CN113940207A - 一种基于高压输液诱导白木香结香的方法 - Google Patents

一种基于高压输液诱导白木香结香的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种基于高压输液诱导白木香结香的方法，包括以下步骤：(1)准备结香液：将芽孢八叠球菌接种至发酵培养基中，发酵产物离心后得微生物发酵液；将微生物发酵液与植物激素、无机盐、糖类、有机酸、鼠李糖脂混合，得结香液；(2)在白木香树上钻孔；(3)将结香液倒入输液瓶中，给输液瓶加压，将带有输液管的输液瓶挂于孔上方，将输液管塞入树孔内输液。本方法可以在高达0.35MPa的压力下快速完成输液，结香速度快，结香面积大，且结香效果好。

Description

一种基于高压输液诱导白木香结香的方法
技术领域
本发明属于生物农业技术领域，具体涉及一种基于高压输液诱导白木香结香的方法。
背景技术
白木香又称土沉香，为瑞香科沉香属植物，白木香在受到外界损伤或刺激的情况下会分泌树脂结香，这些含有树脂的木材被称为沉香。人们在生产实践中总结的结香方法包括物理法(雷劈、风折、砍伤、凿洞等)、化学诱导法、接菌法等，还进一步衍生出输液法。
一般的输液方法输液时间较长，效率不高。因此研究人员又进一步开发了高压输液法。但是目前的高压输液法存在一些缺陷，例如为了加快输液，增大了压力或钻孔的孔径，但是孔径过大容易出现漏气甚至漏液现象，而输液压力过大时，若结香液不能及时渗入树体中，则会出现倒流现象。专利文献CN105850543A公开一种白木香高压输液结香方法及其装置，具体为在树分枝点5-10cm处钻孔，使用加压的输液瓶向孔输液600～800毫升结香液；待结香液输完用塞子塞紧钻孔。该方法操作简单，利用高压枝干输液大大缩短结香液输入时间，不受天气和气候的影响，能在阴雨天实施，并且加压的输液方法在阴雨天的输液效率较普通输液法在适宜天气结香的效率提高30％。但是该方法仍需要在输液管上设置调节器调控液滴的流速，以避免因流速过快结香液无法及时渗入树体而导致倒流或漏液。因此，有必要对高压输液法进一步改进，以使得能够在更高压力下快速输液。
另外，目前高压输液法所使用的结香液中可添加微生物发酵液，但均为真菌发酵液，尚未发现采用细菌发酵液的案例。
发明内容
本发明提出一种改进的高压输液诱导白木香结香的方法。
本发明技术方案主要包括以下内容：
一种基于高压输液诱导白木香结香的方法，包括以下步骤：
(1)准备结香液：将芽孢八叠球菌接种至发酵培养基中，发酵产物离心后得微生物发酵液；将微生物发酵液与植物激素、无机盐、糖类、有机酸、鼠李糖脂混合，得结香液；
(2)在白木香树上钻孔；
(3)将结香液倒入输液瓶中，给输液瓶加压，将带有输液管的输液瓶挂于孔上方，将输液管塞入树孔内输液。
优选的，微生物发酵液在结香液中的质量浓度为30％～40％，鼠李糖脂在结香液中的质量浓度为3％～5％。
优选的，结香液含有质量浓度0.5％～2％的植物激素、4％～8％的无机盐、2％～4％的糖类、2％～12％有机酸、30％～40％微生物发酵液、3％～5％鼠李糖脂。
优选的，输液瓶中气体压力不高于0.35MPa。
优选的，发酵培养基含有以下成分：酵母提取物10～20g/L、胰蛋白胨5～10g/L、白木香叶2～4g/L、硫酸铵5～10g/L、硝酸钠1.0～2.0g/L。
优选的，发酵条件为：发酵温度35±2℃，发酵时间36～48h，转速180～240rpm。
优选的，白木香树龄为至少6年树龄。
优选的，孔直径为4～6mm。
优选的，所述芽孢八叠球菌为巴氏芽孢八叠球菌
本发明所取得的效果：
本方法优化结香液配方，该结香液可以快速渗入树体中，在高达0.35MPa的压力下快速完成输液。
本方法可以有效激活植物防御反应，结香速度快，结香面积大，且所得沉香中愈创木醇含量较高，结香效果好。
本方法筛选出可行的细菌发酵液，可用于替换目前的真菌发酵液，弥补结香技术领域中的空白。
具体实施方式
为了更好理解本发明技术内容，下面提供具体实施例，对本发明做进一步的说明。
本发明所述的植物激素为茉莉酸甲酯、乙烯利、6-BA和吲哚乙酸中的至少一种。在以下实例中选择的是6-BA和吲哚乙酸。
本发明所述的无机盐选自硫酸亚铁、乙酸钠、氯化钠和氯化钾中的至少一种。在以下实例中选择的是氯化钠。
本发明所述的糖类选自单糖、寡糖或多糖，在以下实例中选择的是蔗糖。
本发明所述的有机酸选自柠檬酸、苹果酸、酒石酸、琥珀酸、乳酸和乙酸中的至少一种，在以下实例中选择的是乙酸。
本发明所述白木香叶为新鲜成熟白木香叶。其粉碎后添加至培养基中。
本发明所述鼠李糖脂分子式为Rha2C10C10。
本发明中钻孔位置可以是树干或树分枝，在以下实例中选择的是树干钻孔。
本发明中巴氏芽孢八叠球菌菌液的浓度可选择(1～2)×106cfu/mL，在以下实例中选择1×106cfu/mL。
本发明中巴氏芽孢八叠球菌菌液的接种量可选择3～5wt％，在以下实例中选择接种量3wt％。发酵的条件可以是发酵温度35±2℃，发酵时间36～48h，转速180～240rpm，在以下实例中选择的是发酵温度35±2℃，发酵时间48h，转速240rpm。
本发明中最好选择至少6年树龄的白木香树进行高压诱导结香处理，在以下实例中选择的是6年树龄。
本发明结香液的输液体积可以是600～800mL，以下实例中选择600mL。
实施例1基于高压输液诱导白木香结香的方法
(1)准备结香液：
将浓度1×106cfu/mL的巴氏芽孢八叠球菌Sporosarcina pasteurii(MCCC1A08736)菌液按接种量3wt％接种至发酵培养基中摇瓶发酵，发酵温度35±2℃，发酵时间48h，转速240rpm。发酵结束后，发酵产物在25±2℃、3000rpm条件下离心，得到微生物发酵液。
发酵培养基含有以下成分：酵母提取物20g/L、胰蛋白胨10g/L、白木香叶2g/L、硫酸铵5g/L、硝酸钠2.0g/L和余量水。
结香液含有质量浓度1％6-BA、1％吲哚乙酸、8％的无机盐、4％的糖类、2％有机酸、40％微生物发酵液、5％鼠李糖脂和水；
(2)晴天，选取6年树龄白木香树，在距离树分枝点下方5～10cm处，使用4～6mm钻头斜向下呈30～45度角在树体上钻孔，孔深为树干直径的1/3至1/2；
(3)将600mL结香液倒入输液瓶中，用加压装置给输液瓶加压，使瓶内气体压力为0.30～0.35MPa，将带有输液管的输液瓶挂于孔上方约50cm处；
(4)输液管直径4～6mm，输液管上不设置液滴流速调节器，直接将输液管塞入树孔内使液体自然流入树孔中；35～45min输液完成，结香液输完后用塞子将孔塞紧。
实施例2基于高压输液诱导白木香结香的方法
(1)准备结香液：
将浓度1×106cfu/mL的巴氏芽孢八叠球菌Sporosarcina pasteurii(MCCC1A08736)菌液按接种量3wt％接种至发酵培养基中摇瓶发酵，发酵温度35±2℃，发酵时间48h，转速240rpm。发酵结束后，发酵产物在25±2℃、3000rpm条件下离心，得到微生物发酵液。
发酵培养基含有以下成分：酵母提取物20g/L、胰蛋白胨10g/L、白木香叶2g/L、硫酸铵5g/L、硝酸钠2.0g/L和余量水。
结香液含有质量浓度1％6-BA、1％吲哚乙酸、8％的无机盐、4％的糖类、2％有机酸、40％微生物发酵液、3％鼠李糖脂和水；
(2)晴天，选取6年树龄白木香树，在距离树分枝点下方5～10cm处，使用4～6mm钻头斜向下呈30～45度角在树体上钻孔，孔深为树干直径的1/3至1/2；
(3)将600mL结香液倒入输液瓶中，用加压装置给输液瓶加压，使瓶内气体压力为0.30～0.35MPa，将带有输液管的输液瓶挂于孔上方约50cm处；
(4)输液管直径4～6mm，输液管上不设置液滴流速调节器，直接将输液管塞入树孔内使液体自然流入树孔中；35～45min输液完成，结香液输完后用塞子将孔塞紧。
实施例3基于高压输液诱导白木香结香的方法
(1)准备结香液：
将浓度1×106cfu/mL的巴氏芽孢八叠球菌Sporosarcina pasteurii(MCCC1A08736)菌液按接种量3wt％接种至发酵培养基中摇瓶发酵，发酵温度35±2℃，发酵时间48h，转速240rpm。发酵结束后，发酵产物在25±2℃、3000rpm条件下离心，得到微生物发酵液。
发酵培养基含有以下成分：酵母提取物20g/L、胰蛋白胨10g/L、白木香叶2g/L、硫酸铵5g/L、硝酸钠2.0g/L和余量水。
结香液含有质量浓度1％6-BA、1％吲哚乙酸、8％的无机盐、4％的糖类、2％有机酸、30％微生物发酵液、5％鼠李糖脂和水；
(2)晴天，选取6年树龄白木香树，在距离树分枝点下方5～10cm处，使用4～6mm钻头斜向下呈30～45度角在树体上钻孔，孔深为树干直径的1/3至1/2；
(3)将600mL结香液倒入输液瓶中，用加压装置给输液瓶加压，使瓶内气体压力为0.30～0.35MPa，将带有输液管的输液瓶挂于孔上方约50cm处；
(4)输液管直径4～6mm，输液管上不设置液滴流速调节器，直接将输液管塞入树孔内使液体自然流入树孔中；35～45min输液完成，结香液输完后用塞子将孔塞紧。
实施例4基于高压输液诱导白木香结香的方法
(1)准备结香液：
将浓度1×106cfu/mL的巴氏芽孢八叠球菌Sporosarcina pasteurii(MCCC1A08736)菌液按接种量3wt％接种至发酵培养基中摇瓶发酵，发酵温度35±2℃，发酵时间48h，转速240rpm。发酵结束后，发酵产物在25±2℃、3000rpm条件下离心，得到微生物发酵液。
发酵培养基含有以下成分：酵母提取物10g/L、胰蛋白胨5g/L、白木香叶4g/L、硫酸铵10g/L、硝酸钠1.0g/L和余量水。
结香液含有质量浓度1％6-BA、1％吲哚乙酸、8％的无机盐、4％的糖类、2％有机酸、40％微生物发酵液、5％鼠李糖脂和水；
(2)晴天，选取6年树龄白木香树，在距离树分枝点下方5～10cm处，使用4～6mm钻头斜向下呈30～45度角在树体上钻孔，孔深为树干直径的1/3至1/2；
(3)将600mL结香液倒入输液瓶中，用加压装置给输液瓶加压，使瓶内气体压力为0.30～0.35MPa，将带有输液管的输液瓶挂于孔上方约50cm处；
(4)输液管直径4～6mm，输液管上不设置液滴流速调节器，直接将输液管塞入树孔内使液体自然流入树孔中；35～45min输液完成，结香液输完后用塞子将孔塞紧。
实施例5基于高压输液诱导白木香结香的方法
(1)准备结香液：
将浓度1×106cfu/mL的巴氏芽孢八叠球菌Sporosarcina pasteurii(MCCC1A08736)菌液按接种量3wt％接种至发酵培养基中摇瓶发酵，发酵温度35±2℃，发酵时间48h，转速240rpm。发酵结束后，发酵产物在25±2℃、3000rpm条件下离心，得到微生物发酵液。
发酵培养基含有以下成分：酵母提取物20g/L、胰蛋白胨10g/L、白木香叶2g/L、硫酸铵5g/L、硝酸钠2.0g/L和余量水。
结香液含有质量浓度1％6-BA、1％吲哚乙酸、8％的无机盐、4％的糖类、2％有机酸、40％微生物发酵液、1％鼠李糖脂和水；
(2)晴天，选取6年树龄白木香树，在距离树分枝点下方5～10cm处，使用4～6mm钻头斜向下呈30～45度角在树体上钻孔，孔深为树干直径的1/3至1/2；
(3)将600mL结香液倒入输液瓶中，用加压装置给输液瓶加压，使瓶内气体压力为0.30～0.35MPa，将带有输液管的输液瓶挂于孔上方约50cm处；
(4)输液管直径4～6mm，输液管上不设置液滴流速调节器，直接将输液管塞入树孔内使液体自然流入树孔中；35～45min输液完成，结香液输完后用塞子将孔塞紧。
实施例6基于高压输液诱导白木香结香的方法
(1)准备结香液：
将浓度1×106cfu/mL的巴氏芽孢八叠球菌Sporosarcina pasteurii(MCCC1A08736)菌液按接种量3wt％接种至发酵培养基中摇瓶发酵，发酵温度35±2℃，发酵时间48h，转速240rpm。发酵结束后，发酵产物在25±2℃、3000rpm条件下离心，得到微生物发酵液。
发酵培养基含有以下成分：酵母提取物20g/L、胰蛋白胨10g/L、白木香叶2g/L、硫酸铵5g/L、硝酸钠2.0g/L和余量水。
结香液含有质量浓度1％6-BA、1％吲哚乙酸、8％的无机盐、4％的糖类、2％有机酸、20％微生物发酵液、5％鼠李糖脂和水；
(2)晴天，选取6年树龄白木香树，在距离树分枝点下方5～10cm处，使用4～6mm钻头斜向下呈30～45度角在树体上钻孔，孔深为树干直径的1/3至1/2；
(3)将600mL结香液倒入输液瓶中，用加压装置给输液瓶加压，使瓶内气体压力为0.30～0.35MPa，将带有输液管的输液瓶挂于孔上方约50cm处；
(4)输液管直径4～6mm，输液管上不设置液滴流速调节器，直接将输液管塞入树孔内使液体自然流入树孔中；35～45min输液完成，结香液输完后用塞子将孔塞紧。
实施例7基于高压输液诱导白木香结香的方法
(1)准备结香液：
将浓度1×106cfu/mL的巴氏芽孢八叠球菌Sporosarcina pasteurii(MCCC1A08736)菌液按接种量3wt％接种至发酵培养基中摇瓶发酵，发酵温度35±2℃，发酵时间48h，转速240rpm。发酵结束后，发酵产物在25±2℃、3000rpm条件下离心，得到微生物发酵液。
发酵培养基含有以下成分：酵母提取物20g/L、胰蛋白胨10g/L、白木香叶0.5g/L、硫酸铵5g/L、硝酸钠2.0g/L和余量水。
结香液含有质量浓度1％6-BA、1％吲哚乙酸、8％的无机盐、4％的糖类、2％有机酸、40％微生物发酵液、5％鼠李糖脂和水；
(2)晴天，选取6年树龄白木香树，在距离树分枝点下方5～10cm处，使用4～6mm钻头斜向下呈30～45度角在树体上钻孔，孔深为树干直径的1/3至1/2；
(3)将600mL结香液倒入输液瓶中，用加压装置给输液瓶加压，使瓶内气体压力为0.30～0.35MPa，将带有输液管的输液瓶挂于孔上方约50cm处；
(4)输液管直径4～6mm，输液管上不设置液滴流速调节器，直接将输液管塞入树孔内使液体自然流入树孔中；35～45min输液完成，结香液输完后用塞子将孔塞紧。
实施例8基于高压输液诱导白木香结香的方法
参照CN105850543A的方法。
(1)准备结香液：
将浓度1×106cfu/mL的可可毛色二孢菌液按接种量3wt％接种至PDA液体培养基中摇瓶发酵，温度35±2℃，时间48h，转速240rpm。发酵结束后，发酵产物在25±2℃、3000rpm条件下离心，得到微生物发酵液。
结香液含有质量浓度1％6-BA、1％吲哚乙酸、8％的无机盐、4％的糖类、2％有机酸、40％微生物发酵液和水；
(2)晴天，选取6年树龄白木香树，在距离树分枝点下方5～10cm处，使用4～6mm钻头斜向下呈30～45度角在树体上钻孔，孔深为树干直径的1/3至1/2；
(3)将600mL结香液倒入输液瓶中，用加压装置给输液瓶加压，使瓶内气体压力为0.30～0.35MPa，将带有输液管的输液瓶挂于孔上方约50cm处；
(4)输液管直径4～6mm，输液管上不设置液滴流速调节器，直接将输液管塞入树孔内使液体自然流入树孔中；60～65min输液完成，结香液输完后用塞子将孔塞紧。
实施例8出现结香液倒流现象，阻碍结香液继续正向流动，流速变缓，约60min后方完成输液。实施例1～7可以在35～45min左右完成输液。
取以上实施例所得6个月产沉香，采用传统沉香鉴定方法，通过火烧和熏香炉加热均能闻到浓烈的沉香气味。依据《中国药典》的规定，采用醇溶性浸出物测定法项下的热浸法进行浸出物测定，每样品三次重复，结果取均值。结果见表1。结果显示发酵培养基、发酵液、鼠李糖脂均对结香效果有明显影响，其中，实施例1所得沉香浸出物含量最高，结香效果最好。
表1
浸出物含量(％)
样品1(实施例1) 28.62％
样品2(实施例2) 24.61％
样品3(实施例3) 25.48％
样品4(实施例4) 24.06％
样品5(实施例5) 17.61％
样品6(实施例6) 19.05％
样品7(实施例7) 22.95％
样品8(实施例8) 13.65％
结香6个月后观察，结果显示实施例1～4获得90～120cm中间不腐朽的点状香，实施例5～8获得50～85cm中间不腐朽的点状香。
检测结香6个月后所得沉香的特征化学成分，发现实施例1～8沉香样品的愈创木醇含量存在差异，其中实施例1～4样品愈创木醇含量最高。检测方法参见刘洋洋等《四批通体香沉香药材的挥发油成分分析》。
表2
愈创木醇相对含量(％)
样品1(实施例1) 13.26％
样品2(实施例2) 12.16％
样品3(实施例3) 11.29％
样品4(实施例4) 12.33％
样品5(实施例5) 8.67％
样品6(实施例6) 6.34％
样品7(实施例7) 7.94％
样品8(实施例8) 6.73％
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种基于高压输液诱导白木香结香的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)准备结香液：将芽孢八叠球菌接种至发酵培养基中，发酵产物离心后得微生物发酵液；将微生物发酵液与植物激素、无机盐、糖类、有机酸、鼠李糖脂混合，得结香液；
(2)在白木香树上钻孔；
(3)将结香液倒入输液瓶中，给输液瓶加压，将带有输液管的输液瓶挂于孔上方，将输液管塞入树孔内输液。
2.根据权利要求1所述基于高压输液诱导白木香结香的方法，其特征在于，微生物发酵液在结香液中的质量浓度为30％～40％，鼠李糖脂在结香液中的质量浓度为3％～5％。
3.根据权利要求1所述基于高压输液诱导白木香结香的方法，其特征在于，结香液含有质量浓度0.5％～2％的植物激素、4％～8％的无机盐、2％～4％的糖类、2％～12％有机酸、30％～40％微生物发酵液、3％～5％鼠李糖脂。
4.根据权利要求1所述基于高压输液诱导白木香结香的方法，其特征在于，输液瓶中气体压力不高于0.35MPa。
5.根据权利要求1所述基于高压输液诱导白木香结香的方法，其特征在于，发酵培养基含有以下成分：酵母提取物10～20g/L、胰蛋白胨5～10g/L、白木香叶2～4g/L、硫酸铵5～10g/L、硝酸钠1.0～2.0g/L。
6.根据权利要求1所述基于高压输液诱导白木香结香的方法，其特征在于，发酵条件为：发酵温度35±2℃，发酵时间36～48h，转速180～240rpm。
7.根据权利要求1所述基于高压输液诱导白木香结香的方法，其特征在于，白木香树龄为至少6年树龄。
8.根据权利要求1所述基于高压输液诱导白木香结香的方法，其特征在于，孔直径为4～6mm。
9.根据权利要求1所述基于高压输液诱导白木香结香的方法，其特征在于，所述芽孢八叠球菌为巴氏芽孢八叠球菌。
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