯的叶中，老叶和嫩叶的质量比约为4：5。
在本发明的一些实施方式中，所述老叶指生长期(叶龄)为3～4个月的木姜叶柯叶片。
在本发明的一些实施方式中，所述嫩叶指生长期(叶龄)为0～3个月的木姜叶柯叶片。
木姜叶柯的叶片中富含三叶苷和根皮苷，这两种物质通过不同作用途径，对血糖调节起到重要作用，但在木姜叶柯叶片生长过程中，三叶苷和根皮苷存在相互转化，在嫩叶期以三叶苷居多，然后随生长期延长三叶苷逐渐转化为根皮苷，因此嫩叶中根皮苷含量很少，老叶期三叶苷含量很少。为获得更好提升调节血糖功能，本发明将嫩叶提取物和老叶提取物按一定比例混合，一方面充分利用了老叶资源，增加了木姜叶柯活性成分中根皮苷的含量；另一方面，嫩叶的加入，调和了口感，萃取得到混合提取物，具有更好的降糖效果。
通过调节老叶和嫩叶的质量比，木姜叶柯活性成分在抑制U118细胞增殖中的效果也明显提升。
在本发明的一些实施方式中，步骤S1中，所述前处理包括杀青、揉捻和干燥。
在本发明的一些实施方式中，所述杀青的温度为220～260℃。
在本发明的一些实施方式中，所述杀青的时间为2～4min。
所述杀青的目的是通过高温快速破坏酶的活性，停止其酶促氧化作用，使茶叶的品质(主要营养物质)固定下来。
220～260℃可以快速破坏酶活性，使其中活性物质能得以最大程度保留。
所述揉捻可以使木姜叶柯叶汁水溢于表面，茶香被充分激发，更利于步骤S2中的提取。
在本发明的一些实施方式中，所述杀青后，所得木姜叶柯的叶质柔软稍有黏性，闻有清纯茶香。
在本发明的一些实施方式中，所述干燥后所述木姜叶柯的叶中含水量≤9wt％。
在本发明的一些实施方式中，所述干燥的温度为60～65℃。
在本发明的一些实施方式中，所述干燥的温度约为65℃。
在本发明的一些实施方式中，所述干燥的时间为4～5h。
在本发明的一些实施方式中，步骤S2中，所述提取前还包括将步骤S1所得木姜叶柯的叶粉碎。
在本发明的一些实施方式中，所述粉碎后，木姜叶柯的叶粉可通过200目筛网。
所述粉碎的目的是提升步骤S2中提取的效率。
在本发明的一些实施方式中，步骤S2中，所述提取的次数为2～3次。
在本发明的一些实施方式中，步骤S2中，所述提取的次数为3次。
在本发明的一些实施方式中，步骤S2中，所述乙醇-水混合液中乙醇的体积含量为65％～75％。
在本发明的一些实施方式中，步骤S2中，所述乙醇-水混合液中乙醇的体积含量约为70％。
在本发明的一些实施方式中，步骤S2中，每次所述提取中所述乙醇-水混合液的体积与叶粉的质量比为20～25ml：1g。
在本发明的一些实施方式中，步骤S2中，每次所述提取中所述乙醇-水混合液的体积与叶粉的质量比约为20ml：1g。
在本发明的一些实施方式中，步骤S2中，所述提取的温度为50～55℃。
在本发明的一些实施方式中，步骤S2中，所述提取的温度约为55℃。
在本发明的一些实施方式中，所述提取的温度控制方法为水浴加热。
控制所述提取的温度，有助于保护木姜叶柯叶中的活性物质，避免失活。
在本发明的一些实施方式中，步骤S2中，所述提取在搅拌下进行。
在本发明的一些实施方式中，所述搅拌的转速为30～35rpm。
在本发明的一些实施方式中，所述搅拌的转速约为35rpm。
在本发明的一些实施方式中，步骤S2中，每次所述提取的时间为30～45min。
在本发明的一些实施方式中，步骤S3中，所述提取液为步骤S2中3次提取获取提取液的混合物。
在本发明的一些实施方式中，步骤S3中，所述浓缩后的体积≤所述提取液体积的30％。
在本发明的一些实施方式中，步骤S3中，所述浓缩的方法为旋转蒸发。
在本发明的一些实施方式中，所述旋转蒸发的温度为50～55℃。
在本发明的一些实施方式中，所述旋转蒸发的温度约为50℃。
在本发明的一些实施方式中，所述旋转蒸发的真空度为0.08～0.12Mpa。
在本发明的一些实施方式中，所述旋转蒸发的真空度约为0.1Mpa。
在本发明的一些实施方式中，所述旋转蒸发的转速为55～60rpm。
在本发明的一些实施方式中，所述旋转蒸发的转速约为58rpm。
在本发明的一些优选的实施方式中，步骤S3中，所述冻干包括依次进行的第一阶段和第二阶段；
在本发明的一些优选的实施方式中，所述冻干的第一阶段，包括将去除叶绿素的浓缩物在≤-80℃的温度冷冻3～4h；目的是使其冷冻形成固体。
所述冻干的第一阶段不要求真空环境。
在本发明的一些实施方式中，所述冻干的第二阶段的温度为-45～-75℃。
在本发明的一些优选的实施方式中，所述冻干的第二阶段的温度为-55～-65℃。
在本发明的一些优选的实施方式中，步骤S3中，所述冻干的第二阶段的温度为-65～70℃。
在本发明的一些实施方式中，步骤S3中，所述冻干的第二阶段的时间为18～20h。
在本发明的一些实施方式中，步骤S3中，所述冻干的第二阶段采用的仪器为真空冻干机。
在本发明的一些优选的实施方式中，步骤S3中，所述冻干的第二阶段需依次进行如下步骤：-45℃(1h)→-55℃(1h)→-65℃(1h)→-75℃(1-5h)→-75℃(8h)→-55℃(2h)→-45℃(4h)。
相对其它干燥方法，所述冻干脱水更彻底，且产品结构破坏小、不易变型收缩，形成多孔性结构，具有复水快等特点，能最大程度保护木姜叶柯活性成分免受破坏。
在本发明的一些实施方式中，步骤S3中，还包括在所述浓缩和冻干之间，静置所述浓缩得到的浓缩物。
所述静置的目的是析出叶绿素，并通过紧接的固液分离去除固体形态的叶绿素。
所述叶绿素在所述乙醇-水混合液中的溶解度高，在水中的溶解度低，所述浓缩蒸发去除了其中的乙醇(乙醇的沸点小于水)，因此所述叶绿素可以在所述浓缩后的体系中析出，并通过固液分离的方法去除。
去除叶绿素后的木姜叶柯活性成分的抗氧化活性明显增强；
抗氧化性以及总黄酮等的测试均与吸光度相关，而叶绿素在特定波长的吸光度较强，因此去除叶绿素后，也可提升对所述木姜叶柯活性成分成分测试的精度。
根据本发明的再一个方面，提出了一种饮料，制备原料包括所述的U118细胞抑制剂。
根据本发明的一种优选的实施方式的饮料，至少具有以下有益效果：
饮料，例如奶茶是一种深受大众喜爱的日常饮品，但是奶茶有高糖(正常甜度的奶茶含糖量为21～48克)、高油、高热量等缺点，奶精由椰子油做成，椰子油中含大量饱和脂肪酸，会加速体内制造胆固醇，血脂肪也会急速上升，形成血管硬化，长期大量饮用，容易罹患高血压、糖尿病等慢性病；市售奶茶当中的含糖量超标，一杯奶茶中的平均含糖量在33克左右，最高的情况甚至可能达到62克；一杯很小的奶茶，其中的含糖量已经达到了我们每天添加糖摄入量的最高值；经常喝这种奶茶，会增加龋齿、肥胖、糖尿病、痛风等疾病的患病概率，威胁较大。
目前市场上的奶茶粉种类繁多，但与中草药结合具有药用保健价值的奶茶少之又少；此外，传统奶茶以白砂糖、黑糖等作为主要甜味来源，糖份和热量极高，高血压、高血脂、糖尿病等特殊人群无法饮用，也不适合减肥人士饮用，忽略了当今社会人们对饮食保健作用的要求。为此本发明的饮料不但口感香甜，与奶茶口感相似，营养丰富，不含咖啡因，并且具有防治“三高”的保健功效，喝出来的好健康。
本发明提供的饮料，制备原料包括U118细胞抑制剂，即包括木姜叶柯活性成分，其中的三叶苷甜度是制糖的300倍，因此本发明以U118细胞抑制剂替代传统奶茶中的糖，可在保证饮料甜度等口味的基础上，降低传统奶茶中糖对人体健康的影响，同时还可以起到抑制U118细胞增殖的作用。
在本发明的一些实施方式中，所述饮料中，所述U118细胞抑制剂的用量为35～45份。
在本发明的一些实施方式中，所述饮料的制备原料还包括奶粉。
在本发明的一些实施方式中，所述奶粉为无糖脱脂奶粉。
在本发明的一些实施方式中，按重量份计，所述奶粉的用量约为35份。
无糖脱脂奶粉是仅以乳为原料，添加或不添加食品营养强化剂，经脱脂、浓缩、干燥制成的，蛋白质不低于非脂乳固体的34％，脂肪不高于2.0％的粉末状产品；能补充人体所需要的钙及蛋白质等。因无糖脱脂奶粉的脂肪含量较少，所以易保存，不易发生氧化作用，饮用了也不易发胖，对肠胃的负担也较小，因此适合肥胖的人群、中老年人、消化不良的婴儿，以及腹泻、胆囊疾患、高脂症等患者有一定益处。此外，无糖脱脂奶粉还具有很好的降血压功效，因此适宜于患有高血压以及血压经常不稳定的人群。又由于无糖脱脂奶粉中含有维生素A、C、钙、镁、锌等营养成分，因此也有研究称无糖脱脂奶粉具有一定的防癌、环节心脏和神经系统疲劳、促进伤口愈合等功效。
在本发明的一些实施方式中，所述饮料的制备原料还包括奇亚籽颗粒。
在本发明的一些实施方式中，按重量份计，所述奇亚籽颗粒的用量为5～8份。
除了糖类物质和奶精，传统奶茶中还会额外添加很多物质，比如说珍珠奶茶当中劣质的“珍珠”，“奶盖”和“芝士”，这些物质脂肪含量较高，经常摄入都会给身体带去肥胖、高血脂等危害风险；本发明以奇亚籽颗粒富含人体必需脂肪酸α-亚麻酸，多种抗氧化活性成分(绿原酸，咖啡酸，杨梅酮，槲皮素，山奈酚等)，是天然omega-3脂肪酸的来源，并含有丰富的膳食纤维、蛋白质，维生素，矿物质等；具有润肠通便功、抗癌、减肥瘦身、修复肌肤和指甲、增强体能等功效；且口感与传统珍珠奶茶中的“珍珠”类似，因此用来代替珍珠可给饮用者带来多元化的饮用体验。
在本发明的一些实施方式中，所述饮料的制备原料还包括口味调节剂。
在本发明的一些实施方式中，所述口味调节剂包括甘草提取物、二氧化硅和氯化钠。
在本发明的一些实施方式中，按重量份计，所述甘草提取物的用量为15～20份。
在本发明的一些实施方式中，所述甘草提取物的制备方法包括以下步骤：
A1.将甘草粉碎后，以乙醇的水溶液提取；
A2.旋蒸步骤A1所得提取液，浓缩得浓缩液；
A3.冷冻干燥步骤A2所得浓缩液即得。
步骤A1中，所述粉碎是为了增大接触面积，有利于甘草中活性成分的溶出。
在本发明的一些实施方式中，步骤A1中，所述乙醇的水溶液中，乙醇占有的体积比为50～60％。
加乙醇水溶液能促进甘草中水溶性和醇溶性化合物的充分提取。
在本发明的一些实施方式中，步骤A1中，所述提取的次数为2次。
在本发明的一些实施方式中，步骤A1中，每次所述提取的料液比为1g:18～22ml。
在本发明的一些实施方式中，步骤A1中，每次所述提取的料液比约为1g:18ml。
在本发明的一些实施方式中，步骤A1中，所述提取的温度为40～45℃，时间为0.5～1h。
在本发明的一些实施方式中，步骤A1中，所述提取的温度约为45℃，时间约为1h。
在本发明的一些实施方式中，步骤A1中，所述提取的在超声辅助条件下进行。
在本发明的一些实施方式中，步骤A2中，所述浓缩，与步骤S3中所述浓缩的条件的选择范围相同。
在本发明的一些实施方式中，步骤A3中，所述冷冻干燥的条件与步骤S3中所述冻干的条件的选择范围相同。
甘草是一味常见的中草药，有补中益气的功效，甘草中甘草酸的甜度高于蔗糖50倍，是名副其实的“甜草”，在饮料配方中有增甜、增香的作用。
在本发明的一些实施方式中，按重量份计，所述氯化钠的添加量约为0.1份。
氯化钠可以调和口感，让饮料更香醇,味觉层次更丰富。
在本发明的一些实施方式中，所述口味调节剂还可包括蓝莓提取物、山楂提取物和百香果提取物中的至少一种。
在本发明的一些实施方式中，按重量份计，所述蓝莓提取物、山楂提取物和百香果提取物的添加量分别约为3份。
在本发明的一些实施方式中，所述饮料的制备原料还包括二氧化硅。
在本发明的一些实施方式中，按重量份计，所述二氧化硅的添加量为0.2～0.4份。
在本发明的一些实施方式中，按重量份计，所述二氧化硅的添加量约为0.4份。
二氧化硅在食品工业中主要用于防止粉状食品聚集结块，以保持自由流动，通过食用进入人体的二氧化硅，弱碱空腔环境、强酸胃酸环境、弱酸肠道环境对其都不分解、不吸收，最后随粪便一起排出。
在本发明的一些实施方式中，所述饮料的制备原料还包括水。
在本发明的一些实施方式中，所述水的温度为85±3℃。
在本发明的一些实施方式中，按重量份计，所述水的添加量，是其他所有制备原料添加量的5～6倍。
在本发明的一些实施方式中，按重量份计，所述水的添加量为500～600份。
在本发明的一些实施方式中，按重量份计，所述水的添加量，约是其他所有制备原料添加量的6倍。
在本发明的一些实施方式中，所述饮料的制备方法包括将所有制备原料混合后，浸泡8～15min。
所述浸泡8～15min可以使所述奇亚籽颗粒充分溶胀，提升口感。
在本发明的一些实施方式中，所述饮料可以为热饮，也可以冷藏或者加冰形成冰镇饮料。
根据本发明的再一个方面，提出了一种治疗胶质瘤的药物，包括所述的U118细胞抑制剂。
根据本发明的一种优选的实施方式的药物，至少具有以下有益效果：
在本发明的一些实施方式中，所述物的剂型包括液体剂型、气体剂型和固体剂型中的至少一种。
在本发明的一些实施方式中，所述药物还可以包括与所述U118细胞抑制剂发生协同作用或减轻所述U118细胞抑制剂副作用的辅助药物。
在本发明的一些实施方式中，所述药物还可以包括医药学上可接受的载体和添加剂。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明做进一步的说明，其中：
图1为本发明实施例1所得U118细胞抑制剂对3T3细胞增殖的抑制情况；
图2为本发明实施例1所得U118细胞抑制剂对U118细胞增殖的抑制情况；
图3为本发明实施例2～5所得饮料的自由基清除效果；
图4为本发明实施例2所得饮料对3T3细胞增殖的抑制情况；
图5为本发明实施例2所得饮料对U118细胞增殖的抑制情况。
具体实施方式
以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。
若无特殊说明，本发明所用U118细胞和3T3细胞均来自自中科院上海细胞库。
实施例1
本实施例制备了一种U118细胞抑制剂，具体过程为：
D1.将从湖南怀化芷江县侗族自治区富农茶厂采摘的木姜叶柯老叶和嫩叶按照4:5的比例混合后，在230℃杀青3min，之后出锅揉捻，并于烘箱中65℃烘4h，直至木姜叶柯叶中的含水量≤9％；
D2.将步骤D1所得木姜叶柯叶粉碎并过200目筛后得叶粉；按照1g/20ml的料液比，采用70％体积百分数的乙醇-水混合液提取3次，合并提取液；其中提取温度为55℃，每次提取的时间为30min，提取过程中伴随35rpm转速的搅拌；
D3.将步骤D2所得提取液静置3h固液分离去除叶绿素后，旋转蒸发所得滤液，旋转蒸发的条件为：温度为50℃，真空度为0.1Mpa，转速58rpm；
D4.将步骤D3所得浓缩物，按照以下的温度曲线，在真空冻干机中进行冷冻干燥，-45℃(1h)→-55℃(1h)→-65℃(1h)→-75℃(5h)→-75℃(8h)→-55℃(2h)→-45℃(4h)，得U118细胞抑制剂。
实施例2
本实施例制备了一种饮料，具体为按照表1所示比例调配饮料粉，并按照饮料粉：水＝1:6的质量比，采用85±3℃的温水冲泡饮料粉，搅拌均匀后静置10min即得；
其中U118细胞抑制剂来源于实施例1；
甘草提取物的制备方法为：
A1.将甘草粉碎过200目筛，加乙醇的水溶液(乙醇体积占比60％)，以料液比1g:18ml，在45℃超声提取1h，过滤得滤渣，将滤渣重复提取两次，合并滤液；
A2.旋蒸步骤A1所得滤液，浓缩至原体积的30％以下，得到甘草提取物浓缩液；
A3.将甘草浓缩液置于真空冻干机中，按照以下温度曲线进行冻干，-45℃(1h)→-55℃(1h)→-65℃(1h)→-75℃(5h)→-75℃(8h)→-55℃(2h)→-45℃(4h)，得到甘草提取物。
表1按重量份计，实施例2～5中所用饮料粉的配方
实施例2 实施例3 实施例4 实施例5
U118细胞抑制剂 35 38 40 45
甘草提取物 20 18 16 15
无糖脱脂奶粉 35 35 45 35
奇亚籽颗粒 8 6 6 5
其他提取物 3 3 3
二氧化硅 0.4 0.4 0.4 0.4
氯化钠 0.1 0.1 0.1 0.1
实施例3～5分别制备了一种饮料，与实施例2的区别在于，具体配方不同，详见表1；
其中实施例3中的其他提取物是蓝莓提取物(曲阜市圣嘉德生物科技有限公司)；
实施例4中的其他提物是山楂提取物(宁陕国圣生物科技有限公司)；
实施例5中的其他提取物是百香果提取物(西安瑞盈生物科技有限公司)。
对比例1
本对比例制备了一种U118细胞抑制剂，与实施例1的区别在于：
步骤D1中未进行杀青和揉捻处理，取而代之的是于烘箱中65℃烘4h的干燥处理。
对比例2
本对比例制备了一种U118细胞抑制剂，与实施例1的区别在于：
步骤D2中，仅进行1次提取，而不是3次。
对比例4～5分别制备了一种饮料，与实施例2的区别在于：
对比例4采用对比例1所得的U118细胞抑制剂；
对比例5采用对比例2所得的U118细胞抑制剂。
试验例1
本试验例测试了实施例1所得U118抑制剂对U118细胞和正常的3T3细胞的增殖抑制情况。
其中3T3细胞全称是小鼠胚胎成纤维细胞(是一种正常细胞)，处于胚胎状态的这种细胞，增殖非常快，它的分裂形式有点类似癌细胞，正是由于3T3的细胞增殖速度能与肿瘤细胞相匹配，通常会把它作为一种常用的药物实验正常细胞。此外，3T3细胞对于药物敏感度比一般体细胞要强得多，对药物浓度变化能有更精确的反馈，与U118胶质母瘤细胞做载药活性对比，更能够反馈出U118细胞抑制剂对正常细胞与癌细胞的选择性(靶向性)杀伤作用(在杀死癌细胞而不破坏大部分正常细胞的情况下，存在一个可行的药物治疗浓度，我们称之为治疗窗口)。
测试方法为：
体外培养3T3鼠纤维原细胞(一种重要的细胞材料，用于肿瘤病毒和致癌剂等所引起的体外致癌研究)与U118细胞(胶质母细胞瘤，广泛应用于体外神经肿瘤系统研究)；具体步骤如下：
将两种细胞分别接种到96孔板中，并在37℃的DMEM(4.5g L-1)培养基中孵育24h，用不同浓度U118细胞抑制剂处理后，利用CCK-8试剂盒继续在37℃下培养24h，在450nm处测量细胞活力(细胞增殖)，结果如图1和2所示；
上述以不同浓度U118细胞抑制剂处理的方法为：将实施例1所得U118细胞抑制剂稀释至不同浓度梯度，灭菌后，100μL加入到细胞培养液中共同培养。
从图2(U118细胞抑制剂对3T3细胞的增殖抑制情况)和图3(U118细胞抑制剂对U118细胞)可以看出，U118细胞抑制剂在0.5mg/mL以下浓度时不影响小鼠正常细胞的增殖活动，当浓度大于1mg/ml时干扰率开始增加；当浓度达到4mg/ml时，胶质瘤细胞U118增值得到显著抑制，而3T3细胞仍有较高存活率。
试验例2
本试验例测试了实施例2～5和对比例3～4所得饮料中饮料粉的理化性质，测试结果如表3所示。
其中，根皮苷、三叶苷均采用waters 2695HPLC测定(标准品购自上海源叶生物科技有限公司)；制备标准曲线时，标准品为浓度为0.03125、0.0625、0.125、0.25mg/ml的醇溶液；测试时，waters 2695HPLC的流动相为A为1％的磷酸水，B为色谱纯乙腈，洗脱梯度表如表2所示。
表2饮料粉洗脱条件
时间(min) 洗脱液A(％) 洗脱液B(％)
0 85 15
5 78 22
15 75 25
20 68 32
25 60 40
30 85 15
总黄酮采用的是改进的比色法(黄酮母核在碱性条件下可以与铝离子螯合生成红色化合物，在510nm下与芦丁标准品进行比较可以得出总黄酮含量)；具体的先称取干燥芦丁对照品(0.1mg/mL)，取0，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0mL，加乙醇稀释至1mL，加入5％亚硝酸钠溶液0.3mL，摇匀，放置5min，再加入10％硝酸铝溶液0.3mL，摇匀，放置6min，加入1mol/L氢氧化钠溶液2mL，摇匀，避光放置15min后，在510nm处测定吸收度。以吸收度A为纵坐标，质量浓度C为横坐标绘制标准曲线；之后将木姜叶柯活性物质粉末用70％乙醇按照1g:20ml的比例，冷凝回流提取3次，合并滤液，浓缩，用甲醇复溶，至浓度为10mg/mL，稀释到0.1mg/mL；取1mL，加按照标准品制备方法处理后，在510nm处测定吸收度，代入标准曲线计算，以芦丁当量(mgRE/g)表示总黄酮含量。
甜度采用购自上海力辰邦西仪器科技有限公司的手持糖度计进行测定(利用折射率来测定溶液糖度)。
表3实施例和对比例中饮料粉的理化情况
Figure BDA0003284312590000151
表3测试结果说明，较之实施例2～5，未经杀青的对比例3中的三叶苷、根皮苷含量显著下降，原因是未经快速炒制定型，木姜叶柯中黄酮化合物在氧化酶催化下，迅速转化消耗，其中主要甜味成分三叶苷下降最为明显。对比例4未经三次提取，有效成分未能萃取完全，造成含量偏低。
试验例3
本试验例测试了实施例2～5所得饮料茶底(指实施例2～5中对应的木姜叶柯提取物和甘草提取物的浓度之和，由于二氧化硅、奇亚籽颗粒和奶粉会影响吸光度，因此测试过程中不添加)以及维生素C(Vc)对DPPH自由基的清除效果，测试方法为DPPH自由基的乙醇溶液呈紫色，在517nm处有最大吸收，吸光度与浓度呈良好的线性关系，当自由基清除剂存在时，自由基数量减少，溶液变浅，吸光度变小，因此借助此原理可以评价化合物自由基的清除能力。
其中茶底浓度，是指U118细胞抑制剂和甘草提取物的浓度之和，例如实施例2中的0.5mg/ml是指U118细胞抑制剂与甘草提取物按照35:20的质量比，配制成浓度和为0.5mg/ml的水溶液；
U118细胞抑制剂(即木姜叶柯活性成分)中的主要物质三叶苷是一种潜在的抗氧化剂，而根皮素和根皮苷的抗氧化性依次降低，这些化合物的不同抗氧化活性可能与类黄酮分子糖基化中羟基和其他取代基的数量和位置有关，还有研究发现，木姜叶柯活性成分能显著提高实验大鼠超氧化物歧化酶和谷胱甘肽活力，降低丙二醛水平，从而有效提高抗氧化能力。
本发明中，从图3中DPPH自由基清除率可以看出，实施例2～5四种配方饮料(底料)均具有不错的抗氧化活性，其中实施例4～5配方的IC50值分别为0.0245mg/ml、0.0283mg/ml，较实施例2～3配方而言具有更好的抗氧化效果。
试验例4
本试验例测试了实施例2所得饮料对U118细胞和正常的3T3细胞的增殖抑制情况。
测试方法与试验例1相同，其中饮料浓度，是指按照U118细胞抑制剂的当量浓度计算，例如0.5mg/ml的饮料浓度，实际表示的是，添加饮料的量，满足U118细胞抑制剂的浓度是0.5mg/ml；
实施例2对3T3细胞的抑制情况如图4所示，对U118细胞的抑制情况如图5所示；
结果显示，饮料对两种细胞增殖的抑制情况与试验例相似，但是试验例1的靶向特异性更加明显，说明发明提供的U118细胞抑制剂可用于制备肿瘤防治药物，本发明提供的饮料也可以一定程度上预防胶质瘤的产生。
试验例5
本试验例测试了实施例2～5所得饮料的抗感染功效，测试方法为Kirby-Bauer，又名纸片扩散法，简称K-B法，常用于检验待测药物的抑菌活性，其原理是，将含有待测药物的抑菌圆片置于接种了受试菌的M-H琼脂培养基表面，待测药物会在琼脂培养基中扩散，菌种受到抑制从而形成透明抑菌圈，可以根据抑菌圈的大小，评价药物的抑菌活性。根据美国临床和实验室标准协会(NCCLS)抗生素药敏试验根据抑菌圈大小经敏感度划分为五个档次：极度敏感、高度敏感、中度敏感、低敏感和不敏感。
本试验例的具体操作过程为：实验采用的菌种为金黄色葡萄球菌(G+)、白葡萄球菌(G+)、枯草芽孢杆菌(G-)、铜绿假单胞菌(G-)、白色念球菌(真菌)，将其活化培养后，再挑选纯净菌落进行扩大化培养。本次实验对细菌数量的统计选用麦氏比浊管校正法，将扩大化培养后的五种单一测试菌种用蒸馏水配置的生理盐水进行浓度配比为1.5×108CFU/mL，在背景卡下对比麦氏浊度标准管校对至0.5号麦氏浊度管，完成后30min内使用。
实验选用抑菌纸片为无菌圆片，直径6mm，每个圆片含药量均为30μg/片。配置实施例2～5中所用饮料粉的浓度为1mg/mL，分别用移液器移取30μL于无菌圆形纸片上，自然风干后得到待测药液纸片。每组实验设置一个空白对照，仅移取30μg生理盐水不放置任何药液，之后将培养皿全部放置于恒温培养箱中37.5℃条件下培养24小时。为减少误差每组实验进行三次，在误差范围内的结果取平均值。
K-B法抑菌圈与敏感度的定义如表4所示。
表4K-B法抑菌圈与敏感度
敏感度 极度敏感 高度敏感 中度敏感 低敏感 不敏感
抑菌圈直径(mm) >20 15-20 10–15 <10 0
本试验例的测试结果如表5所示
表5实施例2～5所得饮料粉的抑菌效果
Figure BDA0003284312590000171
表5结果显示，木姜叶柯饮料具有较为广谱的抗菌活性，对革兰氏阳性，阴性和真菌均具有一定的抑制作用。这说明木姜叶柯饮料是一款天然的抗菌食品，具有抗感染功效，无需添加食品防腐剂亦可达到良好的保质作用。
综上可知，本发明提供的U118细胞抑制剂以及饮料均对U118细胞的增殖具有一定的抑制作用，而对正常细胞增殖的抑制作用不明显，说明具有一定放置胶质瘤的作用；具体的U118细胞抑制剂可用于制备防治胶质瘤的药物，而日常饮用饮料也可起到一定的防治作用；
此外，本发明所得的饮料，虽然不包括方糖、黑糖等糖类物质，但是甜度等口感俱佳，在于传统奶茶口感相似的前提下，降低了传统奶茶可能带来的肥胖等不健康问题；
最后，本发明提供的饮料，还具有抗氧化、抑菌的作用，可以在不填加防腐剂、抑菌剂的前提下，延长保质期，进一步保证了饮食健康。
上面结合附图对本发明实施例作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

Claims (10)

1.一种U118细胞抑制剂，其特征在于，制备原料包括木姜叶柯活性成分。
2.根据权利要求1所述的U118细胞抑制剂，其特征在于，所述木姜叶柯活性成分的提取方法包括以下步骤：
S1.对所述木姜叶柯的叶进行前处理；
S2.以乙醇-水混合液提取步骤S1所得木姜叶柯的叶；
S3.浓缩步骤S2所得提取液后冻干即得。
3.根据权利要求2所述的U118细胞抑制剂，其特征在于，步骤S1中，所述木姜叶柯的叶中，老叶和嫩叶的质量比为4：(3～5)。
4.根据权利要求2所述的U118细胞抑制剂，其特征在于，步骤S1中，所述前处理包括杀青、揉捻和干燥；
优选的，所述杀青的温度为220～260℃。
5.根据权利要求2所述的U118细胞抑制剂，其特征在于，步骤S2中，所述乙醇-水混合液中乙醇的体积含量为65％～75％；
优选的，步骤S2中，所述提取的次数为2～3次；
优选的，步骤S3中，所述提取液为步骤S2中3次提取获取提取液的混合物。
6.一种饮料，其特征在于，制备原料包括权利要求1～5任一项所述的U118细胞抑制剂。
7.根据权利要求6所述的饮料，其特征在于，所述饮料的制备原料还包括奶粉；优选的，所述饮料的制备原料还包括奇亚籽颗粒；优选的，所述饮料的制备原料还包括口味调节剂；优选的，所述口味调节剂包括甘草提取物和氯化钠；优选的，所述饮料的制备原料还包括水。
8.根据权利要求6所述的饮料，其特征在于，按重量份计，所述U118细胞抑制剂的用量为35～45份；所述水的用量为500～600份。
9.一种治疗胶质瘤的药物，其特征在于，制备原料包括权利要求1所述的U118抑制剂。
10.根据权利要求9所述的药物，其特征在于，所述物的剂型包括液体剂型、气体剂型和固体剂型中的至少一种。
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