CN113925110A - 一种鱼精蛋白肽规模化制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种鱼精蛋白肽规模化制备方法。以水生生物成熟精巢组织为原料，预处理采用弱碱盐溶液清洗，而后采用高温硫酸水解精巢核蛋白，再在高温条件下加入还原糖发生美拉德反应，随后进行吸附脱腥、连续流离心过滤协同多级膜分离，得到含量≥95％的无核苷酸存在的鱼精蛋白肽浓缩液。本发明尽管采用化学提取的方法，但相较于目前热门的酶解工艺制备的鱼精蛋白肽产率更高，时间消耗更少。同时，规模化制备鱼精蛋白肽的生产周期基本上可以控制在24小时内完成，更为简短务实；流程整体更为简单高效，更为适合大规模生产；本发明生产的鱼精蛋白肽，相较于鱼精蛋白粗提物，在嗅觉和味觉两方面，风味更加良好，更易于被广大消费者接受食用。

Description

一种鱼精蛋白肽规模化制备方法
技术领域
本发明涉及到一种鱼精蛋白肽规模化制备方法，属于化学提取技术与食品领域。
背景技术
水生动物的精巢俗称鱼白、又称鱼精，富含核蛋白(Nucleoprotein)、以及多种酶类物质和矿物元素。核蛋白的主要成分是大约2/3的脱氧核糖核酸(DNA)和大约1/3的鱼精蛋白。其中，鱼精蛋白(Protamine)是一种碱性蛋白质，分子量比较小(从几千到一万多道尔顿)，一般由30～50个氨基酸组成且富含精氨酸。鱼精蛋白具有广谱抑菌性、降血压、抑制肿瘤生长和促消化等功能，鱼精蛋白纯品可以恢复肝素的抗凝血作用，是美国食品和药物管理局(FDA)批准的唯一一种体外循环心脏手术中对抗肝素的抗凝血药物。
但是，在食品风味方面，由于鱼白的腥味过于浓烈，几乎没有人愿意接受食用，这导致鱼白的实际应用十分有限。在水产品加工过程中，鱼白一般作为废弃物直接丢弃，或者与其它内脏一起被加工成低附加值的鱼粉饲料，资源利用价值非常低。目前基于文献报道的提取鱼精蛋白的常规方法(常温酸提取+盐析+醇沉)所得到的鱼精蛋白实际是鱼精蛋白的粗提物，也仍然带有令人讨厌，且绝大多数的人不能接收的腥味。而通过进一步的柱层析技术(凝胶层析或离子交换层析)纯化得到的鱼精蛋白纯品虽然腥味有明显的改善，但整个纯化步骤复杂耗时、成本高昂，且无法实现产业化放大和大规模生产。
需要注意的是，与其他蛋白一样，鱼精蛋白被人体食用的过程实际上也是鱼精蛋白在人体胃肠道中消化分解至分子量绝大部分小于1000Da的小肽(而非游离氨基酸)，再进入血液循环被人体吸收利用的过程。如果采用一套务实可靠的生产工艺(如本发明专利)能够制备出分子量分布与鱼精蛋白纯品在人体胃肠道中消化得到的小肽类似的鱼精蛋白肽(Protamine hydrolysate)，则这样的鱼精蛋白肽应该能够代替制备工艺复杂耗时的鱼精蛋白纯品，被人体吸收利用。同时，鱼精蛋白的蛋白一级结构中精氨酸含量相对较多，如果采用一套务实可靠的生产工艺(如本发明专利)能够制备出氨基酸组成与含量和鱼精蛋白纯品基本相同的鱼精蛋白肽，则这样的鱼精蛋白肽也会具有强化肝功能，以及刺激下丘脑和垂体释放促性腺激素的功能，继而可以用作辅助治疗男性不育症的营养补充剂。
因此，为解决水产下脚料——鱼白及其鱼精蛋白(粗提物和纯品)在食品领域的应用难题，很有必要发明设计一套简单高效且能够规模化放大的生产工艺，并用于制备风味良好、适宜食用的鱼精蛋白肽，这无疑也有着重要的科学意义。
发明内容
本发明提供一种生产工艺简便、生产成本低、产品含量高、分子量绝大部分(90％以上)分布在1000Da以下、风味良好适宜食用的鱼精蛋白肽的规模化制备方法，实现海洋生物资源的高值化利用。
为解决上述技术问题，本发明的技术解决方案是：
一种鱼精蛋白肽规模化制备方法，包括以下步骤：
(1)原料预处理
将水生生物成熟精巢组织投入反应釜中，加入精巢重量0.5～5倍的弱碱与盐混合液，搅拌0.5～3小时，除掉精巢的脂肪和杂蛋白，以及清洗表面污垢等杂质，用水洗净，其中弱碱溶液的质量体积浓度为1～6％，盐溶液的质量体积浓度为1～10％；
(2)高温硫酸水解精巢核蛋白
将经过预处理并洗净的精巢置于反应釜中，加入精巢重量0.5～5倍的去离子水，加入浓硫酸调节pH为1～3，反应温度为85～100℃，搅拌反应2～6小时；
(3)美拉德反应
在高温条件下，先加入氢氧化钙调节pH为5.5～6.5，再加入强碱调节pH为7～10；加入精巢重量0.01～0.2倍的还原糖，反应温度为85～100℃，搅拌反应10分钟～2小时；
(4)吸附脱腥与连续流离心过滤
美拉德反应结束后，降温至40～55℃，加入精巢重量0.001～0.02倍的吸附剂，搅拌0.5～1.5小时；然后用连续流离心机高速离心得到精巢核蛋白肽粗提液；
(5)多级膜分离
精巢核蛋白肽粗提液先用孔径为0.8～0.1μm的陶瓷膜去除其中的固体残渣，所得清液再用相对分子质量为500～200Da的纳滤膜去除等糖、碱基、核苷酸等小分子杂质和部分无机盐，并进一步浓缩得到含量≥95％的鱼精蛋白肽溶液。
优选地，还包括如下步骤：
(6)快速干燥
利用喷雾干燥快速干燥蛋白肽溶液，得到鱼精蛋白肽粉成品。
所述步骤(1)原料预处理所使用的水生生物成熟精巢组织为海洋鱼类或淡水鱼类的成熟精巢组织，亦或是软体生物成熟精巢组织。本发明所述的海洋鱼类包括但不限于鲀鱼、鲑鱼、鳟鱼、鲱鱼、鲭鱼、金枪鱼、黄鱼、鲣鱼、石斑鱼；本发明所述的淡水鱼类包括但不限于罗非鱼、鲢鱼、鲤鱼、鲮鱼、草鱼、大麻哈鱼、鲟鱼、青鱼、乌鱼；本发明所述的软体生物包括但不限于鱿鱼。
所述步骤(1)原料预处理所使用的弱碱为碳酸氢钠或碳酸氢钾；盐为氯化钠或氯化钾中的至少一种。
所述步骤(3)调节pH所使用的碱为氢氧化钠或氢氧化钾。参与美拉德反应的还原糖为葡萄糖、蔗糖、木糖、半乳糖、果糖、阿拉伯糖、核糖或甘露糖中的至少一种。
所述步骤(4)中所使用的吸附剂为活性炭、高岭土或氧化铝中的至少一种。
所述步骤(4)中所使用的离心机为10000～15000rpm的连续流离心机。
所述步骤(5)分离所使用的孔径为0.8～0.1μm的陶瓷膜流速为10～120立方米/小时，膜压力为0.1～0.6Mpa，温度为20～50℃；分离所使用的相对分子量为500～200Da的纳滤膜流速为5～14立方米/小时，膜压力为0.5～2.5Mpa，温度为20～50℃。
所述步骤(6)中所使用的喷雾干燥的进风温度为120～180℃、出风温度为70～95℃。
所述步骤(6)中鱼精蛋白肽90％以上的分子量分布在1000Da以下，属于小肽级别。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
1.本发明以水生动物的成熟精巢为组织为原料，采用高温硫酸水解法结合多级膜分离技术制备出无核苷酸存在的鱼精蛋白肽，并且相较于目前热门的酶解法，如单一酶解法和复合酶解法，本发明工艺生产的鱼精蛋白肽产率最高，时间消耗最少(见表1)。
2.本发明将美拉德反应运用于鱼精蛋白肽的制备工艺中，能够在嗅觉和味觉两方面，显著改善鱼精蛋白粗提物和纯品的风味，实现降腥增香、除苦提鲜的良好效果。
3.相较于鱼精蛋白纯品的制备工艺，本发明的鱼精蛋白肽规模化生产周期基本上可以控制在24小时内完成，工艺方法更为简单务实；工艺流程更为高效可靠，整体工艺更能满足产业化放大和大规模生产的要求。
4.本发明生产的鱼精蛋白肽相较于鱼精蛋白粗提物，其风味更加良好，更易作为一般食品的功能原料，被广大消费者接受食用；不仅如此，本发明生产出来的鱼精蛋白肽，相较于鱼精蛋白纯品，氨基酸含量与组成基本相同，且均富含人体(特别是男性)所需的精氨酸，其分子量分布也与鱼精蛋白纯品经过模拟人体胃肠道消化后的鱼精蛋白肽基本相同。因此，本发明生产的鱼精蛋白肽有望替代制备工艺复杂耗时的鱼精蛋白纯品，被人体直接吸收利用，非常适合作为临床营养品、蛋白营养补充剂直接食用；甚至具备开发成为提升男性身体机能的保健食品或运动食品的巨大潜质。
5.本发明方法适用范围广，既适用于海洋鱼类的鱼精蛋白肽(以鲀鱼鱼精蛋白肽为例)的制备，又适用于淡水鱼类的鱼精蛋白肽(以鲢鱼鱼精蛋白肽为例)的制备，还适用于软体生物的鱼精蛋白肽(以鱿鱼鱼精蛋白肽为例)的制备，均取得良好的制备效果。
附图说明
图1是本发明方法：鱼精蛋白肽规模化制备方法的工艺流程图。
图2是相关文献中制备鱼精蛋白粗提物与纯品的工艺流程图。
图3是鱼精蛋白纯品经过模拟人体胃肠道消化得到鱼精蛋白肽的工艺流程图。
表1是不同水解方法的水生生物鱼精蛋白肽提取率对比。其中，本发明的高温硫酸水解法(pH＝2.0,85℃，5小时)；单一酶解法(酶解条件)：1、木瓜蛋白酶(物料比2％，pH＝6.5,55℃，24小时)；2、菠萝蛋白酶(物料比2％，pH＝6.0,53℃，24小时)；3、中性蛋白酶(物料比2％，pH＝7.0,50℃，24小时)；4、碱性蛋白酶(物料比2％，pH＝9.0,55℃，24小时)；5、酸性蛋白酶(物料比2％，pH＝2.5,50℃，24小时)；6、胃蛋白酶(物料比2％，pH＝1.5,37℃，24小时)；7、胰蛋白酶(物料比2％，pH＝8.0,37℃，24小时)；8、风味蛋白酶(物料比2％，pH＝6.5,53℃，24小时)；复合酶解法(酶解条件)：1、先酸性蛋白酶(物料比2％，pH＝2.5,50℃，12小时)，后木瓜蛋白酶(物料比2％，pH＝6.5,55℃，12小时)；2、先酸性蛋白酶(物料比2％，pH＝2.5,50℃，12小时)，后菠萝蛋白酶(物料比2％，pH＝6.0,53℃，12小时)；3、先酸性蛋白酶(物料比2％，pH＝2.5,50℃，12小时)，后中性蛋白酶(物料比2％，pH＝7.0,50℃，12小时)；4、先酸性蛋白酶(物料比2％，pH＝2.5,50℃，12小时)，后碱性蛋白酶(物料比2％，pH＝9.0,55℃，12小时))；5、先酸性蛋白酶(物料比2％，pH＝2.5,50℃，12小时)，后风味蛋白酶(物料比2％，pH＝6.5,53℃，12小时)；6、先胃蛋白酶(物料比2％，pH＝1.5,37℃，12小时)，后胰蛋白酶(物料比2％，pH＝8.0,37℃，12小时)。
表2是水生生物鱼精蛋白(粗提物和纯品)与鱼精蛋白肽的风味评定标准，表3是水生生物鱼精蛋白与鱼精蛋白肽(固体)的风味评定结果，表4是水生生物鱼精蛋白与鱼精蛋白肽溶液(1％)的风味评定结果，表5是采用本发明的美拉德反应以及随后的吸附脱腥方法制备与只采用吸附脱腥方法制备的水生生物鱼精蛋白肽固体的风味评定结果，表6是采用本发明的美拉德反应以及随后的吸附脱腥方法制备与只采用吸附脱腥方法制备的水生生物鱼精蛋白肽溶液(1％)的风味评定结果，参与风味评定的人数都是15人(7男8女)。
表7是鲀鱼鱼精蛋白(纯品)与本发明制备的鲀鱼鱼精蛋白肽的氨基酸含量对比，表8是鲢鱼鱼精蛋白(纯品)与本发明制备的鲢鱼鱼精蛋白肽的氨基酸含量对比，表9是鱿鱼鱼精蛋白(纯品)与本发明制备的鱿鱼鱼精蛋白肽的氨基酸含量对比。
图4是本发明制备的鲀鱼鱼精蛋白肽与模拟人体胃肠道消化得到的鲀鱼鱼精蛋白肽的凝胶色谱图对比(1——模拟人体胃肠道消化得到的鲀鱼鱼精蛋白肽；2——本发明制备的鲀鱼鱼精蛋白肽)。
图5是本发明制备的鲢鱼鱼精蛋白肽与模拟人体胃肠道消化得到的鲢鱼鱼精蛋白肽的凝胶色谱图对比(1——模拟人体胃肠道消化得到的鲢鱼鱼精蛋白肽；2——本发明制备的鲢鱼鱼精蛋白肽)。
图6是本发明制备的鱿鱼鱼精蛋白肽与模拟人体胃肠道消化得到的鱿鱼鱼精蛋白肽的凝胶色谱图对比(1——模拟人体胃肠道消化得到的鱿鱼鱼精蛋白肽；2——本发明制备的鱿鱼鱼精蛋白肽)。
图7是本发明制备的鱼精蛋白肽与核苷酸标准品的色谱图对比(1——核苷酸标准品色谱图，其中，CMP——胞嘧啶核苷酸，AMP——腺嘌呤核苷酸，UMP——尿嘧啶核苷酸，GMP——鸟嘌呤核苷酸，IMP——次黄嘌呤核苷酸；2——鱼精蛋白肽样品的色谱图)。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步详述。
实施例1：
一种鱼精蛋白肽规模化制备方法，步骤如下：
(1)原料预处理
将鲀鱼精巢投入反应釜中，加入鲀鱼精巢重量4倍的碳酸氢钠与氯化钠混合液，搅拌2小时，用水洗净，其中碳酸氢钠溶液的质量体积浓度为3％，盐溶液的质量体积浓度为5％；
(2)高温硫酸水解精巢核蛋白
将经过预处理并洗净的鲀鱼精巢置于反应釜中，加入精巢重量2倍的去离子水，加入浓硫酸调节pH为2，反应温度为95℃，搅拌反应4小时；
(3)美拉德反应
在高温条件下，先加入氢氧化钙调节pH为6，再加入氢氧化钠调节pH为7.5；加入鲀鱼精巢重量0.2倍的葡萄糖，反应温度为85℃，搅拌反应2小时；
(4)吸附脱腥与连续流离心过滤
美拉德反应结束后，降温至50℃，加入鲀鱼精巢重量0.02倍的活性炭，搅拌0.5小时；然后用连续流离心机在14000rpm下高速离心得到鲀鱼精巢核蛋白肽粗提液；
(5)多级膜分离
鲀鱼精巢核蛋白肽粗提液先通过孔径为0.1μm的陶瓷膜，流速为90立方米/小时，膜压力为0.522Mpa，温度为30℃；所得的透过清液再用相对分子质量为200Da的纳滤膜截留，流速为10立方米/小时，膜压力为2.00Mpa，温度为30℃，并进一步浓缩得到含量为98.58％的鲀鱼鱼精蛋白肽溶液。
(6)快速干燥
利用喷雾干燥快速干燥蛋白肽溶液，得到鲀鱼鱼精蛋白肽粉成品，喷雾干燥的进风温度为160℃、出风温度为85℃。
实施例2：
一种鱼精蛋白肽规模化制备方法，步骤如下：
(1)原料预处理
将鲢鱼精巢投入反应釜中，加入鲢鱼精巢重量2倍的碳酸氢钾与氯化钠混合液，搅拌3小时，用水洗净，其中碳酸氢钾溶液的质量体积浓度为4％，盐溶液的质量体积浓度为4％；
(2)高温硫酸水解精巢核蛋白
将经过预处理并洗净的鲢鱼精巢置于反应釜中，加入精巢重量1倍的去离子水，加入浓硫酸调节pH为2.5，反应温度为100℃，搅拌反应3小时；
(3)美拉德反应
在高温条件下，先加入氢氧化钙调节pH为5.5，再加入氢氧化钾调节pH为9.5；加入鲢鱼精巢重量0.05倍的蔗糖，反应温度为90℃，搅拌反应1.5小时；
(4)吸附脱腥与连续流离心过滤
美拉德反应结束后，降温至45℃，加入鲢鱼精巢重量0.005倍的高岭土，搅拌1小时；然后用连续流离心机在12000rpm下高速离心得到鲢鱼精巢核蛋白肽粗提液；
(5)多级膜分离
鲢鱼精巢核蛋白肽粗提液先通过孔径为0.5μm的陶瓷膜，流速为80立方米/小时，膜压力为0.45Mpa，温度为25℃；所得的透过清液再用相对分子质量为200Da的纳滤膜截留，流速为8立方米/小时，膜压力为1.80Mpa，温度为35℃，并进一步浓缩得到含量为97.64％的鲢鱼鱼精蛋白肽溶液。
(6)快速干燥
利用喷雾干燥快速干燥蛋白肽溶液，得到鲢鱼鱼精蛋白肽粉成品，喷雾干燥的进风温度为165℃、出风温度为85℃。
实施例3：
一种鱼精蛋白肽规模化制备方法，步骤如下：
(1)原料预处理
将鱿鱼精巢投入反应釜中，加入鱿鱼精巢重量1倍的碳酸氢钠与氯化钾混合液，搅拌1小时，用水洗净，其中碳酸氢钠溶液的质量体积浓度为2％，盐溶液的质量体积浓度为3％；
(2)高温硫酸水解精巢核蛋白
将经过预处理并洗净的鱿鱼精巢置于反应釜中，加入精巢重量0.5倍的去离子水，加入浓硫酸调节pH为3，反应温度为90℃，搅拌反应4小时；
(3)美拉德反应
在高温条件下，先加入氢氧化钙调节pH为6.5，再加入氢氧化钠调节pH为8.5；加入鱿鱼精巢重量0.02倍的木糖，反应温度为95℃，搅拌反应45分钟；
(4)吸附脱腥与连续流离心过滤
美拉德反应结束后，降温至45℃，加入鱿鱼精巢重量0.002倍的氧化铝，搅拌1.5小时；然后用连续流离心机在13500rpm下高速离心得到鱿鱼精巢核蛋白肽粗提液；
(5)多级膜分离
鱿鱼精巢核蛋白肽粗提液先通过孔径为0.2μm的陶瓷膜，流速为85立方米/小时，膜压力为0.5Mpa，温度为35℃；所得的透过清液再用相对分子质量为500Da的纳滤膜截留，流速为14立方米/小时，膜压力为2.50Mpa，温度为40℃，并进一步浓缩得到含量为96.75％的鱿鱼鱼精蛋白肽溶液。
(6)快速干燥
利用喷雾干燥快速干燥蛋白肽溶液，得到鱿鱼鱼精蛋白肽粉成品，喷雾干燥的进风温度为175℃、出风温度为95℃。
实施例4：
一种鱼精蛋白肽规模化制备方法，步骤如下：
(1)原料预处理
将鲑鱼精巢投入反应釜中，加入鲑鱼精巢重量1倍的碳酸氢钾与氯化钾混合液，搅拌3小时，用水洗净，其中碳酸氢钾溶液的质量体积浓度为5％，盐溶液的质量体积浓度为8％；
(2)高温硫酸水解精巢核蛋白
将经过预处理并洗净的鲑鱼精巢置于反应釜中，加入精巢重量4倍的去离子水，加入浓硫酸调节pH为1，反应温度为85℃，搅拌反应5.5小时；
(3)美拉德反应
在高温条件下，先加入氢氧化钙调节pH为6，再加入氢氧化钾调节pH为8；加入鲑鱼精巢重量0.08倍的阿拉伯糖，反应温度为90℃，搅拌反应1小时；
(4)吸附脱腥与连续流离心过滤
美拉德反应结束后，降温至40℃，加入鲑鱼精巢重量0.008倍的活性炭，搅拌1.5小时；然后用连续流离心机在13000rpm下高速离心得到鲑鱼精巢核蛋白肽粗提液；
(5)多级膜分离
鲑鱼精巢核蛋白肽粗提液先通过孔径为0.4μm的陶瓷膜，流速为100立方米/小时，膜压力为0.4Mpa，温度为25℃；所得的透过清液再用相对分子质量为500Da的纳滤膜截留，流速为7立方米/小时，膜压力为1.50Mpa，温度为30℃，并进一步浓缩得到含量为95.95％的鲑鱼鱼精蛋白肽溶液。
(6)快速干燥
利用喷雾干燥快速干燥蛋白肽溶液，得到鲑鱼鱼精蛋白肽粉成品，喷雾干燥的进风温度为170℃、出风温度为90℃。
实施例5：
一种鱼精蛋白肽规模化制备方法，步骤如下：
(1)原料预处理
将鲤鱼精巢投入反应釜中，加入鲤鱼精巢重量1倍的碳酸氢钾与氯化钠混合液，搅拌1.5小时，用水洗净，其中碳酸氢钾溶液的质量体积浓度为6％，盐溶液的质量体积浓度为6％；
(2)高温硫酸水解精巢核蛋白
将经过预处理并洗净的鲤鱼精巢置于反应釜中，加入精巢重量3倍的去离子水，加入浓硫酸调节pH为1.5，反应温度为88℃，搅拌反应2.5小时；
(3)美拉德反应
在高温条件下，先加入氢氧化钙调节pH为6.5，再加入氢氧化钠调节pH为10；加入鲤鱼精巢重量0.06倍的果糖，反应温度为100℃，搅拌反应30分钟；
(4)吸附脱腥与连续流离心过滤
美拉德反应结束后，降温至40℃，加入鲤鱼精巢重量0.006倍的活性炭，搅拌0.5小时；然后用连续流离心机在12500rpm下高速离心得到鲤鱼精巢核蛋白肽粗提液；
(5)多级膜分离
鲤鱼精巢核蛋白肽粗提液先通过孔径为0.8μm的陶瓷膜，流速为120立方米/小时，膜压力为0.6Mpa，温度为35℃；所得的透过清液再用相对分子质量为200Da的纳滤膜截留，流速为14立方米/小时，膜压力为2.50Mpa，温度为35℃，并进一步浓缩得到含量为98.36％的鲤鱼鱼精蛋白肽溶液。
(6)快速干燥
利用喷雾干燥快速干燥蛋白肽溶液，得到鲤鱼鱼精蛋白肽粉成品，喷雾干燥的进风温度为155℃、出风温度为80℃。
如表1所示，无论是海洋鱼类的鱼精蛋白肽(以鲀鱼鱼精蛋白肽为例)，还是淡水鱼类的鱼精蛋白肽(以鲢鱼鱼精蛋白肽为例)，亦或是软体生物的鱼精蛋白肽(以鱿鱼鱼精蛋白肽为例)，相较于单一酶解法(8种，24小时)和复合酶解法(6种，24小时)，采用本发明的高温硫酸水解方法制备的鱼精蛋白肽产率最高，时间成本最小(5小时)。
基于表2的风味评定标准并如表3所示，无论是海洋鱼类的鱼精蛋白(以鲀鱼鱼精蛋白为例)，还是淡水鱼类的鱼精蛋白(以鲢鱼鱼精蛋白为例)，亦或是软体生物的鱼精蛋白(以鱿鱼鱼精蛋白为例)，在嗅觉方面，其固体状态的鱼精蛋白粗提物的腥味偏重，更是令人讨厌，绝大多数的人不能接收的腥味；这导致鱼精蛋白粗提物的鱼香味被严重压制，令受试者感觉其鱼香味几乎不存在；由于各种水生生物的鱼精蛋白粗提物的腥味均令人反感，本实验的受试者实在不愿意进一步品尝判断其鲜味和苦味，所以，鱼精蛋白粗提物没有味觉数据。
基于表2的风味评定标准并如表3所示，无论是海洋鱼类的鱼精蛋白(以鲀鱼鱼精蛋白为例)，还是淡水鱼类的鱼精蛋白(以鲢鱼鱼精蛋白为例)，亦或是软体生物的鱼精蛋白(以鱿鱼鱼精蛋白为例)，在嗅觉方面，其固体状态的鱼精蛋白纯品几乎只有轻微的鱼香味和不太明显的腥味；与之相比，本发明制备的鱼精蛋白肽具有较为浓郁的鱼香味，并且几乎感觉不到腥味；在味觉方面，本发明制备的鱼精蛋白肽(固体状态)均优于鱼精蛋白纯品(固体状态)，其表现出更浓郁的鲜味和更轻微的苦味。
基于表2的风味评定标准并如表4所示，无论是海洋鱼类的鱼精蛋白(以鲀鱼鱼精蛋白为例)，还是淡水鱼类的鱼精蛋白(以鲢鱼鱼精蛋白为例)，亦或是软体生物的鱼精蛋白(以鱿鱼鱼精蛋白为例)，在嗅觉方面，其溶液状态(1％含量)的鱼精蛋白粗提物腥味虽然略有改善，但仍然偏重，仍然会严重压制鱼精蛋白粗提物的鱼香味，使受试者感觉不到鱼香味的存在；由于各种水生生物的鱼精蛋白粗提物溶液的腥味还是令人讨厌，绝大多数的人不能接收的腥味，本实验的受试者也实在不愿意进一步品尝判断其鲜味和苦味，所以，鱼精蛋白粗提物溶液仍然没有味觉数据。
基于表2的风味评定标准并如表4所示，无论是海洋鱼类的鱼精蛋白(以鲀鱼鱼精蛋白为例)，还是淡水鱼类的鱼精蛋白(以鲢鱼鱼精蛋白为例)，亦或是软体生物的鱼精蛋白(以鱿鱼鱼精蛋白为例)，在嗅觉方面，其溶液状态(1％含量)的鱼精蛋白纯品几乎只有轻微的鱼香味和不太明显的腥味；与之相比，本发明制备的鱼精蛋白肽的鱼香味虽然略有减弱，但仍旧浓郁，并且几乎感觉不到腥味；在味觉方面，本发明制备的鱼精蛋白肽(溶液状态)也均优于鱼精蛋白纯品(溶液状态)，其依旧表现出更浓郁的鲜味和更轻微的苦味。
表3和表4的结果说明：无论是在固体状态，还是在溶液状态，本发明制备的鱼精蛋白肽，相比于鱼精蛋白粗提物和纯品，在味觉方面，表现出更浓郁的鱼香味而几乎没有令人讨厌的腥味，在嗅觉方面，本发明制备的鱼精蛋白肽表现出更浓郁的鲜味而几乎苦味。因此，本发明制备的鱼精蛋白肽更易于吸引消费者食用，并有望作为一种风味良好的营养添加剂应用于食品领域。
基于表2的风味评定标准并如表5和表6所示，无论是海洋鱼类的鱼精蛋白肽(以鲀鱼鱼精蛋白肽为例)，还是淡水鱼类的鱼精蛋白肽(以鲢鱼鱼精蛋白肽为例)，亦或是软体生物的鱼精蛋白肽(以鱿鱼鱼精蛋白肽为例)，采用本发明的美拉德反应以及随后的吸附脱腥方法制备的水生生物鱼精蛋白肽，相比于只采用吸附脱腥方法制备的水生生物鱼精蛋白肽，无论是处于固体状态，还是处于溶液状态，在味觉方面，表现出更浓郁的鱼香味而几乎没有令人讨厌的腥味，在嗅觉方面，采用本发明的美拉德反应制备的鱼精蛋白肽表现出更浓郁的鲜味而几乎没有苦味。
表5和表6的结果说明：本发明工艺采用的美拉德反应能够有效改善鱼精蛋白肽产品的风味，实现降腥增香、除苦提鲜的良好效果。
如表7、表8和表9所示，无论是海洋鱼类的鱼精蛋白(以鲀鱼鱼精蛋白为例)，还是淡水鱼类的鱼精蛋白(以鲢鱼鱼精蛋白为例)，亦或是软体生物的鱼精蛋白(以鱿鱼鱼精蛋白为例)，其鱼精蛋白纯品与本发明制备的鱼精蛋白肽均含有较多的精氨酸，符合鱼精蛋白的氨基酸特征，且两者的氨基酸组成与含量基本相同。这个结果证明：本发明制备的鱼精蛋白肽可以被认为是鱼精蛋白的水解产物——鱼精蛋白肽。
如图4、图5和图6所示，无论是海洋鱼类的鱼精蛋白(以鲀鱼鱼精蛋白为例)，还是淡水鱼类的鱼精蛋白(以鲢鱼鱼精蛋白为例)，亦或是软体生物的鱼精蛋白(以鱿鱼鱼精蛋白为例)，其模拟人体胃肠道消化得到的鱼精蛋白肽与本发明制备的鱼精蛋白肽的分子量分布基本相同。由于在人体中，蛋白是以消化成1000Da以下的小肽的形式被胃肠道吸收并进入血液循环，这个分子量分布结果表明：本发明制备的鱼精蛋白肽可以代替制备工艺(提取、分离、纯化工艺)复杂耗时的鱼精蛋白纯品被人体吸收利用。
如图7所示，对比核苷酸标准品的色谱图，本发明制备的鱼精蛋白肽中没有核苷酸存在。这个结果一方面说明：本发明工艺采用的多级膜分离技术可以有效去除核苷酸；这个结果也从另一方面进一步证明：本发明制备的最终产品是鱼精蛋白肽，而不是核蛋白肽。
表1
Figure BDA0003246327330000131
表2
Figure BDA0003246327330000132
Figure BDA0003246327330000141
表3
Figure BDA0003246327330000142
表4
Figure BDA0003246327330000143
表5
Figure BDA0003246327330000151
表6
Figure BDA0003246327330000152
表7
Figure BDA0003246327330000153
Figure BDA0003246327330000161
表8
Figure BDA0003246327330000162
Figure BDA0003246327330000171
表9
Figure BDA0003246327330000172

Claims (10)

1.一种鱼精蛋白肽规模化制备方法，包括如下步骤如下：
(1)原料预处理
将水生生物成熟精巢组织投入反应釜中，加入精巢重量0.5～5倍的弱碱与盐混合液，搅拌0.5～3小时，除掉精巢的脂肪和杂蛋白，以及清洗表面污垢等杂质，用水洗净，其中弱碱溶液的质量体积浓度为1～6％，盐溶液的质量体积浓度为1～10％；
(2)高温硫酸水解精巢核蛋白
将经过预处理并洗净的精巢置于反应釜中，加入精巢重量0.5～5倍的去离子水，加入浓硫酸调节pH为1～3，反应温度为85～100℃，搅拌反应2～6小时；
(3)美拉德反应
在高温条件下，先加入氢氧化钙调节pH为5.5～6.5，再加入强碱调节pH为7～10；加入精巢重量0.01～0.2倍的还原糖，反应温度为85～100℃，搅拌反应10分钟～2小时；
(4)吸附脱腥与连续流离心过滤
美拉德反应结束后，降温至40～55℃，加入精巢重量0.001～0.02倍的吸附剂，搅拌0.5～1.5小时；然后用连续流离心机高速离心得到精巢核蛋白肽粗提液；
(5)多级膜分离
精巢核蛋白肽粗提液先用孔径为0.8～0.1μm的陶瓷膜去除其中的固体残渣，所得清液再用相对分子质量为500～200Da的纳滤膜去除核糖、碱基、核苷酸等小分子杂质和部分无机盐，并进一步浓缩得到含量≥95％的鱼精蛋白肽溶液。
2.根据权利要求1所述一种鱼精蛋白肽规模化制备方法，其特征在于：步骤(1)原料预处理所使用的水生生物成熟精巢组织为海洋鱼类或淡水鱼类的成熟精巢组织，亦或是软体生物成熟精巢组织。
3.根据权利要求1所述一种鱼精蛋白肽规模化制备方法，其特征在于：步骤(1)原料预处理所使用的弱碱为碳酸氢钠或碳酸氢钾；盐为氯化钠或氯化钾中的至少一种。
4.根据权利要求1所述一种鱼精蛋白肽规模化制备方法，其特征在于：步骤(3)调节pH所使用的碱为氢氧化钠或氢氧化钾；参与美拉德反应的还原糖为葡萄糖、蔗糖、木糖、半乳糖、果糖、阿拉伯糖、核糖或甘露糖中的至少一种。
5.根据权利要求1所述一种鱼精蛋白肽规模化制备方法，其特征在于：步骤(4)中所使用的吸附剂为活性炭、高岭土或氧化铝中的至少一种。
6.根据权利要求1所述一种鱼精蛋白肽规模化制备方法，其特征在于：步骤(4)中所使用的离心机为10000～15000rpm的连续流离心机。
7.根据权利要求1所述一种鱼精蛋白肽规模化制备方法，其特征在于：步骤(5)分离所使用的孔径为0.8～0.1μm的陶瓷膜流速为10～120立方米/小时，膜压力为0.1～0.6Mpa，温度为20～50℃；分离所使用的相对分子量为500～200Da的纳滤膜流速为5～14立方米/小时，膜压力为0.5～2.5Mpa，温度为20～50℃。
8.根据权利要求1至7任一项所述一种鱼精蛋白肽规模化制备方法，其特征在于：还包括步骤(6)利用喷雾干燥快速干燥蛋白肽溶液，得到鱼精蛋白肽粉成品。
9.根据权利要求1至7任一项所述的制备方法得到的鱼精蛋白肽。
10.根据权利要求9所述一种鱼精蛋白肽规模化制备方法，其特征在于：步骤(6)中鱼精蛋白肽90％以上的分子量分布在1000道尔顿以下。
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