CN113917159A - 一种淋巴细胞亚群的流式检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种淋巴细胞亚群的流式检测方法。本发明中，以量子点偶联产物荧光效率测定、偶联产物的免疫反应性测定和量子点偶联产物检测目的蛋白抗原的方式通过将荧光微球偶联抗体检测目的蛋白，从而达到了更加快速准确的检测方式，从而提高了检测速率，为人们的研究带来了更多的便利。流式细胞术整体表现出其快速，高灵敏度，高准确性和重复性的优势；灵敏度高：高度灵敏的荧光标记与检测系统；高效：减少样本处理与生物源性污染接近生物体的分析条件：全血检测保留细胞及生化微环境更准确反映了体内状况，从而提高了试验数据的准确性，为后续的治疗监测研究提供了更专业准确的数据。
Description
技术领域
本发明属于细胞检测技术领域，具体为一种淋巴细胞亚群的流式检测方法。
背景技术
流式细胞术工作原理是在细胞分子水平上通过单克隆抗体对单个细胞或其他生物粒子进行多参数、快速的定量分析。它可以高速分析上万个细胞，并能同时从一个细胞中测得多个参数，具有速度快、精度高、准确性好的优点，是当代最先进的细胞定量分析技术之一。光源、液流通路、信号检测传输和数据的分析系统是流式细胞仪的主要组成。目前临床中运用流式细胞仪进行外周血白细胞、骨髓细胞以及肿瘤细胞等的检测是临床检测的重要组成部分。
但是常见的细胞监测方法准确性不够高，使得后续的使用过程中容易出现误差。
发明内容
本发明的目的在于：为了解决上述提出的问题，提供一种淋巴细胞亚群的流式检测方法。
本发明采用的技术方案如下：一种淋巴细胞亚群的流式检测方法，所述淋巴细胞亚群的流式检测方法包括以下步骤:
S1:先进行样品的制备：采取一定量淋巴细胞，在每一管中分别加入50μl的HAB，并充分混匀，于室温中静置3～～5min,再直接加入连接有荧光素的抗体进行免疫标记反应，
S2:从冰箱低温环境中取出菌种保存管，在无菌操作环境下倒出一部分步骤S1中处理过后的淋巴细胞置于已经灭菌处理的LB肉汤中，进行过夜培养；
S3:按照国标法将25g进行灭菌处理过的豆腐与225mL生理盐水混合制成1：10的混合匀液，分别加入大肠杆菌菌液0.1mL于其中，
S4:再取1mL菌悬液加入到9mL样品匀液中进行10倍系列的稀释淋巴细胞悬液用于流式检测；
S5:从步骤S4中的稀释淋巴细胞悬液收获细胞：按1：1与培养基混匀，加刺激剂4ml，同时加蛋白转运抑制剂，混匀后，置于37℃，5％二氧化碳培养4-6小时；
S6:阻断Fc受体：用于消除非特异性的结合染色；可使用纯化的FcII/III受体的CD16/32抗体，按照1ug/106细胞的用量，在染色缓冲液中4℃孵育15分钟，PBS清洗后，直接进行下一步染色；
S7:步骤S6结束之后，进行细胞表面染色，加适当的细胞表面染色试剂20L于Falcon管中，加入100L激活后的全血(细胞浓度维持在2×106/mL)混匀，之后室温暗处孵育；
S8:加入溶血素，室温暗处孵育10分钟；使用离心机控制离心速度为500g的情况下离心处理5分钟，弃上清；
S9:加固定剂10～～15ml，室温暗处孵育15分钟，再使用离心机控制离心速度为500g的情况下离心处理5分钟，弃上清；加破膜剂温暗处孵育10分钟
S10:加2～～3mLPBS洗液，离心500g 5分钟，再使用离心机控制离心速度为500g的情况下离心处理，离心处理5分钟之后弃上清；
S11:加入荧光标记的细胞因子抗体，混匀，室温暗处孵育30分钟；加2～～3mL洗液，再使用离心机控制离心速度为500g的情况下离心处理，离心处理5分钟之后弃上清，加入500LPBS上机或加入500L1％PFA固定后再进行最终的流式检测；
S12:采集10000个细胞，由FACSDiva软件分析；流式双色标记分析按常规通过FSC、SSC显示图圈选整个细胞群设为P1门，以去除细胞碎片，AnnexinV-FITC为横坐标、PI为纵坐标作图，作为AnnexinV-,FITC/PI显示体系，显示体系中的Q4为FITC+/PI-，Q2为FITC+/PI+，Q3象限中细胞为FITC-/PI；
S12:经SPSS16.0软件分析，各组结果比较用one-way ANOVA进行检验，对数据进行记录保存，从而结束整个试验过程。
在一优选的实施方式中，所述步骤S1中，淋巴细胞的浓度控制在约1X106细胞/ml，进行免疫标记反应之后将样品放入冰箱中保存，此时冰箱的温度设置在-10℃。
在一优选的实施方式中，所述步骤S3中，使用第一抗体之后，将样品与5％至10％的来自于同一寄主的正常血清和作为标记的第二抗体一起培育。
在一优选的实施方式中，所述步骤S2中，使用肝素钠抗凝的真空采血管采取淋巴细胞，不易采用肝素锂、EDTA和ACD抗凝剂。
在一优选的实施方式中，所述步骤S3中，加入大肠杆菌菌液0.1mL于其中之后，在8小时内分析，超过8小时会导致活性的损失，一般细胞因子阳性细胞会减少5％；如不能在8小时之内检测，应将真空采血管水平室温放置。
在一优选的实施方式中，所述步骤S5中，刺激剂为2ML的10ng/ml的PMA溶液和2ML的Ionomycin溶液的混合物。
在一优选的实施方式中，所述步骤S7中，细胞浓度维持在2×106/mL混匀，室温暗处的温度控制在20～～25℃，培育的时间控制为15分钟。
在一优选的实施方式中，所述步骤S9中，固定剂为含4％的多聚甲醛PBS溶液，破膜剂为1％皂甙混合0.05％叠氮化钠的Hanks溶液。
综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：
1、本发明中，采用了流式定量检测细胞内细胞因子可在一天内完成，实验流程需6-8小时，流式细胞术整体表现出其快速，高灵敏度，高准确性和重复性的优势；灵敏度高：高度灵敏的荧光标记与检测系统；高效：可以在同一个细胞内同时检测两种或更多种细胞因子，也可根据细胞免疫表型区分分泌细胞因子的细胞的亚型，进行多参数相关分析；安全：减少样本处理与生物源性污染接近生物体的分析条件：全血检测保留细胞及生化微环境更准确反映了体内状况，从而提高了试验数据的准确性，为后续的治疗监测研究提供了更专业准确的数据。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例：
一种淋巴细胞亚群的流式检测方法，所述淋巴细胞亚群的流式检测方法包括以下步骤:
S1:先进行样品的制备：采取一定量淋巴细胞，在每一管中分别加入50μl的HAB，并充分混匀，于室温中静置3～～5min,再直接加入连接有荧光素的抗体进行免疫标记反应；步骤S1中，淋巴细胞的浓度控制在约1X106细胞/ml，进行免疫标记反应之后将样品放入冰箱中保存，此时冰箱的温度设置在-10℃；
S2:从冰箱低温环境中取出菌种保存管，在无菌操作环境下倒出一部分步骤S1中处理过后的淋巴细胞置于已经灭菌处理的LB肉汤中，进行过夜培养；所述步骤S2中，使用肝素钠抗凝的真空采血管采取淋巴细胞，不易采用肝素锂、EDTA和ACD抗凝剂；
S3:按照国标法将25g进行灭菌处理过的豆腐与225mL生理盐水混合制成1：10的混合匀液，分别加入大肠杆菌菌液0.1mL于其中；所述步骤S3中，使用第一抗体之后，将样品与5％至10％的来自于同一寄主的正常血清和作为标记的第二抗体一起培育；步骤S3中，加入大肠杆菌菌液0.1mL于其中之后，在8小时内分析，超过8小时会导致活性的损失，一般细胞因子阳性细胞会减少5％；如不能在8小时之内检测，应将真空采血管水平室温放置；
S4:再取1mL菌悬液加入到9mL样品匀液中进行10倍系列的稀释淋巴细胞悬液用于流式检测；
S5:从步骤S4中的稀释淋巴细胞悬液收获细胞：按1：1与培养基混匀，加刺激剂4ml，同时加蛋白转运抑制剂，混匀后，置于37℃，5％二氧化碳培养4-6小时；步骤S5中，刺激剂为2ML的10ng/ml的PMA溶液和2ML的Ionomycin溶液的混合物；
S6:阻断Fc受体：用于消除非特异性的结合染色；可使用纯化的FcII/III受体的CD16/32抗体，按照1ug/106细胞的用量，在染色缓冲液中4℃孵育15分钟，PBS清洗后，直接进行下一步染色；
S7:步骤S6结束之后，进行细胞表面染色，加适当的细胞表面染色试剂20L于Falcon管中，加入100L激活后的全血(细胞浓度维持在2×106/mL)混匀，之后室温暗处孵育；步骤S7中，细胞浓度维持在2×106/mL混匀，室温暗处的温度控制在20～～25℃，培育的时间控制为15分钟；
S8:加入溶血素，室温暗处孵育10分钟；使用离心机控制离心速度为500g的情况下离心处理5分钟，弃上清；
S9:加固定剂10～～15ml，室温暗处孵育15分钟，再使用离心机控制离心速度为500g的情况下离心处理5分钟，弃上清；加破膜剂温暗处孵育10分钟；步骤S9中，固定剂为含4％的多聚甲醛PBS溶液，破膜剂为1％皂甙混合0.05％叠氮化钠的Hanks溶液；
S10:加2～～3mLPBS洗液，离心500g 5分钟，再使用离心机控制离心速度为500g的情况下离心处理，离心处理5分钟之后弃上清；
S11:加入荧光标记的细胞因子抗体，混匀，室温暗处孵育30分钟；加2～～3mL洗液，再使用离心机控制离心速度为500g的情况下离心处理，离心处理5分钟之后弃上清，加入500LPBS上机或加入500L1％PFA固定后再进行最终的流式检测；
S12:采集10000个细胞，由FACSDiva软件分析。流式双色标记分析按常规通过FSC、SSC显示图圈选整个细胞群设为P1门，以去除细胞碎片，AnnexinV-FITC为横坐标、PI为纵坐标作图，作为AnnexinV-,FITC/PI显示体系，显示体系中的Q4为FITC+/PI-，Q2为FITC+/PI+，Q3象限中细胞为FITC-/PI；
S12:经SPSS16.0软件分析，各组结果比较用one-way ANOVA进行检验，对数据进行记录保存，从而结束整个试验过程；采用了流式定量检测细胞内细胞因子可在一天内完成，实验流程需6-8小时，流式细胞术整体表现出其快速，高灵敏度，高准确性和重复性的优势；灵敏度高：高度灵敏的荧光标记与检测系统；高效：可以在同一个细胞内同时检测两种或更多种细胞因子，也可根据细胞免疫表型区分分泌细胞因子的细胞的亚型，进行多参数相关分析；安全：减少样本处理与生物源性污染接近生物体的分析条件：全血检测保留细胞及生化微环境更准确反映了体内状况，从而提高了试验数据的准确性，为后续的治疗监测研究提供了更专业准确的数据。
需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。
Claims (8)
1.一种淋巴细胞亚群的流式检测方法，其特征在于：所述淋巴细胞亚群的流式检测方法包括以下步骤:
S1:先进行样品的制备：采取一定量淋巴细胞，在每一管中分别加入50μl的HAB，并充分混匀，于室温中静置3～～5min,再直接加入连接有荧光素的抗体进行免疫标记反应，
S2:从冰箱低温环境中取出菌种保存管，在无菌操作环境下倒出一部分步骤S1中处理过后的淋巴细胞置于已经灭菌处理的LB肉汤中，进行过夜培养；
S3:按照国标法将25g进行灭菌处理过的豆腐与225mL生理盐水混合制成1：10的混合匀液，分别加入大肠杆菌菌液0.1mL于其中，
S4:再取1mL菌悬液加入到9mL样品匀液中进行10倍系列的稀释淋巴细胞悬液用于流式检测；
S5:从步骤S4中的稀释淋巴细胞悬液收获细胞：按1：1与培养基混匀，加刺激剂4ml，同时加蛋白转运抑制剂；
S6:阻断Fc受体：用于消除非特异性的结合染色；可使用纯化的FcII/III受体的CD16/32抗体，按照1ug/106细胞的用量，在染色缓冲液中4℃孵育15分钟，PBS清洗后，直接进行下一步染色；
S7:步骤S6结束之后，进行细胞表面染色，加适当的细胞表面染色试剂20L于Falcon管中，加入100L激活后的全血(细胞浓度维持在2×106/mL)混匀，之后室温暗处孵育；
S8:加入溶血素，室温暗处孵育10分钟；使用离心机控制离心速度为500g的情况下离心处理5分钟，弃上清；
S9:加固定剂10～～15ml，室温暗处孵育15分钟，再使用离心机控制离心速度为500g的情况下离心处理5分钟，弃上清；加破膜剂温暗处孵育10分钟；
S10:加2～～3mLPBS洗液，离心500g 5分钟，再使用离心机控制离心速度为500g的情况下离心处理，离心处理5分钟之后弃上清；
S11:加入荧光标记的细胞因子抗体，混匀，室温暗处孵育30分钟；加2～～3mL洗液，离心处理5分钟之后弃上清，加入500LPBS上机或加入500L1％PFA固定后再进行最终的流式检测；
S12:采集10000个细胞，由FACSDiva软件分析；流式双色标记分析按常规通过FSC、SSC显示圈选整个细胞群设为P1门，以去除细胞碎片；
S12:经SPSS16.0软件分析，各组结果比较用one-way ANOVA进行检验，对数据进行记录保存，从而结束整个试验过程。
2.如权利要求1所述的一种淋巴细胞亚群的流式检测方法，其特征在于：所述步骤S1中，淋巴细胞的浓度控制在约1X106细胞/ml，进行免疫标记反应之后将样品放入冰箱中保存，此时冰箱的温度设置在-10℃。
3.如权利要求1所述的一种淋巴细胞亚群的流式检测方法，其特征在于：所述步骤S3中，使用第一抗体之后，将样品与5％至10％的来自于同一寄主的正常血清和作为标记的第二抗体一起培育。
4.如权利要求1所述的一种淋巴细胞亚群的流式检测方法，其特征在于：所述步骤S2中，使用肝素钠抗凝的真空采血管采取淋巴细胞，不易采用肝素锂、EDTA和ACD抗凝剂。
5.如权利要求1所述的一种淋巴细胞亚群的流式检测方法，其特征在于：所述步骤S3中，加入大肠杆菌菌液0.1mL于其中之后，在8小时内分析，超过8小时会导致活性的损失，一般细胞因子阳性细胞会减少5％；如不能在8小时之内检测，应将真空采血管水平室温放置。
6.如权利要求1所述的一种淋巴细胞亚群的流式检测方法，其特征在于：所述步骤S5中，刺激剂为2ML的10ng/ml的PMA溶液和2ML的Ionomycin溶液的混合物。
7.如权利要求1所述的一种淋巴细胞亚群的流式检测方法，其特征在于：所述步骤S7中，细胞浓度维持在2×106/mL混匀，室温暗处的温度控制在20～～25℃，培育的时间控制为15分钟。
8.如权利要求1所述的一种淋巴细胞亚群的流式检测方法，其特征在于：所述步骤S9中，固定剂为含4％的多聚甲醛PBS溶液，破膜剂为1％皂甙混合0.05％叠氮化钠的Hanks溶液。
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