CN113933413A - 更昔洛韦中杂质k的检测方法、及杂质的分离方法 - Google Patents

更昔洛韦中杂质k的检测方法、及杂质的分离方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种更昔洛韦中杂质K的检测方法、及杂质的分离方法,其包括如下步骤:采用高效液相色谱检测含更昔洛韦的供试品溶液;所述高效液相色谱采用的色谱柱为阳离子交换色谱柱,流动相包括流动相A和流动相B,流动相A为含0.012M磷酸二氢铵的磷酸水溶液;所述磷酸水溶液中,所述磷酸的体积百分比为0.12%;流动相B为乙腈,结合特定洗脱方式下,该方法不仅能实现杂质K的有效分离和检测,且其他已知杂质洗脱完全,有助于色谱柱寿命。

Description

更昔洛韦中杂质K的检测方法、及杂质的分离方法
技术领域
本发明涉及一种更昔洛韦中杂质K的检测方法、及杂质的分离方法。
背景技术
更昔洛韦是一种核苷类抗病毒药,其已知含有杂质A、B、C、D、E、F、H、I、J、L、M、N、R,这些杂质的具体结构如下:
Figure BDA0003282350770000011
Figure BDA0003282350770000021
Figure BDA0003282350770000031
其中,杂质K为可能的降解杂质,在有关物质条件下与更昔洛韦峰难以实现分离。因此有必要单独建立方法对杂质K控制,并同时将其它已知杂质洗脱下来,以免造成色谱柱中其它杂质残留,影响后续操作和色谱柱寿命。但目前对于更昔洛韦的有关物质检测方法中,可以同时实现杂质K的分离检测并将所有已知杂质洗脱完全的方法,尚未见报道。
发明内容
本发明要解决的技术问题是为了克服现有技术中对更昔洛韦的有关物质检测中尚无同时实现杂质K分离且其他已知杂质洗脱完全的方法的缺陷,而提供了一种更昔洛韦中杂质K的检测方法、及杂质的分离方法。
本发明在研究过程中,发明人根据更昔洛韦的合成工艺路线,结合更昔洛韦原料药国内外药典有关物质的控制情况,对更昔洛韦原料的杂质进行全面分析,按照杂质分析结果,对已知杂质A、B、C、D、E、F、H、I、J、L、M、N、R进行研究,通过重现更昔洛韦国内外主要药典及注射用更昔洛韦进口注册标准的有关物质方法,结果发现,重现欧洲药典第9.6版(EP9.6)中更昔洛韦质量标准,杂质K与主峰未分开,影响样品检测;重现中国药典2015年版(ChP2015)中更昔洛韦质量标准,并未能洗脱所有杂质,容易造成色谱柱中杂质残留,影响色谱柱寿命;重现注射用更昔洛韦进口质量标准(标准号:JX20110078),未能洗脱所有杂质,这样容易造成色谱柱中杂质残留,影响色谱柱寿命。
本发明是通过下述技术方案来解决上述技术问题:
一种更昔洛韦中杂质K的检测方法,其包括如下步骤:采用高效液相色谱检测含更昔洛韦的供试品溶液;
所述高效液相色谱采用的色谱柱为阳离子交换色谱柱;
所述高效液相色谱的洗脱方式如下:
Figure BDA0003282350770000041
其中,
上述%是指体积百分比;
流动相A为含0.012M磷酸二氢铵的磷酸水溶液;所述磷酸水溶液中,所述磷酸的体积百分比为0.12%,%是指磷酸的体积占所述磷酸水溶液的体积的百分比;
流动相B为乙腈。
本发明中,所述更昔洛韦按照本领域常规理解可包括更昔洛韦原料药和/或注射用更昔洛韦。
本发明中,所述杂质K的化学名称为:1,9-二氢-2-氨基-9–[(2-羟基乙氧基)甲基]-6H-嘌呤-6-酮,结构式如下:
Figure BDA0003282350770000042
本发明中,所述高效液相色谱中,采用的色谱柱为阳离子交换色谱柱,较佳地为SCX强阳离子交换柱,更佳地为C18色谱柱。
其中,所述C18色谱柱的规格较佳地为柱长250mm×内径4.6mm;所述C18色谱柱的填料粒径较佳地为5μm。
例如:所述C18色谱柱的型号为月旭AQ-C18,规格为250×4.6mm,5μm。
本发明中,所述高效液相色谱中,检测波长可为本领域常规,例如254±2nm。
本发明中,所述高效液相色谱中,流动相的流速可为本领域常规,例如1.0±0.05ml/min。
本发明中,所述高效液相色谱中,色谱柱的柱温可为本领域常规,例如25±10℃。
本发明中,所述高效液相色谱中,所述供试品溶液中更昔洛韦的质量浓度可为本领域常规,例如0.3±0.02mg/ml,其中,mg/ml是指更昔洛韦的质量占供试品溶液的体积的比。
本发明中,所述高效液相色谱中,所述供试品溶液中用于溶解更昔洛韦的溶剂可为本领域常规,较佳地,所述溶剂为所述流动相A;
所述供试品溶液可按照本领域常规的配置方法进行配置,例如,配置方法如下:将约15mg更昔洛韦置于50ml量瓶中,加所述流动相A溶解并稀释至刻度,摇匀,即得。
所述流动相A由以下方法制备得到:取磷酸二氢铵约1.38g,加水500ml,然后加磷酸1.2ml溶解,用水稀释至1000ml。
本发明还提供一种更昔洛韦中杂质的分离方法,其包括如下步骤:采用高效液相色谱检测含更昔洛韦的供试品溶液;
所述高效液相色谱采用的色谱柱为阳离子交换色谱柱;
所述高效液相色谱的洗脱方式如下:
Figure BDA0003282350770000051
Figure BDA0003282350770000061
其中,
上述%是指体积百分比;
流动相A为含0.012M磷酸二氢铵的磷酸水溶液;所述磷酸水溶液中,所述磷酸的体积百分比为0.12%,%是指磷酸的体积占所述磷酸水溶液的体积的百分比;
流动相B为乙腈。
本发明中,所述色谱柱、检测波长、流动相的流速、色谱柱的柱温、供试品的质量浓度、供试品的溶剂均如前所述。
在符合本领域常识的基础上,上述各优选条件,可任意组合,即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于:
1)本发明提供的更昔洛韦中杂质K的检测方法、及杂质的分离方法,优势在于,可实现单独检测杂质K(线性范围可达0.02μg/ml~0.30μg/ml,检测限可达0.006μg/ml),保证杂质K与相邻峰分离度,且能满足所有杂质在梯度条件下洗脱完全,不至于污染色谱柱。
2)本发明的方法,在给定的条件下,空白不干扰杂质K检测,系统适用性溶液中杂质K与其前相邻杂质峰间的分离度符合要求,所有待测物质均在本发明的方法中洗脱出来,该方法可行。且经试验验证,该方法回收率高(103.99%~107.66%)、各降解条件下不干扰、方法耐用、稳定、重复性良好、精密度良好。
附图说明
图1为效果实施例中专属性试验中将实施例1的方法对混合对照品溶液进行检测的高效液相色谱图。
图2为对比例1的检测方法获得的高效液相色谱图。
图3为对比例2的检测方法获得的高效液相色谱图。
图4为对比例3的检测方法获得的高效液相色谱图。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明,但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。
以下实施例和对比例中,更昔洛韦原料药购自湖北益泰药业股份有限公司。
实施例1
一种更昔洛韦原料药中杂质K的检测方法,具体步骤如下:
1.溶液的配制
供试品溶液:取更昔洛韦原料药约15mg,精密称定,置50ml量瓶中,加流动相A溶解并稀释至刻度,摇匀,即得。
对照品溶液:取杂质K对照品约15mg,精密称定,置100ml量瓶中,加流动相A溶解并稀释至刻度,摇匀;精密量取1ml,置100ml量瓶中,用流动相A稀释至刻度,摇匀,精密量取1ml,置10ml量瓶中,用流动相A稀释至刻度,摇匀,即得。
2.色谱条件
色谱柱:月旭AQ-C18 250×4.6mm,5μm
流动相:流动相A:取磷酸二氢铵约1.38g,加水500ml,然后加磷酸1.2ml溶解,用水稀释至1000ml(即磷酸二氢铵的浓度为0.012mol/L);流动相B:乙腈
波长:254nm
进样量:20μl
流速:1.0ml/min
柱温:室温
3.梯度洗脱程序:
Figure BDA0003282350770000081
效果实施例
对实施例1的方法从专属性、线性关系、定量限、检测限、耐用性、溶液稳定性、回收率、重复性、中间精密度、进样精密度等方面进行研究,结果如下表1:
表1实施例1的杂质K检测方法验证结果
Figure BDA0003282350770000082
Figure BDA0003282350770000091
(1)专属性试验
①空白干扰、分离度及系统适用性试验
空白溶剂:流动相A
杂质A对照品定位溶液:取杂质A对照品约1mg,置10ml量瓶中,加流动相A溶解并稀释至刻度,摇匀,即得。杂质B、I、J、N、C、M、K、E、F、H对照品定位溶液的配制同杂质A对照品定位溶液。
杂质L对照品定位溶液:取杂质L对照品约1mg,置10ml量瓶中,加乙腈5ml溶解并用流动相A稀释至刻度,摇匀,即得。
混合对照品溶液:取更昔洛韦原料药6mg,置20ml量瓶中,分别精密加入杂质A、B、C、E、F、H、I、J、K、L、M、N对照品定位溶液1ml,用流动相A稀释至刻度,摇匀,即得。
供试品溶液:取更昔洛韦原料药约15mg,置50ml量瓶中,加流动相A溶解并稀释至刻度,摇匀,即得。
精密量取空白溶剂、各杂质定位溶液、混合对照品溶液及供试品溶液各20μl,照杂质K检测色谱条件,分别注入液相色谱仪,记录色谱图,考察空白溶剂、各已知杂质及更昔洛韦峰的分离情况。试验结果见表2,实施例1的方法对混合对照品溶液的检测图谱参见图1。
表2专属性-空白干扰及分离度试验结果
Figure BDA0003282350770000101
试验结果及分析:空白溶剂、已知杂质及更昔洛韦峰均能够与杂质K完全分离,不干扰杂质K的检测。
②降解试验
采用强碱、强酸、强氧化剂、高温、高湿及强光照射对更昔洛韦原料药进行降解试验,考察样品可能生成杂质K的降解途径、强制降解样品中各降解杂质对杂质K的干扰情况。
杂质K对照品储备液:称取杂质K对照品约15mg,精密称定,置100ml量瓶中,加流动相A溶解并稀释至刻度,摇匀;精密量取1ml,置100ml量瓶中,用流动相A稀释至刻度,摇匀,即得。
杂质K对照品溶液:量取杂质K对照品储备液1ml,置10ml量瓶中,用流动相A稀释至刻度,摇匀,即得。
未降解供试品溶液:取更昔洛韦原料药约15mg,精密称定,置50ml量瓶中,加流动相A溶解并稀释至刻度,摇匀,即得。
降解供试品溶液制备方法见下表3,照更昔洛韦有关物质检查方法,精密量取上述未降解供试品溶液、空白溶液、降解空白溶液及降解供试品溶液各20μl,分别注入液相色谱仪,采用PDA检测器检测,记录色谱图。试验结果见下表4。
表3降解条件及降解试验溶液制备方法
Figure BDA0003282350770000111
Figure BDA0003282350770000121
表4降解试验结果
Figure BDA0003282350770000122
试验结果及分析:更昔洛韦原料药在各降解条件下均未降解出杂质K,且各降解条件下其他降解产物不干扰杂质K峰检测,证明该方法适用更昔洛韦原料药杂质K的检测,表明方法的专属性良好。
(2)线性与范围试验
杂质K对照品储备液:称取杂质K对照品约15mg,精密称定,置100ml量瓶中,加流动相A溶解并稀释至刻度,摇匀;精密量取1ml,置100ml量瓶中,用流动相A稀释至刻度,摇匀,即得。
取线性试验储备溶液(即上述“杂质K对照品储备液”)适量,用流动相A稀释成定量限浓度的溶液(定量限浓度可从以下第(3)点中获得),作为杂质K线性溶液1;分别精密量取线性试验储备液0.5、1.0、1.5、2ml,置10ml量瓶中,加流动相A稀释至刻度,摇匀,作为杂质K线性溶液2、3、4、5,即得。
按照更昔洛韦杂质K检测方法,精密量取上述杂质K线性溶液1-5各20μl(分别标为样品1-5),注入液相色谱仪,记录色谱图,测定杂质K的峰面积。以浓度(μg/ml)为横坐标,峰面积为纵坐标进行线性回归,得线性回归方程。线性与范围试验结果见下表5。
表5线性与范围试验结果
Figure BDA0003282350770000131
*以上“相当于供试品溶液浓度”计算方法如下:相当于供试品溶液浓度=杂质K浓度/更昔洛韦供试品溶液浓度。
试验结果及分析:杂质K在0.02μg/ml~0.30μg/ml(相当于供试品溶液浓度的0.006%~0.099%)浓度范围内,线性相关系数r为0.9997,截距为4.08%,小于25%,线性关系良好。
(3)定量限、检测限试验
取上述第(2)点“线性与范围试验”项中的溶液杂质K线性溶液,用流动相A逐级稀释成系列浓度的溶液,按照实施例1中杂质K检测方法的色谱条件,分别精密量取20μl,注入液相色谱仪,记录色谱图,以信噪比不低于10∶1确定为定量限,以信噪比不低于3∶1确定为检测限。试验结果见表6。
表6有关物质方法学定量限检测限试验结果
Figure BDA0003282350770000141
试验结果及分析:杂质K的定量限为0.006%,限度为0.05%,能够满足杂质K检测要求,灵敏度高。
(4)耐用性试验
溶剂:流动相A
杂质K对照品储备液:称取杂质K对照品约15mg,精密称定,置100ml量瓶中,加流动相A溶解并稀释至刻度,摇匀;精密量取1ml,置100ml量瓶中,用流动相A稀释至刻度,摇匀,即得。
杂质E对照品储备液:称取杂质E对照品约1mg,置10ml量瓶中,加流动相A溶解并稀释至刻度,摇匀;精密量取1ml,置20ml量瓶中,用流动相A稀释至刻度,摇匀,即得。
加样供试品溶液:取更昔洛韦原料药约15mg,精密称定,置50ml量瓶中,精密加入杂质K、E对照品储备液各5ml,再加流动相A溶解并稀释至刻度,摇匀,即得。
杂质K对照品溶液:精密量取杂质K对照品储备液1ml,置10ml量瓶中,用流动相A稀释至刻度,混匀,即得。
分别通过改变柱温(15℃~35℃)、流速(1.0ml/min±0.05ml/min)、检测波长(254nm±2nm)及不同厂家色谱柱(广州研创生物科技有限公司RC-C18 250mm*4.6mm*5um)来考察方法的耐用性。
按照更昔洛韦杂质K检测方法的色谱条件,精密量取空白溶液、加样供试品溶液及杂质K对照品溶液各20μl,注入液相色谱仪,记录色谱图,考察混合溶液色谱图中各峰之间的分离度及检出的杂质K含量是否一致。试验结果见表7。
表7耐用性试验结果
Figure BDA0003282350770000151
Figure BDA0003282350770000161
试验结果及分析:在色谱条件微小变动下,各条件下杂质K与其他组分之间均能够完全分离,杂质K含量的RSD值小于16%,方法耐用。
(5)溶液稳定性试验
①供试品溶液稳定性
供试品溶液:取更昔洛韦原料药约15mg,精密称定,置50ml量瓶中,加流动相A溶解并稀释至刻度,摇匀,即得。
将供试品溶液在室温下放置,于配制后0、2、4、8、12小时分别精密量取20μl,照杂质K检测方法的色谱条件,注入液相色谱仪,记录色谱图,考察12小时内供试品溶液室温的稳定性。试验结果见表8。
表8供试品溶液稳定性试验结果
Figure BDA0003282350770000162
注*:峰面积变化率为
Figure BDA0003282350770000163
的绝对值。
试验结果及分析:供试品溶液在室温放置过程中,杂质K峰面积无明显变化,溶液稳定。
②对照品溶液稳定性
对照品溶液:称取杂质K对照品约15mg,精密称定,置100ml量瓶中,加流动相A溶解并稀释至刻度,摇匀;精密量取1ml,置100ml量瓶中,用流动相A稀释至刻度,摇匀,精密量取1ml,置10ml量瓶中,用流动相A稀释至刻度,混匀,即得。
将对照品溶液于室温放置,分别于0、2、4、8、12小时,照杂质K检测方法的色谱条件,精密量取20μl,注入液相色谱仪,记录色谱图,统计各时间点的峰面积。试验结果见表9。
表9对照品溶液稳定性试验结果
Figure BDA0003282350770000171
试验结果及分析:对照品溶液于室温放置12小时,杂质K峰面积的RSD值小于2.0%,室温12小时内对照品溶液稳定。
(6)回收率试验
杂质K对照品储备液:称取杂质K对照品约15mg,精密称定,置100ml量瓶中,加流动相A溶解并稀释至刻度,摇匀;精密量取1ml,置100ml量瓶中,用流动相A稀释至刻度,摇匀,即得。
杂质K对照品溶液:精密量取杂质K对照品储备液1ml,置10ml量瓶中,用流动相A稀释至刻度,混匀,即得。
供试品溶液:取更昔洛韦原料药约15mg,精密称定,置50ml量瓶中,加流动相A溶解并稀释至刻度,摇匀,即得。
杂质K回收率供试品溶液:取更昔洛韦原料药约15mg,6份,精密称定,分别置50ml量瓶中,精密加入杂质K对照品储备液5ml,用流动相A稀释至刻度,摇匀,即得。
照杂质K检测方法的色谱条件,精密量取杂质K对照品溶液、供试品溶液、杂质K回收率供试品溶液各20μl,分别注入液相色谱仪,记录色谱图;按外标法以峰面积计算杂质K的测得量,并通过测得量与加入量算出回收率。试验结果见表10。
表10回收率试验结果
Figure BDA0003282350770000181
试验结果与分析:6份供试品溶液中杂质K的回收率均在103.99%~107.66%之间,RSD值为1.48%,方法的准确度高。
(7)重复性试验
杂质K对照品储备液:称取杂质K对照品约15mg,精密称定,置100ml量瓶中,加流动相A溶解并稀释至刻度,摇匀;精密量取1ml,置100ml量瓶中,用流动相A稀释至刻度,摇匀,即得。
杂质E对照品储备液:称取杂质E对照品约1mg,置10ml量瓶中,加流动相A溶解并稀释至刻度,摇匀;精密量取1ml,置20ml量瓶中,用流动相A稀释至刻度,摇匀,即得。
混合溶液:取更昔洛韦原料药约15mg,精密称定,置50ml量瓶中,精密加入杂质K、E对照品储备液各5ml,再加流动相A溶解并稀释至刻度,摇匀,即得。
杂质K对照品溶液:精密量取杂质K对照品储备液1ml,置10ml量瓶中,用流动相A稀释至刻度,混匀,即得。
加样供试品溶液:取更昔洛韦原料药约15mg,精密称定,分别置50ml量瓶中,精密加入杂质K对照品储备液5ml,用流动相A稀释至刻度,摇匀,即得。
照杂质K检测方法的色谱条件,精密量取供试品溶液及对照品溶液各20μl,分别注入液相色谱仪,记录色谱图;按外标法以峰面积计算杂质K的含量。试验结果见表11。
表11重复性试验结果
Figure BDA0003282350770000191
试验结果及分析:6份供试品溶液中测得的杂质K含量的RSD值为0.81%,方法的重复性良好。
(8)中间精密度试验
由另一名分析人员于不同时间、使用不同仪器重复“重复性”试验。计算两名分析人员所得12份样品测定结果的RSD值。试验结果见表12。
表12中间精密度试验结果
Figure BDA0003282350770000192
试验结果及分析:2次试验12份供试品溶液中测得的杂质K含量无明显变化,12份结果的RSD值为4.09%,方法的中间精密度良好。
(9)进样精密度试验
照杂质K检测方法的色谱条件,精密量取重复性试验项下对照品溶液20μl,注入液相色谱仪,记录色谱图,连续进样6次,统计杂质K峰面积的RSD值。试验结果见表13。
表13进样精密度试验结果
Figure BDA0003282350770000201
试验结果及分析:杂质K对照品溶液连续进样6针,峰面积RSD值为0.97%,仪器精密度良好。
对比例1 EP9.6(欧洲药典9.6版)更昔洛韦质量标准中的检测方法
参照欧洲药典9.6版更昔洛韦质量标准中的检测方法对更昔洛韦原料药进行检测,具体步骤如下:
1.色谱条件
色谱柱:Hi CHROM Partisil 10SCX 250mm×4.6mm,10μm
流动相:乙腈和0.05%的三氟乙酸溶液(50:50)
洗脱方式:等度
波长:254nm
进样量:20μl
流速:1.5ml/min
柱温:40℃
运行时间:更昔洛韦保留时间的2.5倍
溶剂:流动相
2.溶液的配制
更昔洛韦对照品储备液:取更昔洛韦对照品约1mg,置10ml量瓶中,加流动相溶解并稀释至刻度,摇匀,即得。
杂质F(用0.1mol/L氢氧化钠助溶)、A、B、C、E、F、H、I、J、K、L、M、N对照品储备液的配制同更昔洛韦对照品储备液。
更昔洛韦对照品定位溶液:精密量取更昔洛韦对照品储备液0.5ml,置10ml量瓶中,用流动相稀释至刻度,摇匀,即得。杂质A、B、C、E、F、H、I、J、K、L、M、N对照品定位溶液的配制同更昔洛韦对照品定位溶液。
混合对照品溶液:精密称取更昔洛韦对照品3mg,置5ml量瓶中,分别精密加入杂质A、B、C、E、F、H、I、J、K、L、M、N对照品储备液0.25ml,用流动相溶解稀释至刻度,摇匀,即得。
3.结果
采用上述第1点中的色谱条件,对上述配置的各对照品定位溶液和混合对照品溶液进行检测,各组分定位及分离度结果参见表14。典型混合对照图谱参见图2(从左至右依次为杂质L、J、N、I、A、B、C、M、E、K、更昔洛韦、H、F峰)。
4.结论
实验结果显示,杂质K与主峰未分开,影响样品检测。其他杂质均能完全分离,空白溶剂不干扰检测。
表14对比例1中各组分定位及分离度结果
Figure BDA0003282350770000211
Figure BDA0003282350770000221
对比例2 ChP2015(中国药典2015版)更昔洛韦质量标准的检测方法
参照中国药典2015版中更昔洛韦质量标准的检测方法对更昔洛韦原料药进行检测,具体步骤如下:
1.色谱条件
色谱柱:Waters symmetry C18,250mm×4.6mm,5μm
流动相:甲醇-水(5:95)
洗脱方式:等度
波长:252nm
进样量:20μl
流速:1.0ml/min
柱温:室温
运行时间:更昔洛韦保留时间的6倍
溶剂:流动相
2.溶液的配制
杂质A对照品储备液:取杂质A对照品约1mg,置10ml量瓶中,加流动相溶解并稀释至刻度,摇匀,即得。
杂质B、C、E、F、H、I、J、K、L、M、N对照品储备液的配制同杂质A对照品储备液。
杂质A对照品定位溶液:精密量取杂质A对照品储备液0.5ml,置10ml量瓶中,用流动相稀释至刻度,摇匀,即得。杂质B、C、E、F、H、I、J、K、L、M、N对照品定位溶液的配制同杂质A对照品定位溶液。
混合对照品溶液:取更昔洛韦原料药6mg,置20ml量瓶中,分别精密加入杂质A、B、C、E、F、H、I、J、K、L、M、N对照品储备液1ml,用流动相稀释至刻度,摇匀,即得。
3.结果
采用上述第1点中的色谱条件,对上述第2点配置的各对照品定位溶液和混合对照品溶液进行检测,各组分定位及分离度结果参见表15,典型图谱如图3所示(从左至右依次为杂质F、更昔洛韦+H、E、K、L+M、C)。
表15对比例2中各组分定位及分离度结果
Figure BDA0003282350770000231
4.结论:杂质H与更昔洛韦主峰未分开,杂质E与更昔洛韦主峰分离不合格,杂质L峰与杂质M峰未分开,杂质A、B、I、J、N在主峰保留时间6倍的运行时间内未出峰。可见,对比例2的方法并未能洗脱所有杂质,容易造成色谱柱中杂质残留,影响色谱柱寿命。
对比例3重现进口注册质量标准JX20110078
参照国家药品监督管理局批准的进口注册质量标准JX20110078中更昔洛韦的检测方法,具体步骤如下:
1.色谱条件
色谱柱:月旭AQ-C18 250mm×4.6mm,5μm
流动相:取磷酸二氢铵约1.38g,加水500ml,加磷酸1.2ml溶解,用水稀释至1000ml
洗脱方式:等度
波长:254nm
进样量:20μl
流速:1.0ml/min
柱温:室温
运行时间:更昔洛韦保留时间的5倍
溶剂:流动相
2.溶液的配制
杂质A对照品储备液:取杂质A对照品约1mg,置10ml量瓶中,加流动相溶解并稀释至刻度,摇匀,即得。
杂质B、C、E、F、H、I、J、K、L、M、N对照品储备液的配制同杂质A对照品储备液。
杂质A对照品定位溶液:精密量取杂质A对照品储备液1ml,置20ml量瓶中,用流动相稀释至刻度,摇匀,即得。杂质B、C、E、F、H、I、J、K、L、M、N对照品定位溶液的配制同杂质A对照品定位溶液。
混合对照品溶液:取更昔洛韦原料药6mg,置20ml量瓶中,分别精密加入杂质A、B、C、E、F、H、I、J、K、L、M、N对照品储备液1ml,用流动相稀释至刻度,摇匀,即得。
3.结果
采用上述第1点中的色谱条件,对上述配置的各对照品定位溶液和混合对照品溶液进行检测,各组分定位及分离度结果见下表16,获得典型混合对照品溶液的HPLC图谱参见图4(从左至右依次为杂质F、H、更昔洛韦、E、K、L+M、C)。
表16对比例3中各组分定位及分离度结果
Figure BDA0003282350770000251
4.结论
杂质L峰与杂质M峰未分开,杂质A、B、I、J、N在主峰保留时间5倍的运行时间内未出峰。未能洗脱所有杂质,容易造成色谱柱中杂质残留,影响色谱柱寿命。
虽然以上描述了本发明的具体实施方式,但是本领域的技术人员应当理解,这仅是举例说明,本发明的保护范围是由所附权利要求书限定的。本领域的技术人员在不背离本发明的原理和实质的前提下,可以对这些实施方式做出多种变更或修改,但这些变更和修改均落入本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种更昔洛韦中杂质K的检测方法,其特征在于,其包括如下步骤:采用高效液相色谱检测含更昔洛韦的供试品溶液;
所述高效液相色谱采用的色谱柱为阳离子交换色谱柱;
所述高效液相色谱的洗脱方式如下:
Figure FDA0003282350760000011
其中,
上述%是指体积百分比;
流动相A为含0.012M磷酸二氢铵的磷酸水溶液;所述磷酸水溶液中,所述磷酸的体积百分比为0.12%,%是指磷酸的体积占所述磷酸水溶液的体积的百分比;
流动相B为乙腈。
2.如权利要求1所述的更昔洛韦中杂质K的检测方法,其特征在于,所述色谱柱为SCX强阳离子交换柱,较佳地为C18色谱柱;
其中,所述C18色谱柱的规格较佳地为柱长250mm×内径4.6mm;所述C18色谱柱的填料粒径较佳地为5μm。
3.如权利要求2所述的更昔洛韦中杂质K的检测方法,其特征在于,所述C18色谱柱的型号为月旭AQ-C18,规格为250×4.6mm,5μm。
4.如权利要求1所述的更昔洛韦中杂质K的检测方法,其特征在于,所述流动相A由以下方法制备得到:取磷酸二氢铵约1.38g,加水500ml,然后加磷酸1.2ml溶解,用水稀释至1000ml。
5.如权利要求1所述的更昔洛韦中杂质K的检测方法,其特征在于,所述高效液相色谱中,检测波长为254±2nm。
6.如权利要求1所述的更昔洛韦中杂质K的检测方法,其特征在于,所述高效液相色谱中,流动相的流速为1.0±0.05ml/min。
7.如权利要求1所述的更昔洛韦中杂质K的检测方法,其特征在于,所述高效液相色谱中,色谱柱的柱温为25±10℃。
8.如权利要求1所述的更昔洛韦中杂质K的检测方法,其特征在于,所述供试品溶液中更昔洛韦的质量浓度为0.3±0.02mg/ml,其中,mg/ml是指更昔洛韦的质量占供试品溶液的体积的比。
9.如权利要求1所述的更昔洛韦中杂质K的检测方法,其特征在于,所述供试品溶液中用于溶解更昔洛韦的溶剂为所述流动相A;
较佳地,所述供试品溶液的配置方法如下:将15mg更昔洛韦置于50ml量瓶中,加所述流动相A溶解并稀释至刻度,摇匀,即得。
10.一种更昔洛韦中杂质的分离方法,其包括如下步骤:采用高效液相色谱检测含更昔洛韦的供试品溶液;
所述高效液相色谱采用的色谱柱为阳离子交换色谱柱;
所述高效液相色谱的洗脱方式如下:
Figure FDA0003282350760000021
其中,
上述%是指体积百分比;
流动相A为含0.012M磷酸二氢铵的磷酸水溶液;所述磷酸水溶液中,所述磷酸的体积百分比为0.12%,%是指磷酸的体积占所述含0.01M磷酸二氢铵的磷酸水溶液的体积的百分比;
流动相B为乙腈;
较佳地,所述色谱柱为SCX强阳离子交换柱,更佳地为C18色谱柱;其中,所述C18色谱柱的规格较佳地为柱长250mm×内径4.6mm;所述C18色谱柱的填料粒径较佳地为5μm;
例如:所述C18色谱柱的型号为月旭AQ-C18,规格为250×4.6mm,5μm;
较佳地,所述流动相A由以下方法制备得到:取磷酸二氢铵约1.38g,加水500ml,然后加磷酸1.2ml溶解,用水稀释至1000ml;
较佳地,所述高效液相色谱中,检测波长为254±2nm;
较佳地,所述高效液相色谱中,流动相的流速为1.0±0.05ml/min;
较佳地,所述高效液相色谱中,色谱柱的柱温为25±10℃;
较佳地,所述供试品溶液中更昔洛韦的质量浓度为0.3±0.02mg/ml,其中,mg/ml是指更昔洛韦的质量占供试品溶液的体积的比;
较佳地,所述供试品溶液中用于溶解更昔洛韦的溶剂为所述流动相A;
较佳地,所述供试品溶液的配置方法如下:将15mg更昔洛韦置于50ml量瓶中,加所述流动相A溶解并稀释至刻度,摇匀,即得。
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