CN113930481B - 一种木瓜样蛋白酶的抑制剂筛选试剂盒及其应用 - Google Patents

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Abstract

一种SARS‑Cov‑2木瓜样蛋白酶抑制剂筛选试剂盒及其筛选方法。本发明提供了一种可用于SARS‑Cov‑2木瓜样蛋白酶的抑制剂筛选方法。该试剂盒包括：SARS‑Cov‑2木瓜样蛋白酶、底物肽Dabcyl‑FTLKGGAPTKVT‑E(Edans)、硼酸硼砂缓冲液。该底物肽在SARS‑Cov‑2木瓜样蛋白酶作用下，荧光团猝灭得以解除，利用反应前后荧光性质的差异实现对SARS‑Cov‑2木瓜样蛋白酶的活性检测，并且该方法可以用于简单方便，特异性好的高通量抑制剂快速筛选。

Description

一种木瓜样蛋白酶的抑制剂筛选试剂盒及其应用
技术领域
本发明涉及药物筛选领域，具体涉及一种SARS-Cov-2木瓜样蛋白酶的抑制剂筛选方法。
背景技术
目前尚未发现临床批准的针对COVID-19的疫苗和药物，针对 COVID-19研究的技术攻关和药物、疫苗开发仍迫在眉睫。
SARS-Cov-2木瓜样蛋白酶是2019-2020年全球大流行的新冠病毒 covid-19蛋白水解酶，在病毒复制过程中起重要的作用，因此也是抗病毒药研究的重要靶点。筛选该酶的抑制剂，对于寻找该病毒的特效药大有帮助。
目前使用的木瓜样蛋白酶的检测方法，大多是以Z-RLRGG-AMC/ RLRGG-AMC为底物的，该方法是沿用2003年SARS,2013年MERS的木瓜样蛋白酶的检测方法。使用该方法去检测2020年的covid-19是不准确的，可能会导致抑制剂的错筛和漏筛。因此，迫切需要更先进更科学的抑制剂筛选方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种操作简单方便，灵敏度高，特异性好，能够快速筛选SARS-Cov-2木瓜样蛋白酶抑制剂的试剂盒方法。为达到以上目的，本发明采用如下技术方案：
本发明提供一种试剂盒，包括如下组分：
SARS-Cov-2木瓜样蛋白酶、
底物肽Dabcyl-FTLKGGAPTKVT-E(Edans)溶液、
硼酸硼砂缓冲液。
优选地，所述SARS-Cov-2木瓜样蛋白酶其蛋白酶(YP_009725299.1), 购自SinoBiologica(Catalog Number:40593-V-07E),序列为 Glu1564-Val1880，分子量为36.79kDa；其纯度经SDS-PAGE检测>92％,浓度为0.1-1毫克/毫升；
优选地，所述底物肽Dabcyl-FTLKGGAPTKVT-E(Edans)溶于二甲亚砜中，其浓度为0.1mM-10mM，其中Dabcyl是猝灭剂4-二甲胺偶氮苯4’-羧酸，Edans是荧光团5-(2-氨基乙氨基)-1-萘磺酸；
优选地，所述硼酸硼砂缓冲液的浓度为10-100毫摩尔每升；所述硼酸硼砂缓冲液的PH为7-9。
使用该试剂盒筛选SARS-Cov2木瓜样蛋白酶的抑制剂，其方法为：
(1)SARS-Cov2木瓜样蛋白酶和底物肽储液均保存于-60到-100℃冰箱中；
(2)将SARS-Cov2木瓜样蛋白酶在冻存板(-4至4℃，优选0至4℃) 里或冰(-4至4℃，优选0至4℃)上室温下融化，取0.1-2uL稀释于97-98uL 硼酸硼砂缓冲液中，加入检测板中；
(3)将0.1mM-10mM抑制剂储液0.1-2uL加入步骤(2)获得的溶液中，微震荡沉静10-30分钟；
(4)将底物肽0.1-2uL加入上述步骤(3)获得的溶液中，使用荧光酶标仪37摄氏度孵育，并使用荧光酶标仪监测342nm激发，496nm处的荧光发射值，每1-5分钟采一点；
(5)不加抑制剂组的荧光值(重复步骤(1)，(2),(4))，作为对照组。
该底物肽在SARS-Cov-2木瓜样蛋白酶作用下，荧光团猝灭得以解除，利用反应前后荧光性质的差异实现对SARS-Cov-2木瓜样蛋白酶的活性检测，并且该方法可以用于简单方便，特异性好的高通量抑制剂快速筛选。
附图说明
图1为实施例1不同浓度底物肽在酶代谢下荧光强度随时间变化图；
图2为实施例2底物肽被SARS-Cov-2木瓜样蛋白酶水解的底物转化效率 v/E与底物浓度S的关系图；
图3为实施例2中RLRGG-AMC被SARS-Cov-2木瓜样蛋白酶水解的底物转化效率v/E与底物浓度S的关系图；
图4为实施例3中不同抑制剂浓度下的抑制能力图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应明白，所述实施例仅仅是为了帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
本发明所述的SARS-Cov2木瓜样蛋白酶购自Sino Biological，底物肽 Dabcyl-FTLKGGAPTKVT-E(Edans)委托GL biochem定制合成，硼酸硼砂缓冲液购自雷根生物。
本发明所述的试剂盒需要用荧光酶标仪进行荧光检测。
本实施例的试剂盒含有：
SARS-Cov-2木瓜样蛋白酶(浓度为0.1mg/mL)、底物肽Dabcyl-FTLKGGAPTKVT-E(Edans)(浓度为0.1mM-5mM)、硼酸硼砂缓冲液(PH＝7.4)。
实施例1
具体实施过程为：
(1)SARS-Cov2木瓜样蛋白酶和底物肽储液均保存于-80℃冰箱中；
(2)将SARS-Cov2木瓜样蛋白酶在冻存板(-4至4℃)里室温下融化，取1uL稀释于98uL硼酸硼砂缓冲液(PH＝7.4)中，加入检测板中；
(3)将底物肽(浓度分别为：0.1mM，0.25mM，0.5mM，1mM，2.5mM， 5mM)1uL加入上述步骤(3)获得的溶液中，使用荧光酶标仪37摄氏度孵育，并使用荧光酶标仪监测342nm激发，496nm处的荧光发射值，边孵育边检测，每1分钟采一点；
该底物肽在酶代谢下荧光强度随时间缓慢增强效果如下图1。
实施例2
具体实施过程如下：
(1)SARS-Cov2木瓜样蛋白酶和底物肽储液均保存于-80℃冰箱中；
(2)于室温下，将SARS-Cov2木瓜样蛋白酶冰上缓慢融化，取1uL于硼酸硼砂缓冲液(PH＝7.4)98uL中，加入检测板中；
(3)将底物肽溶液(储液浓度为0.1mM，0.25mM，0.5mM，1mM， 2.5mM，5mM)1uL加入上述缓冲液体系溶液中，孵育30min，边孵育边检测，使用荧光酶标仪监测342nm激发，采集496nm处的荧光发射值，每1 分钟采一点；该结果表示为底物转化效率与底物浓度的关系,即酶动力学性质，如图2所示，该结果表明该底物肽被SARS-Cov-2木瓜样蛋白酶水解符合典型的米氏方程，该底物肽是SARS-Cov-2木瓜样蛋白酶的经典底物；
同时用RLRGG-AMC(其中AMC是7-氨基香豆素)作为底物，(储液浓度为0.1mM，0.25mM，0.5mM，1mM，2.5mM，5mM)1uL加入上述缓冲液体系溶液中，孵育30min，边孵育边检测，使用荧光酶标仪监测 345nm激发，采集445nm处的荧光发射值，每1分钟采一点，显示的酶动力学性质如图3所示，该结果呈一条直线，该结果显示RLRGG-AMC 不能被SARS-Cov2木瓜样蛋白酶饱和，因此不是SARS-Cov2木瓜样蛋白酶的经典底物；底物肽Dabcyl-FTLKGGAPTKVT-E(Edans)相比 RLRGG-AMC是优选底物，可以作为更优的筛选抑制剂方法。
实施例3
具体实施过程如下：
SARS-Cov2木瓜样蛋白酶和底物肽储液均保存于-80℃冰箱中；
1)于室温下，将SARS-Cov2木瓜样蛋白酶冰上缓慢融化，取1uL于硼酸硼砂缓冲液(PH＝7.4)98uL中，加入384孔康宁检测板中；
2)将抑制剂储液(储液浓度为0.05mM，0.1mM，0.25mM，0.5mM， 1mM，2.5mM)1uL加入上述缓冲液体系溶液中，孵育10min；不加抑制剂的溶液体系荧光强度作为对照；
3)将底物肽溶液(储液浓度为0.5mM)1uL分别加入上述步骤2)的缓冲液体系溶液中，孵育30min，边孵育边检测，使用荧光酶标仪监测342nm 激发，496nm处的荧光发射值，每1分钟采一点；
4)对比不加抑制剂组的荧光值，前者(抑制剂组)荧光值除以后者(对照组)荧光值可得到抑制蛋白活性的比例，从而拟合得出抑制蛋白活性一半所需的IC50值。结果如图4所示，化合物Ebselen(依布硒啉)的抑制能力IC50值计算得为0.369uM。该实施例证明该试剂盒方法可以用来标定抑制剂的抑制能力。

Claims (5)

1.一种SARS-Cov-2木瓜样蛋白酶的抑制剂筛选试剂盒，其特征在于，包括以下组分：
SARS-Cov-2 木瓜样蛋白酶、底物肽Dabcyl-FTLKGGAPTKVT-E(Edans)、硼酸硼砂缓冲液。
2.根据权利要求书1所述的试剂盒，其特征在于，所述SARS-Cov-2 木瓜样蛋白酶浓度为0.01-1mg/mL;
所述底物肽Dabcyl-FTLKGGAPTKVT-E(Edans)的浓度为0.1mM-5mM；
所述硼酸硼砂缓冲液的浓度为10-100毫摩尔/升；所述硼酸硼砂缓冲液的PH为7-9。
3.一种权利要求书1或2所述的试剂盒的应用，其特征在于，所述试剂盒用于筛选SARS-Cov2 木瓜样蛋白酶的抑制剂。
4.根据权利要求书3所述的试剂盒的应用，其特征在于，其筛选SARS-Cov2 木瓜样蛋白酶的抑制剂的方法为：
（1）SARS-Cov2 木瓜样蛋白酶和底物肽储液均保存于-60到-100℃冰箱中；
（2）将SARS-Cov2 木瓜样蛋白酶在冻存板里或冰上室温下融化，取0.1-2uL稀释于97uL-98uL硼酸硼砂缓冲液中，加入检测板中；
（3）将0.1mM-10mM抑制剂储液0.1-2uL加入步骤（2）获得的溶液中，微震荡沉静10-30分钟；
（4）将底物肽0.1-2uL加入上述步骤（3）获得的溶液中，使用荧光酶标仪37摄氏度孵育，并监测342nm激发，采集496nm处的荧光发射值，每1-5分钟采一点；（5）重复步骤（1），（2）,（4）的过程，获得不加抑制剂组的荧光值，作为对照组；
（6）根据步骤（4）孵育时间15-30分钟处的荧光值，抑制剂组荧光值除以对照组荧光值可得到抑制蛋白活性的比例。
5.根据权利要求书4所述的试剂盒的应用，其特征在于，可以得到衡量抑制剂抑制能力的指标IC50值；其方法在于，根据大于等于五个抑制剂不同浓度组别15-30分钟处的荧光值，对比不加抑制剂组的荧光值，前者除以后者可得到抑制蛋白活性的比例，从而拟合得出抑制蛋白活性一半所需的IC50值。
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