CN113933498A

CN113933498A - 一种检测黄原胶的双抗体夹心elisa方法

Info

Publication number: CN113933498A
Application number: CN202111098119.3A
Authority: CN
Inventors: 凌沛学; 尹梦月; 刘飞; 张小刚; 张秀华
Original assignee: Shandong University; Shandong Academy of Pharmaceutical Sciences
Current assignee: Shandong University; Shandong Academy of Pharmaceutical Sciences
Priority date: 2021-09-18
Filing date: 2021-09-18
Publication date: 2022-01-14
Anticipated expiration: 2041-09-18
Also published as: CN113933498B

Abstract

本发明涉及一种检测生物样本中黄原胶含量的双抗体夹心ELISA方法，属于免疫分析技术领域。本发明提供的一种生物样本中黄原胶含量的双抗体夹心ELISA检测方法，包括以下步骤：1)抗体包被；2)封闭；3)加样品；4)加酶标抗体；5)加显色液；6)加终止液；7)测定：用酶标仪测定波长450nm处的OD值；该方法具有较高的灵敏度，对黄原胶具有较好的特异性，定量准确，简单易用的特点，可用于生物样本中黄原胶含量的检测，具有实际应用价值，具有良好的推广性。

Description

一种检测黄原胶的双抗体夹心ELISA方法

技术领域

本发明属于免疫分析技术领域，尤其涉及一种检测黄原胶的双抗体夹心ELISA方法。

背景技术

黄原胶(Xanthan gum,XG)是由野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris)发酵制备的一种微生物胞外杂多糖，它是由D-葡萄糖、D-甘露糖和D-葡萄糖醛酸由2:2:1形成的重复的五糖单位。XG对各种酶有耐受性，在温度、pH和离子浓度范围内都非常稳定。并且XG在低浓度下具有高黏度和高假塑性，已广泛应用于医疗和制药领域。但是由于黄原胶结构复杂，既缺少生色基团，又缺乏光吸收基团，因此其在低浓度下检测存在非常大的困难，尤其是应用至体内，进行药物浓度检测的过程中，易受其他生物源成分干扰，致使建立有效的分析方法十分艰难。

如何建立稳定、高效的检测方法一直是困扰黄原胶体内外微量检测研究的主要问题，因此，建立一种专属型好、灵敏、快速、可靠的检测方法是非常必要的。

发明内容

本发明提供了一种检测样品中黄原胶的双抗体夹心ELISA方法，所述方法稳定性好、成本低、能同时检测大批量样本，为样品(尤其是，生物样品)中黄原胶的定性或定量检测提供了免疫学方法。

一方面，本发明提供了一种检测样品中黄原胶的双抗体夹心ELISA方法，所述方法包括如下步骤：

(1)利用抗黄原胶的3A7单抗作为包被抗体对酶标板进行包被；

(2)对酶标板进行封闭，之后，添加样品并孵育一段时间；

(3)添加酶标记的3A7单抗进行反应；

(4)显色后对酶标板进行检测。

本发明中，所述3A7单抗具有轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

在一个实施方式中，所述3A7单抗是鼠源抗体、人源抗体或嵌合抗体。

在优选的实施方式中，所述3A7单抗是小鼠抗体。

在一个实施方式中，所述3A7单抗还包括包含选自IgG1，IgG2，IgG3或IgG4的IgG的重链恒定区，优选，IgG2，例如，IgG2a。

本发明中，3A7单抗和3A7单克隆抗体的含义可以互换，均指代实施方式中得到的抗黄原胶的命名为3A7的单克隆抗体。

在一个实施方式中，所述黄原胶的相对分子质量为10万-1000万。

在一个实施方式中，所述样品选自食品、药物或生物样品；所述生物样品来源于人或动物的血浆、组织、关节滑液等。

在一个实施方式中，步骤(3)中所述酶标记的3A7单抗为辣根过氧化物酶(HRP)标记的3A7单抗。所述HRP标记抗体可以采用本领域公知的技术进行标记。

本发明所述检测样品中黄原胶的双抗体夹心ELISA方法可以是定性检测，也可以是定量检测。

在一个实施方式中，所述步骤(1)中，3A7单抗包被浓度为1μg/mL-100μg/mL，优选，5μg/mL-50μg/mL，更优选，10μg/mL。所述步骤(1)中包被抗体的温度为4℃-16℃，包被时间为12-24h。

在一个实施方式中，所述步骤(2)中，采用脱脂奶粉进行封闭；所述脱脂奶粉的浓度为1％-10％，优选，3％-5％；所述封闭的温度为20℃-28℃，例如，25℃；所述封闭的时间为30min-90min，例如，60min。

在一个实施方式中，所述步骤(2)中，样品孵育的时间为0.5h-2h，例如，1h、1.5h。

在一个实施方式中，所述步骤(3)中，所述酶标记的3A7单抗的稀释倍数为1:500-1:8000，优选，1:1000-1:5000，例如，1:2000；所述酶标记的3A7单抗的孵育时间为30min-90min，例如，45min、60min。

在一个实施方式中，所述步骤(4)中加入显色液进行显色，显色作用时间为10min-45min，例如，15min、30min。

在一个实施方式中，所述步骤(4)对酶标板进行检测为用酶标仪测定波长450nm处的OD值。

本发明建立了一种样品中黄原胶的双抗体夹心ELISA检测方法，可用于生物样本中黄原胶含量的检测。该方法与其他方法相比，操作简便，设备要求低，具有更好地实用性。

附图说明

图1.间接ELISA法筛选识别低分子量黄原胶的阳性克隆，其中筛选了600个克隆，阳性克隆40个，挑选较好的10个阳性克隆进行下一步复筛。

图2.单抗3A7的SDS-PAGE电泳图，其中M是蛋白分子量标准(kDa)，100/10/1为单抗的浓度，单位为μg/mL；

图3.本实施方式建立的ELISA方法检测黄原胶的标准曲线。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的说明，以下所述，仅是对本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明的技术实质对以下实施例所做的任何简单修改或等同变化，均落在本发明的保护范围内。

实施例1、抗低分子量黄原胶的3A7单克隆抗体的制备

一、杂交瘤细胞系的建立

实验材料：

免疫原：以相对分子量为100万的低分子量黄原胶偶联到载体蛋白上作为免疫原，免疫小鼠制备杂交瘤细胞获得。

培养基：DMEM培养基购于Hyclone公司；HAT、HT选择培养基、降植烷购于Sigma公司。

实验动物：BALB/c小鼠，8～12周龄，雌性，SPF级动物培养。

其他材料：福氏完全佐剂、福氏不完全佐剂购于Sigma公司；PEG4000购于Fluka公司；HRP-山羊抗小鼠IgG抗体购于JacksonImmune公司；其余试剂均为国产分析纯产品。

1、动物免疫

1)基础免疫：将抗原与福氏完全佐剂等体积混合并充分乳化，分点皮下注射，每只BALB/c小鼠每次注射量为100μg。

2)加强免疫：加强免疫采用抗原与福氏不完全佐剂的乳化液。在进行细胞融合前3天，经腹腔注射含150ug抗原的生理盐水溶液。

2、杂交瘤细胞的制备

按常规方法收集小鼠的脾细胞与SP2/0细胞按10:1的比例以500g/L的PEG4000进行融合。用HAT培养液选择培养，融合后10～15天，取上清采用间接ELISA法筛选分泌抗低分子量黄原胶抗原的杂交瘤细胞株。对所得阳性克隆株采用有限稀释法进行亚克隆。间接ELISA法的操作步骤如下：用200μL的低分子量黄原胶包板，用免疫小鼠血清1:2000作为阳性对照，无克隆生长的培养基上清和正常小鼠血清作为阴性对照，每孔加1:2000HRP-山羊抗小鼠IgG100μL，最后测定450nm OD值。凡OD450值大于阴性对照2倍以上者，即可初步判定为阳性克隆,共获得了40个阳性克隆，从中挑选出10个较好的阳性克隆，如图1所示。

3、杂交瘤细胞系的建立

经过4次亚克隆和间接ELISA或细胞ELISA筛选，得到1株针对低分子量黄原胶稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞系。

表1.复筛筛选阳性克隆(下划线为保留克隆)

Clone#	1E4	3A6	<u>3A7</u>	3C5	3G2	4C10	4D8	5A7	6G8	NC	PC
												OD	0.112	0.244	1.879	0.113	0.072	0.084	0.138	0.085	0.098	0.072	0.689

4、应用上述杂交瘤细胞系所得单抗的效价检测

1)小鼠腹水效价测定：间接ELISA法检测上述3A7杂交瘤细胞制备的腹水效价为：>1:20000000

2)纯化抗体效价测定：间接ELISA法检测上述杂交瘤细胞制备的纯化抗体效价为：>0.05ng/mL。

5、杂交瘤细胞系的传代培养

将上述杂交瘤细胞系在含有10％胎牛血清的DMEM培养基中继续进行培养、传代，培养到10代后，杂交瘤细胞系仍然能够生长良好、稳定传代，培养液上清效价仍然可以达到1:10000以上。

以上结果表明，所得杂交瘤细胞系能够稳定传代，可以持续、稳定分泌抗低分子量黄原胶的单克隆抗体。

二、单克隆抗体3A7的制备

1、抗体制备

选择成年BALB/c小鼠，腹腔接种降植烷，每只小鼠0.5mL。7～10天后腹腔接种第16代3A7杂交瘤细胞，每只小鼠1×10⁶～2×10⁶个。间隔5天后，待腹部明显膨大，以手触摸时，皮肤有紧张感，即可用9号针头采集腹水。

将腹水离心(13000r/min 30分钟)，除去细胞成分和其他的沉淀物，收集上清。用Protein G～Sepharose CL-4B进行纯化，上柱液为20mM的PBS缓冲液，柱层析洗脱液为：pH2.7,20mM的甘氨酸缓冲液，得到抗低分子量黄原胶的单克隆抗体。

2、抗体纯度鉴定：

SDS-PAGE电泳鉴定，纯度在95％以上，如图2所示。

3、抗体类及亚类鉴定：

采用间接ELISA法，使用抗小鼠各种Ig亚型的抗体鉴定上述杂交瘤细胞产生的抗体的Ig亚型，结果显示，clone3A7为IgG2a，如表2所示，Clone3A7显示IgG2a信号最强，依据亚型鉴定结果判定标准，Clone3A7为IgG2a亚型。

表2.单抗3A7的亚型鉴定结果

	3A7
		IgG1	0.0725
IgG2a	0.5172
		IgG2b	0.0703
IgG3	0.0744
		IgA	0.0696
IgM	0.0725

4、克隆3A7可变区序列测定

将两个克隆的细胞提取mRNA，反转录为cDNA，使用可变区通用引物进行高保真PCR扩增，将PCR产物片段插入到T载体内进行DNA序列测定，并将获得的序列翻译成蛋白质的氨基酸序列。Clone3A7的抗体的可变区氨基酸序列：轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，重链可变区氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。将该序列进行比对后未显示有相同序列，说明所获得的序列为克隆特异的序列，该单克隆抗体记为3A7。

实施例2、单抗3A7的亲合力及特异性验证

采用ELISA法对单克隆抗体3A7进行细胞亲和力试验，确定其与相对分子量为100万的低分子量黄原胶及其相关多糖分子的结合滴度。

检测方法：第一天进行低分子量黄原胶的铺板准备，每孔200uL铺到96孔中，过夜。第二天，去掉上清后，PBS洗3次，加入200uL/well 5％的脱脂牛奶封闭1h。PBS清洗三次后，加入梯度稀释的Clone3A7，37℃孵育1h后，PBS清洗三次后加入HRP(辣根过氧化物酶)标记的鼠二抗(1:2000)孵育1h后，PBS清洗5次(前三次5min，最后2次10min)加入显色剂显色15min上机检测OD450。

其中显色剂A液配方为每1000mL水中加入过氧化脲1g，10.3g柠檬酸，35.8g Na₂HPO₄·12H₂O，吐温-20 100μL，pH5；B液配方为每1000mL蒸馏水中加入四甲基联苯胺(TMB)700mg(40mL DMSO溶解)，10.3g柠檬酸，pH2.4。

表3.ELISA法检测结果

如表3所示，3A7滴度达到0.001ug/mL以上，显示较高的亲和力，且与其他相关多糖分子如透明质酸、小核菌胶等无明显特异性交叉，表现出高亲和力，高特异性，高灵敏度的特点。

实施例3、利用单抗3A7建立双抗体夹心ELISA检测黄原胶的方法

为了建立一种稳定性好、成本低、能同时检测大批量样本的方法，弥补其他实验方法的不足，本实施例中提供了一种黄原胶的检测方法，具体为双抗体夹心ELISA检测方法。

主要试剂：TMB显色液、终止液、0.01M的PBS缓冲液、PBST洗涤液、脱脂奶粉等从试剂公司购买。

溶液配制：

封闭液：1％脱脂奶粉：每100mLPBS加入1g脱脂奶粉，4℃保存；3％脱脂奶粉：每100mLPBS加入3g脱脂奶粉，4℃保存；5％脱脂奶粉：每100mLPBS加入5g脱脂奶粉，4℃保存；1％BSA：每100mLPBS加入1g脱脂奶粉，4℃保存；3％BSA：每100mLPBS加入3g脱脂奶粉，4℃保存；5％BSA：每100mLPBS加入5g脱脂奶粉，4℃保存。

器材：96孔聚苯乙烯塑料板(康为酶标板)；酶标仪；移液枪；加样槽。

所述双抗体夹心ELISA检测方法基本操作步骤：

(1)包被：用实施例1-2获得的3A7单克隆抗体作为包被抗体包被酶标反应板，用pH7.4、0.01M的PBS稀释液混匀后加入酶标板，100μL/孔，4℃过夜；

(2)封闭：用PBS洗涤反应板3次，甩干；加入100μL/孔封闭液，常温孵育1h；

(3)加样品：用PBS洗涤反应板1次，甩干；准备待测样品和标准品，另设一个PBS空白对照；每孔加入100μL样品，常温反应1h；

(4)加酶标抗体：用PBS洗涤反应板3次，甩干；在反应板内添加辣根过氧化物酶HRP标记的黄原胶3A7单克隆抗体作为酶标抗体，100μL/孔，常温反应1h；

(5)显色液：用PBS洗涤反应板3次，每次5min，PBST洗涤反应板2次，每次10min，甩干；加TMB显色液100μL/孔，显色15-20分钟；

(6)加终止液：加终止液100μL/孔；

(7)测定：用酶标仪测定波长450nm处的OD值；

(8)标准曲线的建立：建立黄原胶标准品浓度相对吸光度的标准曲线，根据标准曲线和待测样品的吸光度推算待测样品中黄原胶的实际浓度。

3.1包被抗体3A7最佳包被浓度的确定

用稀释液分别将被包被的抗体稀释浓度为1000、100、10、1、0.1、0.01μg/mL，按100μL/孔包被酶标板，4℃孵育过夜；PBS洗板3次，每孔加入100μL5％脱脂奶粉，常温孵育1h；PBS洗板1次，加入浓度为10μg/mL黄原胶，每孔100μL，常温孵育1h；PBS洗板3次，加入辣根过氧化物酶HRP标记的黄原胶3A7单克隆抗体，每孔100μL，常温孵育1h；PBS洗板3次，每次5min，PBST洗板2次，每次10min；加入显色液每孔100μL，常温显色15min后终止。读取每孔的OD_450nm值，结果如下表4所示，最终确定最佳包被抗体浓度为10μg/mL。

表4单抗3A7最佳包被浓度的确定结果

3.2最佳包被抗体条件的确定

用10μg/mL的抗体浓度包被酶标板，包被条件分为三组，第一组：37℃包被2h；第二组：4℃包被过夜；第三组：37℃包被2h+4℃包被过夜组。PBS洗板3次，每孔加入100μL5％脱脂奶粉，常温孵育1h；PBS洗板1次，加入浓度为10μg/mL黄原胶，每孔100μL，常温孵育1h；PBS洗板3次，加入辣根过氧化物酶HRP标记的黄原胶3A7单克隆抗体，每孔100μL，常温孵育1h；PBS洗板3次，每次5min，PBST洗板2次，每次10min；加入显色液每孔100μL，常温显色15min后终止。读取每孔的OD_450nm值，测定结果如表5所示，最终确定最佳包被条件为4℃包被过夜条件。

表5单抗最佳包被条件的确定

3.3最佳封闭条件的确定

用10μg/mL的抗体浓度包被酶标板，4℃包被过夜；PBS洗板3次，封闭条件按照下表6进行，PBS洗板1次，加入浓度为10μg/mL黄原胶，每孔100μL，常温孵育1h；PBS洗板3次，加入辣根过氧化物酶HRP标记的黄原胶3A7单克隆抗体，每孔100μL，常温孵育1h；PBS洗板3次，每次5min，PBST洗板2次，每次10min；加入显色液每孔100μL，常温显色15min后终止。读取每孔的OD_450nm值，测定结果如表6所示，最终确定最佳封闭液为5％脱脂奶粉，常温孵育1h。

表6最佳封闭条件确定结果

3.4样品孵育时间的确定

用10μg/mL的抗体浓度包被酶标板，4℃包被过夜；PBS洗板3次，封闭条件按照下表3进行，PBS洗板1次，加入浓度为10μg/mL黄原胶样品，每孔100μL，分别按照常温孵育0.5h、1h、1.5h、2h条件进行；PBS洗板3次，加入辣根过氧化物酶HRP标记的黄原胶3A7单克隆抗体，每孔100μL，常温孵育1h；PBS洗板3次，每次5min，PBST洗板2次，每次10min；加入显色液每孔100μL，常温显色15min后终止。读取每孔的OD_450nm值，测定结果如表7所示，最终确定最佳样品孵育时间为常温孵育1h。

表7最佳样品孵育时间的确定

3.5酶标单抗最佳稀释倍数的确定

用PBS将抗体浓度稀释为10μg/mL，按照100μL/孔包被酶标板，4℃包被过夜；PBS洗板3次，加入5％脱脂奶粉常温封闭1h；PBS洗板1次，加入不同浓度的黄原胶和待测样品，每孔100μL，常温孵育1h；PBS洗板3次，分别加入辣根过氧化物酶HRP标记的黄原胶3A7单克隆抗体，稀释倍数为1：100、1：500、1：1000、1：2000、1：4000、1：6000、1：8000、1：10000，每孔100μL，常温孵育1h；PBS洗板3次，每次5min，PBST洗板2次，每次10min；加入显色液每孔100μL，常温避光显色15min后终止。读取每孔的OD_450nm值，在P/N值最大时，确定酶标单抗的最佳稀释倍数。测定结果如表8所示，酶标抗体最佳稀释倍数为1:2000。

表8酶标抗体最佳稀释倍数的确定结果

3.6酶标单抗最佳孵育时间的确定

用PBS将抗体浓度稀释为10μg/mL，按照100μL/孔包被酶标板，4℃包被过夜；PBS洗板3次，加入5％脱脂奶粉常温封闭1h；PBS洗板1次，加入不同浓度的黄原胶和待测样品，每孔100μL，常温孵育1h；PBS洗板3次，分别加入辣根过氧化物酶HRP标记的黄原胶3A7单克隆抗体，稀释倍数为1：2000，每孔100μL，孵育时间按照15min，30min，45min，60min进行；PBS洗板3次，每次5min，PBST洗板2次，每次10min；加入显色液每孔100μL，常温避光显色15min后终止。读取每孔的OD_450nm值，在P/N值最大时，确定酶标单抗的最佳孵育时间。测定结果如表9所示，酶标抗体最佳孵育时间为60min。

表9酶标抗体最佳孵育时间的确定结果

3.7底物显色作用时间的确定

用PBS将抗体浓度稀释为10μg/mL，按照100μL/孔包被酶标板，4℃包被过夜；PBS洗板3次，加入5％脱脂奶粉常温封闭1h；PBS洗板1次，加入不同浓度的阳性血浆和待测样品，每孔100μL，常温孵育1h；PBS洗板3次，分别加入辣根过氧化物酶HRP标记的黄原胶3A7单克隆抗体，稀释倍数为1：2000，每孔100μL，常温孵育1h；PBS洗板3次，每次5min，PBST洗板2次，每次10min；加入显色液每孔100μL，按照表10的条件进行避光显色后终止。读取每孔的OD_450nm值，在P/N值最大时，确定酶标单抗的最佳孵育时间。测定结果如表10所示，底物最佳显色时间为15min。

表10底物显色作用时间确定结果

综上，本发明通过优化的双抗体夹心ELISA检测黄原胶的方法的具体步骤如下：

(1)包被：用实施例1-2得到的3A7单克隆抗体作为包被抗体包被酶标反应板，用pH7.4、0.01M的PBS稀释液混匀后加入酶标板，100μL/孔，4℃过夜；

(4)加酶标抗体：用PBS洗涤反应板3次，甩干；在反应板内添加辣根过氧化物酶HRP标记的3A7单克隆抗体作为酶标抗体，100μL/孔，常温反应1h；

(6)加终止液：加终止液100μL/孔；

(7)测定：用酶标仪测定波长450nm处的OD值；

通过抗体包被中黄原胶单克隆抗体包被浓度的确定，分别用浓度为1000、100、10、1、0.1、0.01μg/mL，确定最佳包被浓度为10μg/mL。通过3种包被抗体条件37℃包被2h、4℃包被过夜和37℃包被2h条件加4℃包被过夜进行检测，确定包被抗体条件为4℃包被过夜条件。

通过已经确定的抗体包被浓度与抗体包被条件进行步骤(2)封闭条件的确定，分别通过1％BSA、3％BSA、5％BSA、1％脱脂奶粉、3％脱脂奶粉、5％脱脂奶粉以及常温1h、37℃1h、4℃过夜作为封闭条件进行检测，确定最佳封闭条件为5％脱脂奶粉，常温1h。

通过已经确定的抗体包被浓度、抗体包被条件与封闭条件进行步骤(3)样品孵育时间的确定，分别通过0.5h、1h、1.5h、2h的样品孵育时间进行检测，确定最佳样品孵育时间为1h。

通过已经确定的抗体包被浓度、抗体包被条件、封闭条件与样品孵育时间进行步骤(4)中酶标抗体的稀释倍数与作用时间的确定，分别通过稀释倍数为1：100、1：500、1：1000、1：2000、1：4000、1：6000、1：8000、1：10000的辣根过氧化物酶HRP标记的黄原胶3A7单克隆抗体以及15min、30min、45min、60min的酶标抗体孵育时间进行检测，确定最佳酶标抗体的稀释倍数为1：2000与最佳作用时间为60min。

通过已经确定的抗体包被浓度、抗体包被条件、封闭条件、样品孵育时间、酶标抗体的稀释倍数与作用时间进行步骤(5)的加显色液后底物显色作用时间的确定，分别通过15min、30min、45min、60min的底物显色时间进行检测，确定最佳底物显色作用时间为15min。

通过所述步骤(6)测定结束后，在酶标仪测量OD_450nm值。测定结束后进行ELISA检测方法的验证，结果判定的标准：ELISA特异性试验；ELISA灵敏度试验；ELISA重复性试验；临床样本检测；统计学分析。

实施例4、基于单抗3A7的双抗体夹心ELISA检测黄原胶方法的效果评价和实际应用

样本采集：

本检测方法的血浆样本为大鼠颈静脉采血和腹腔动脉采血获得，作为阳性血浆样本，以正常大鼠血浆为阴性血浆样本。

ELISA结果判定的标准：

取上述的阴性血浆样本10份，每个样本做3个平行孔，用实施例3建立的ELISA方法进行检测，计算OD_450nm平均值和标准差(SD)。以样本的OD_450nm值平均值+3SD为阳性临界值。测定10份阴性血浆中OD_450nm的平均值为0.0631，标准方差为0.018，阴性与阳性血浆样本的临界值为0.1171。因此，当检测的血浆样本OD_450nm＞0.117，且P/N≥2时，判定为阳性，否则判为阴性。

ELISA特异性实验：

用建立的ELISA检测方法进行检测，检测低分子量黄原胶(相对分子量为100万)、透明质酸、血蓝蛋白、壳聚糖、和牛血清白蛋白，判断其结果是否为阴性，从而确定该方法的特异性。结果如表11所示，透明质酸、血蓝蛋白、壳聚糖和牛血清白蛋白检测均为阴性，低分子量黄原胶检测为阳性，表明该ELISA方法特异性较好。

表11特异性实验检测结果

ELISA灵敏度实验：

用PBS稀释浓度为1％低分子量黄原胶样品，稀释倍数为1：10，1：100，1：500，1：1000，1：5000，1：10000，1：100000，1：1000000。用实施例3的ELISA方法进行检测，确定其最低可以检测的低分子量黄原胶浓度，从而确定该方法的灵敏度。如表12所示，随着低分子量黄原胶浓度的降低，其OD_450nm值呈下降趋势，当低分子量黄原胶浓度低于100ng/mL时，OD_450nm曲线趋于平稳，表明该ELISA方法的最低检测限为100ng/mL。

表12 ELISA方法最低检测限结果

ELISA重复性实验：

选择上述阳性血清样本各5份进行板内和板间重复性试验。确定检测符合率，并计算变异系数(CV＝(SD÷MN)×100％)。板内重复性试验结果见表13，计算其变异系数在0.42％-2.19％。板间重复性试验结果见表14，计算其变异系数在1.12％-2.53％。两个重复性试验的变异系数均小于10％，说明本试验建立的双抗体夹心ELISA法具有良好的重复性。

表13板内重复性实验结果

注：SD表示标准差；Mean表示算术平均值；CV表示变异系数，CV％＝SD/Mean。同下。

表14板间重复性实验结果

标准曲线的建立：

分别将低分子量黄原胶稀释至浓度为2000、1000、500、250、125、0pg/mL，用建立的ELISA方法进行检测。以标准物的浓度为横坐标，OD值为纵坐标，在坐标纸上绘出标准曲线，如图3所示。

样本检测：

将收集到的样本通过本研究建立的双抗体夹心ELISA方法进行检测，结果见表15。

表15双抗体夹心ELASA方法检出的20份样本的OD_450nm结果

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东大学、山东省药学科学院

<120> 一种检测黄原胶的双抗体夹心ELISA方法

<130> 111

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 113

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> light

<400> 1

Glu Val Gln Leu Arg Gln Ser Gly Ala Asp Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Tyr

20 25 30

Tyr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Thr Ile Cys Asp Pro Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Tyr Ser Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser

100 105 110

Ala

<210> 2

<211> 222

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Heavy

<400> 2

Asn Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Ser Tyr

20 25 30

Gly Asn Ser Phe Met His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asp

65 70 75 80

Pro Val Glu Ala Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn

85 90 95

Glu Asp Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Asn

100 105 110

Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly Gln

115 120 125

Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Ser Tyr Gly

130 135 140

Asn Ser Phe Met His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys

145 150 155 160

Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala Arg

165 170 175

Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asp Pro

180 185 190

Val Glu Ala Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn Glu

195 200 205

Asp Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

210 215 220

Claims

1.一种检测样品中黄原胶的双抗体夹心ELISA方法，所述方法包括如下步骤：

(1)利用抗黄原胶的3A7单克隆抗体作为包被抗体对酶标板进行包被；

(2)对酶标板进行封闭，之后，添加待测样品并孵育一段时间；

(3)添加酶标记的3A7单克隆抗体进行反应；

(4)显色后对酶标板进行检测；

所述3A7单克隆抗体具有轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述样品选自食品、药物或生物样品。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述3A7单克隆抗体包被浓度为1μg/mL-100μg/mL，所述包被抗体的温度为4℃-16℃。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，采用脱脂奶粉进行封闭；所述封闭的温度为20℃-28℃。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，样品孵育的时间为0.5h-2h。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，采用辣根过氧化物酶(HRP)标记3A7单克隆抗体。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)中，加入显色液进行显色，显色作用时间为10min-45min。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)中，对酶标板进行检测为采用酶标仪测定波长450nm处的OD值。

9.根据权利要求1-8任一所述的方法，其特征在于，所述黄原胶为相对分子质量为10万-1000万的黄原胶。

10.权利要求1-9任一所述的方法在定性检测或定量检测样品中黄原胶中的应用。