CN113912674A - 骨转换指标物在制备骨质疏松预测诊断制剂中的应用及试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种骨转换指标物在制备骨质疏松预测诊断制剂中的应用和试剂盒。本发明首次发现了两条人工合成的骨重建调节多肽在人体内存在，并通过抗原抗体检测发现它们的表达量在骨质疏松患者和正常人之间具有显著差异，因此可以用于骨质疏松预测或者诊断，为骨质疏松检测技术领域提供了新的分子标记物。本发明的试剂盒在诊断和预测和预后骨质疏松上具有良好的灵敏度、特异性、线性范围、稳定性等性能指标，具有很好的应用前景。

Description

骨转换指标物在制备骨质疏松预测诊断制剂中的应用及试 剂盒

技术领域

本发明属于骨质疏松诊断技术领域，具体涉及一种骨转换指标物在制备骨质疏松预测诊断制剂中的应用及试剂盒。

背景技术

骨代谢紊乱尤其是骨质疏松症非常普遍，可使骨折风险、发病率和死亡率增高。骨代谢紊乱的诊断、鉴别诊断和监测是一项重大挑战，因为这些疾病的发生通常是无症状的，并且骨量的放射学检测对骨生理学变化的反应缓慢。

本发明前期应用生物信息学技术，通过序列比对、结构分析、理化性质和功能预测，结合可与Ⅱ、Ⅲ型胶原受体结合的核心氨基酸序列设计原理，利用固相多肽合成方法，创新性的设计并合成了包含9个氨基酸序列的4段源于Ⅰ型胶原的多肽及1段来源于Ⅱ、Ⅲ型胶原的多肽，并把5条多肽统称为骨重建调节多肽。发现新合成的5段骨重建调节多肽具有较低的细胞毒性、较高的生物稳定性和适当的半衰期。随后利用小鼠原代骨髓单核细胞(BMMs)在RANKL、M-CSF诱导条件下构建体外破骨细胞分化模型，同时利用牛骨片、BMMs在RANKL、M-CSF诱导条件下构建骨吸收模型，利用WGA染色观察骨吸收陷窝形成情况，结果发现：骨重建调节多肽可以浓度特异性调控骨重建。

本发明把这5条骨重建调节多肽称为CP1-CP5，利用质谱检测这5条人工合成的多肽是否都在骨吸收上清、血清中存在，首次发现CP1、CP3存在，并制备了CP1、CP3多克隆抗体，以及单克隆抗体，由此，研发出检测CP1和/或CP3的试剂盒，进一步，发现它们的含量在骨质疏松患者和正常人之间存在显著性差异；预示着它们可以作为诊断和预测骨质疏松的标记物。

发明内容

本发明的首要目的是提供一种骨转换指标物在制备骨质疏松预测诊断制剂中的应用。本发明首次发现了两条人工合成的骨重建调节多肽在人体内存在，并通过抗原抗体检测发现它们的表达量在骨质疏松患者和正常人之间具有显著差异，因此可以用于骨质疏松预测或者诊断，为骨质疏松检测技术领域提供了新的分子标记物。

所述的骨转换指标物(即人工合成的骨重建调节多肽)的序列如下：

CP1：Gly-Ala-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly-Phe-Gln，

CP3：Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Ala-Gly-Phe-Ala。

进一步地，骨质疏松预测诊断制剂为检测CP1和/或CP3含量的试剂。

进一步地，所述的检测CP1和/或CP3含量的试剂包括电化学发光法检测CP1和/或CP3含量的试剂。

进一步地，所述的检测CP1和/或CP3含量的试剂的检测对象包含体液，优选血清。

更进一步地，检测对象为人或小鼠的体液，包括血清或者骨吸收上清。可以用于判断人或者小鼠骨质疏松的诊断或者预测。

本发明的第二个目的是提供一种骨质疏松预测诊断试剂盒，包含检测骨转换指标物CP1和/或CP3的试剂；

CP1序列：Gly-Ala-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly-Phe-Gln，

CP3序列：Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Ala-Gly-Phe-Ala。

进一步地，所述的检测骨转换指标物CP1和/或CP3的试剂为检测骨转换指标物CP1和/或CP3含量的试剂。

进一步地，所述的检测骨转换指标物CP1和/或CP3含量的试剂为电化学发光法检测CP1和/或CP3含量的试剂。

进一步地，所述的电化学发光法检测CP1和/或CP3含量的试剂包含检测CP1和/或CP3所需抗体。

进一步地，还包括电化学发光法检测CP1和/或CP3含量所需的其他试剂。

进一步地，所述的试剂盒，检测对象包含体液，优选血清。

更进一步地，检测对象为人或小鼠的体液，包括血清或者骨吸收上清。可以用于判断人或者小鼠骨质疏松的诊断或者预测。

以CP3为例制备的试剂盒包括：链霉亲和素偶联的磁性微粒工作液，生物素标记的CP3抗体工作液，三联吡啶钌标记的抗CP3抗体工作液，CP3的校准品和/或质控品工作液，电化学发光底物液，清洗液。

所制备试剂盒的发光体系为电化学发光，利用链霉亲和素-生物素生物反应信号放大系统，检测速度快、灵敏度高、线性范围宽、检测结果重复性好，能够实现血液中CP3的准确定量检测。

所述的检测CP3的电化学发光试剂盒，所述CP3抗体为单克隆抗体或者单克隆抗体Fab片段，抗CP3抗体为多克隆抗体，或多克隆抗体Fab片段，优选来源于鼠、兔、羊。

所述链霉亲和素偶联的磁性微粒工作液由pH为6.8～7.6，浓度为0.01mol/L～0.2mol/L的磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液、HEPES缓冲液、MOPSO缓冲液中的一种配制而成，所述缓冲液含有0.05～2wt％的牛血清白蛋白和/或酪蛋白、0.02～1wt％的十二烷基聚乙二醇醚(Brij35)和/或聚乙二醇对异辛基苯基醚(Triton X-100)和/或聚氧乙烯失水山梨醇单月桂酸酯(Tween 20)和/或月桂醇聚氧乙烯醚(O-20)、0.05～0.5wt％的proclin 300和/或叠氮钠。

所述生物素标记的CP3抗体工作液以及三联吡啶钌标记的抗CP3抗体工作液由pH为6.0～7.6，浓度为0.01mol/L～0.2mol/L的磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液、HEPES缓冲液、MOPSO缓冲液中的一种配制而成，所述缓冲液含有0.5～5wt％的牛血清白蛋白、0.1mg/L～100mg/L的鼠IgG、0.5～5wt％的氯化钠、1～5wt％的蔗糖、0.05～2wt％的小牛血清、0.02～1wt％的酪蛋白、0.02～1wt％的Brij35和/或Triton X-100和/或Tween 20和/或O-20、0.05～0.5wt％的proclin 300和/或叠氮钠。

所述CP3校准品工作液和/或质控品工作液由pH为6.0～7.6，浓度为0.01mol/L～0.2mol/L的磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液、HEPES缓冲液、MES缓冲液中的一种配制而成，所述缓冲液中含有0.5～5wt％的牛血清白蛋白、10～50wt％的人血清、0.5～3wt％的氯化钠、2～20wt％的乙二醇、0.02～1wt％的Brij35和/或Triton X-100和/或Tween 20和/或O-20、0.05～0.5wt％的proclin 300和/或叠氮钠。

所述电化学发光底物液由pH为6.0～7.6，浓度为0.01mol/L～0.2mol/L的磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液、HEPES缓冲液、MES缓冲液中的一种配制而成，所述缓冲液中含有0.15mol/L三丙胺、0.05wt％Brij-35、0.01wt％proclin 300。

所述清洗液为pH为13以上，浓度为0.1mol/L～0.5mol/L的KOH溶液，所述清洗液含有0.01～2wt％的烷基聚乙二醇类表面活性剂。

生物素标记的CP3抗体的制备方法为：将N-羟基琥珀酰亚胺活化的生物素与CP3抗体按照1-20:1的摩尔比在2-8℃或室温条件下混匀反应0.5-2小时，透析除去多余的生物素，得生物素标记的CP3抗体，这里的CP3抗体优选单克隆抗体。

三联吡啶钌标记抗CP3抗体的制备方法为：将pH为6.5-8.0的抗CP3抗体溶液与Ru-NHS酯溶液混合，使抗CP3抗体与Ru-NHS酯的质量比为5-20:1，37℃避光反应1-3小时，然后加入甘氨酸溶液终止反应，将反应液透析除去多余的Ru-NHS酯，得三联吡啶钌标记抗CP3抗体；这里的抗CP3抗体优选多克隆抗体。

进一步的，检测CP3的电化学发光试剂盒的制备方法如下：

1)链霉亲和素偶联的磁性微粒工作液的制备：

将链霉亲和素偶联的磁微粒悬浮液，磁分离去除上清，用pH为6.8，浓度为0.1mol/L的PBS缓冲液重悬至浓度为0.5mg/mL，所述缓冲液含有0.5wt％的牛血清白蛋白、0.05wt％的Triton X-100、0.05wt％proclin 300和0.05wt％叠氮钠；

2)生物素标记的CP3抗体的制备

取1mgCP3单克隆抗体，加入适量PBS缓冲液(0.05M，pH7.0-7.6)调整抗体总浓度至1mg/ml，并加入透析袋中进行透析，每隔3-4小时换一次透析液，更换3-4次，透析后将抗体转移至离心管或冻存管内；

准确称取1mg N-羟基琥珀酰亚胺活化的生物素(NHS-biotin)，加入适量水调整其浓度为2mg/mL，得NHS-biotin水溶液；

将NHS-biotin水溶液加入抗体中，使NHS-biotin与抗体按照5:1的摩尔比在室温混匀反应1小时，得生物素标记的CP3抗体溶液粗产品；

将生物素标记的CP3抗体溶液转移至透析袋，于PBS缓冲液(0.1M，pH 7.4)透析，每隔3～4小时换一次透析液，更换3～4次，透析后收集生物素标记的CP3抗体至离心管或冻存管内，≤-15℃冷冻保存备用。

3)三联吡啶钌标记抗CP3抗体的制备、纯化及标记

用DMSO配制浓度为10mg/mL的Ru-NHS溶液；用PBS缓冲液(0.1M，pH 7.4)配制浓度为1mg/mL的抗CP3抗体溶液；于1mL抗CP3抗体溶液中加入10μL新配制的Ru-NHS溶液，37℃避光反应2小时，然后加入20μL、2M的甘氨酸终止反应，将反应液于PBS缓冲液(0.1M，pH 7.4)透析过夜，更换3～4次透析液，回收三联吡啶钌标记的抗CP3抗体溶液，≤-15℃冷冻保存备用。

4)生物素标记的CP3抗体工作液以及三联吡啶钌标记抗CP3抗体工作液的制备

配制pH为6.5，浓度为0.1mol/L的磷酸盐缓冲液，所述缓冲液含有2wt％BSA、0.1wt％酪蛋白、1wt％氯化钠、1wt％蔗糖、2wt％小牛血清、0.5wt％Triton X-100、0.2wt％proclin 300；然后用该缓冲液配制抗体浓度为1mg/L的生物素标记的CP3抗体工作液，以及抗体浓度为8mg/L三联吡啶钌标记的抗CP3抗体工作液。

5)校准品和质控品工作液的配制

配制pH＝7.4，浓度为0.1mol/L的N-(2-羟乙基)哌嗪-N′-(2-乙磺酸)(HEPES)缓冲液，所述缓冲液含有1wt％BSA、20wt％人血清、1wt％氯化钠、5wt％乙二醇、0.1wt％Tween-20、0.2wt％proclin 300；然后用该缓冲液配制CP3校准品和质控品工作液，校准品共6个点，CP3的浓度分别为0ng/mL、0.2ng/mL、1ng/mL、5ng/mL、25ng/mL、100ng/mL。质控品分高、低两个浓度，CP3的浓度分别为1ng/mL、25ng/mL。

6)清洗液的配制

配制176mmol/L的KOH溶液，所配清洗液中含有0.15wt％Brij-35。

7)化学发光底物液的配制

pH＝6.5，浓度为0.15mol/L的磷酸盐缓冲液添加0.15mol/L三丙胺、0.05wt％Brij-35、0.01wt％proclin 300。

8)试剂分装及组装

将链霉亲和素包被的磁珠微粒工作液12mL/瓶、生物素标记的CP3抗体工作液12mL/瓶、三联吡啶钌标记的抗CP3抗体工作液12mL/瓶、校准品/质控品工作液1.0mL/瓶分装后，组装在一起，保存于2～8℃，将化学发光底物液380mL/瓶、清洗液380mL/瓶单独包装，保存于20～25℃。

试剂盒使用方法包括步骤如下：夹心法原理。总检测时间：18分钟。

(1)将样本(或校准品或质控品)、生物素标记的CP3抗体工作液各20uL，37℃一起孵育9分钟。

(2)将三联吡啶钌标记的抗CP3抗体工作液20uL和包被链霉亲合素的磁珠微粒工作液20ul加入到反应杯中，再次37℃孵育9分钟，形成抗体-抗原-抗体夹心复合物溶液，并在生物素和链霉亲和素的相互作用下形成固相。

(3)将反应液吸入测量池中，通过电磁作用将磁珠吸附在电极表面。未与磁珠结合的物质通过清洗液除去。紧接着，蠕动泵加入含三丙胺的化学发光底物液20ul，同时给电极加压，使复合体化学发光，并通过光电倍增器测量发光强度。

(4)通过检测仪的定标曲线得到最后的检测结果。

本发明有益效果：

本发明首次发现人工合成的骨转换指标物CPs在人体内真实存在，通过抗原抗体检测发现骨质疏松患者和正常人之间有显著差异，据此开发了一种具有自主知识产权的骨生化标志物电化学发光检测试剂盒，建立一种全新的骨生化标志物检测方法和分子标记物，从而为临床诊断骨质疏松提供充足依据。此外，本发明的试剂盒在诊断和预测和预后骨质疏松上具有良好的灵敏度、特异性、线性范围、稳定性等性能指标。

附图说明

图1是以CP3为例，抗血清、亲和纯化抗体ELISA效价检测结果；

图2是CP3抗体WB结果；

图3是CP1抗体WB结果；

图4骨吸收上清样本和血清样本中CP3的表达结果；

图5为本发明电化学发光法检测骨质疏松组和正常组β-CTX和CP3浓度差异结果；

图6为CP3浓度和β-CTX浓度相关性分析。

具体实施方式

以下结合实施例旨在进一步说明本发明，而非限制本发明。

实施例1：利用LC-MS质谱检测小鼠骨吸收上清和人血清中存在人工合成的骨重建调节多肽(CPs)

骨吸收上清样本收集：(1)无菌分离小鼠的双侧股骨、胫骨，培养基反复冲洗骨髓腔，获取骨髓细胞用含30ng/ml M-CSF的完全培养基培养1天，取未贴壁细胞用含30ng/mlM-CSF的完全培养基再培养3天，获得贴壁的小鼠原代骨髓源巨噬细胞(BMMs，为破骨前体细胞)备用。(2)分离小鼠颅骨制成骨片，将小鼠原代BMMs细胞接种至颅骨骨片，构建细胞-颅骨骨片三维培养体系，用100ng/ml RANKL和10ng/ml M-CSF在无血清培养基中(Thermo，货号12055091)诱导原代BMMs向破骨细胞分化并在骨片上进行骨吸收，待镜下可见明显破骨细胞形成时收集培养基上清(即骨吸收上清)。(3)骨吸收上清冻干浓缩，加入2×loadingbuffer混匀后37℃加热15min，上样电泳后考马斯亮蓝染色。

人血清采集：促凝管静脉采血5mL，室温静置半小时以上，4℃4000rpm离心10分钟，吸取上清，-80℃保存备用。血清冻干浓缩，加入2×loading buffer混匀后37℃加热15min，上样电泳后考马斯亮蓝染色。

试剂信息表

分离纯化肽段：

1.将切取的蛋白条带转入1.5mL离心管中，采用超纯水漂洗两次；

2.加入脱色液，脱色30min(以完全脱色为准)；

3.吸出脱色液，加入脱水液1，脱水30min；

4.吸出脱水液1，加入脱水液2，脱水30min，真空冻干；

5.冻干的胶块加入50μL还原液1，55℃温浴1h；

6.吸出液体，冷却至室温，加入50μL还原液2，避光放置30min；

7.吸出液体加入吸胀液，10min；

8.吸出吸胀液，加入脱水液1，脱水30min；

9.吸出脱水液1，加入脱水液2，脱水30min；

10.吸出脱水液2，加入10μL酶解工作液，吸胀30min；

11.加入20μL酶解覆盖液，37℃水浴酶解16h；

12.酶解后上清转移至另一新离心管中；

13.加入50μL肽段萃取液于剩下的胶中，37℃水浴20min，5000g离心5min，合并上清，再重复本步骤操作一次，挥干后待做脱盐。

肽段脱盐：

1.制备C18膜填充柱；

2.将挥干的多肽样品重新溶解于Nano-HPLC Buffer A中；

3.活化：40μL甲醇过柱离心1遍，弃掉EP管底部液体，重复2次；

4.平衡：40μL Nano-HPLC Buffer A过柱离心1遍，弃掉EP管底部液体，重复2次；

5.固肽：多肽样品过柱离心1遍，取EP管底部液体再过柱1遍；

6.脱盐：40μL Nano-HPLC Buffer A过柱离心1遍，弃掉EP管底部液体，重复2次；

7.洗脱：更换新的EP管，40μL洗脱相Buffer B过柱离心1遍，收集EP管底部液体，重复1次。

8.脱盐后含多肽样品的80μL洗脱相Buffer B进行挥干。

质谱与色谱操作

本次实验的分析仪器为Easy-nLC 1200超高效液相串联Q Exactive高分辨质谱仪组成的液质联用系统。

洗脱梯度

操作步骤如下：

1.将脱盐挥干的多肽样品重新溶解于Nano-HPLC Buffer A中。

2.采用Nano-HPLC液相系统EASY-nLC1200进行分离。液相A液为0.1％甲酸-水溶液，B液为0.1％甲酸-乙腈溶液。色谱柱Trap column，100μm×20mm(RP-C18,thermo Inc.)以100％的A液平衡。

3.样品由自动进样器上样并吸附到Trap column柱上，再经Analysis column，75μm×150mm(RP-C18,thermo Inc.)色谱柱分离，流速为300nL/min。样本间用空白溶剂30min流动相梯度清洗一次。

4.经毛细管高效液相色谱分离后用Q-Exactive质谱仪(Thermo Scientific)进行质谱分析。检测方式：使用前经标准校正液校正，母离子扫描范围：350-2000m/z，质谱扫描方式为信息依赖的采集工作模式下(DDA，Data Dependent Aqcuisition)，每次全扫描(full scan)后采集最强的20个碎片图谱(MS2 scan)，碎裂方式：高能碰撞解离(HCD，highenergy collision dissociation)，NCE能量28,动态排除时间：25s。MS1在M/Z 200时分辨率为70000，AGC target设置为3e6，最大注射时间100ms，MS2分辨率设置为17500，AGCtarget设置为1e5，最大注射时间50ms。

数据分析

1搜库参数

搜库参数

2鉴定结果

本次实验，人血清鉴定到的蛋白(多肽)数统计见下：

同理，小鼠骨吸收上清中也鉴定出CP1，CP3多肽。

结果：CP1，CP3在小鼠骨吸收上清、人血清中真实存在。

实施例2：多克隆抗体制备

1、抗原制备

1.1多肽合成

固相合成法按以下序列合成多肽,

CP1：GAPGPQGFQ

CP3：GPPGPAGFA

HPLC及MASS质检结果表明，合成的多肽序列正确，纯度大于99％，总量满足要求。

1.2多肽偶联

1.2.1MBS(m-Maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide，马来酰亚胺基苯甲酸琥珀酰亚胺酯)活化10mg载体蛋白KLH(Keyhole limpet hemocyanin，钥孔血蓝蛋白)，形成MBS-KLH连接物。

1.2.2中性pH环境下，MBS-KLH与不含Cys残基的合成肽交联，形成多肽-MBS-KLH共价复合物。该复合物为完全抗原，可做为免疫原制备抗体。

2.动物免疫

2.1实验动物

2-3月龄日本大耳白兔

2.2佐剂

第一次注射使用弗氏完全佐剂，以后加强注射使用弗氏不完全佐剂，均与等体积抗原充分混匀后注射。

2.3免疫方法

背部多点注射。

2.4免疫量：以下免疫量为标准免疫量。

2.5免疫周期：以下周期为标准操作周期。

3.抗血清纯化

3.1以常规方法将1mg纯化CP3或者CP1蛋白质共价连接至溴化氢活化的Sepharose4B柱，制备亲和纯化柱。

3.2 10ml抗血清与亲和纯化柱孵育过夜。

3.3 pH 5.0HCl预洗，除去杂抗体。

3.4 pH 2.5,0.15M甘氨酸缓冲液洗脱，10xPBS缓冲液迅速中和，制备亲和纯化抗体。

3.5对PBS缓冲液透析换液。

3.6 Bradford法检测纯化抗体浓度。

3.7间接ELISA检测抗血清及亲和纯化抗体效价。

具体方法为：

1)抗原包被：用包被液稀释抗原到2ug/ml，100μL/孔加入聚苯乙烯96孔反应板中，4℃放置过夜。

2)洗涤：次日弃掉孔内的液体，洗涤液洗3次。

3)封闭：加l50μL/孔封闭液，室温放置0.5h.

4)洗涤：用洗涤液洗3次。

5)加待测样品(一抗)：加入抗血清(取血4℃过夜后4000r/min离心10min，得上清)，用PBS将血清按1:2000,1:4000,1:8000，1:16000，1:32000，1:64000，1:128000......进行倍比稀释(空白血清做阴性对照)，每孔100ul，温育1h；纯化抗体按照1:5000的比例稀释；

6)洗涤：用洗涤液洗3次。

7)加酶标抗抗体：加入HRP标记IgG二抗，100μl/孔，37℃孵育40min。

8)羊抗小鼠-HRP稀释比例1：5000，羊抗兔-HRP稀释比例1：5000；

9)洗涤：用洗涤液洗5次，蒸馏水洗2次。

10)显色：加新鲜配制的底物溶液100μL/孔，室温暗处放置5～30min；

11)终止反应、比色：加50μL/孔终止液。颜色变黄；用酶标仪测定450nm处各孔的吸光值。

4.保存方法

4.1抗血清-20℃长期保存，避免反复冻融；

4.2亲和纯化抗体缓冲液为PBS(pH7-7.2)，0.02％NaN₃,50％甘油，-20℃保存，不需要分装；

4.3多肽粉末，-20℃保存。

亲和纯化结果：亲和纯化抗体得率正常；S1396-2，1396-1为两个样本

Rabbit No.	抗血清效价	亲和纯化抗体效价	亲和纯化抗体体积	亲和纯化抗体浓度
					S1396-1	320k	320k	4ml	2mg/ml
S1396-2	320k	160k	4ml	3mg/ml

以CP3为例，抗血清、亲和纯化抗体ELISA效价检测结果见图1。

5.Western Blot检测CPs抗体可以检测相应CPs，并考察是否存在交叉反应。

样本制取：

骨吸收上清样本收集：(1)无菌分离小鼠的双侧股骨、胫骨，培养基反复冲洗骨髓腔，获取骨髓细胞用含30ng/ml M-CSF的完全培养基培养1天，取未贴壁细胞用含30ng/mlM-CSF的完全培养基再培养3天，获得贴壁的小鼠原代骨髓源巨噬细胞(BMMs，为破骨前体细胞)备用。(2)分离小鼠颅骨制成骨片，将小鼠原代BMMs细胞接种至颅骨骨片，构建细胞-颅骨骨片三维培养体系，用100ng/ml RANKL和10ng/ml M-CSF在无血清培养基中(Thermo，货号12055091)诱导原代BMMs向破骨细胞分化并在骨片上进行骨吸收，待镜下可见明显破骨细胞形成时收集培养基上清(即骨吸收上清)。(3)骨吸收上清冻干浓缩，加入2×loadingbuffer混匀后37℃加热15min，上样电泳后考马斯亮蓝染色。

人血清样本收集：促凝管静脉采血5mL，室温静置半小时以上，4℃ 4000rpm离心10分钟，吸取上清，-80℃保存备用。血清冻干浓缩，加入2×loading buffer混匀后37℃加热15min，上样电泳后考马斯亮蓝染色。

聚丙烯酰胺凝胶的制备

1)配制浓度为15％的分离胶溶液：依次加入去离子水2.3ml、30％丙烯酰胺5ml、pH8.8的Tris 2.5ml、10％过硫酸铵100μL、10％SDS 100μL、TEMED 6μL(加入TEMED后，分离胶马上开始聚合，故应立即快速混匀)

2)迅速在两玻璃板的间隙中加入分离胶溶液，留出灌注浓缩胶所需空间，小心地在分离胶溶液上覆盖-层异丙醇；

3)分离胶聚合完全后，尽可能排去凝胶上的液体，再用纸巾的边缘吸净残留液体；

4)配制浓度为5％的浓缩胶溶液：依次加入去离子水2.7ml、30％丙烯酰胺670μL、PH8.8的Tris 500μL、10％过硫酸铵40μL、10％SDS 40μL、TEMED 6μL(加入TEMED后，分离胶马上开始聚合，故应立即快速混匀)

5)快速在已聚合的分离胶上直接灌注浓缩胶，立即在浓缩胶溶液中插入干净的梳子(小心避免混入气泡)；

6)浓缩胶聚合完全后，小心移出梳子，向电泳槽内加入蛋白质电泳缓冲液。

7)把需检测的样品(10μL)和2×(或者6×)loading buffer(10μL)混合，用移液枪慢慢将15μL混合物加至样品槽中，预染Maker一般加5μL；

8)打开电源，采用200V的电压，电泳直至溴酚蓝上样缓冲液在凝胶中迁移至凝胶底部；

9)切断电源，取出凝胶，用R250考马斯亮蓝浸泡凝胶染色，沸水煮5min；

10)取出染色的凝胶，用自来水浸泡凝胶脱色，沸水煮约20min，观察脱色后的蛋白质条带；

11)取胶后将胶剪成适当大小并浸入转膜buffer中；

12)将PVDF膜浸泡于甲醇1min后转入转膜buffer中，将滤纸也浸入转膜buffer中(PVDF膜和滤纸均剪成与胶相同大小)；

13)用转膜buffer淋洗石墨电极，铺两张滤纸，滴少许转膜buffer；

14)铺上膜，滴少许转膜buffer；铺上胶，再滴少许转膜buffer(注意不要产生气泡)；

15)最后铺两张滤纸，滴少许转膜buffer；

16)盖上电极，电压调至最大，以1.5mA/cm²凝胶体积转膜1.5h(负载电压不宜超过1V/cm²)。

17)将膜取出，PBST洗三次，每次5min(水平摇床上震荡)；

18)将膜取出，浸没于封闭液中37℃，2h或4℃过夜(封闭液为1％酪蛋白或2％OVA)

19)将膜取出，PBST洗三次，每次5min(水平摇床上震荡)；

20)将膜取出，浸泡于用1％酪蛋白稀释的一抗(即本发明制备的亲和纯化多克隆抗体)稀释液中，37℃，1h(一般一抗稀释1：1000)

21)将膜取出，PBST洗三次，每次5min(水平摇床上震荡)；

22)将膜取出，浸泡于用1％酪蛋白稀释的二抗稀释液中，37℃，1h；

23)羊抗小鼠-HRP稀释比例1：5000，羊抗兔-HRP稀释比例1:5000

24)将A、B发光液等比例稀释混合(各500ml)，将膜至于保鲜膜上，AB混合液均匀滴至膜上，盖上保鲜膜，静止1min；

25)打开保鲜膜，用滤纸吸干表面残留液体，至于保鲜膜内固定于暗盒中

26)将暗盒至于暗室中，取出胶片迅速至于暗盒内膜上，关闭暗盒，根据所见荧光强度曝光(一般曝光时间为1min，若条带较弱可选择压片过夜)；

27)打开暗盒，取出胶片立即完全侵入显影液中1min。

结果：图2为CP3抗体WB结果。

骨吸收上清样本和人血清样本中均存在CP3的表达。利用CP1、CP3体外合成的多肽检测CP3抗体对CP3、CP1的特异性，结果发现CP3抗体对CP3多肽具有很好的特异性。

图3为CP1抗体WB结果。

骨吸收上清样本和人血清样本中均存在CP1的表达。利用CP1、CP3体外合成的多肽检测CP1抗体对CP1、CP3的特异性，结果发现CP1抗体对CP1多肽具有很好的特异性。

选取CP3进一步制备单克隆的抗体。

实施例3：单克隆抗体制备

实验主要试剂

主要仪器设备

仪器名称	品牌	型号
			超声波细胞粉碎机	宁波新芝	JY92-IIDN
二氧化碳培养箱	美国精骐_	CI-191C
			全温度振荡培养箱	太仓华美	QHZ-98A
台式恒温振荡器	太仓华美	THZ-C
			超净工作台	苏州安泰	SW-CJ-1FD
双人超净工作台	苏州安泰	SW-CJ-2FD
			倒置显微镜	重庆光电	DSZ2000X
手轮式高压灭菌器	华泰医疗	LX-B75L
			酶标仪	Thermo	Multiskan FC

1.免疫原信息

免疫原蛋白质名称：CP3。

2.动物免疫

2.1动物

5-8周龄Balb/C小鼠5只。

佐剂：

第一次主注射使用弗氏完全佐剂，以后加强注射使用弗氏不完全佐剂，均与等体积抗原充分混匀后注射。

免疫方法：背部多点注射。

免疫量：注射100ul抗原/只实验小鼠，加强注射50ul抗原/只实验小鼠。

2.2免疫周期

3.1抗血清检测

3.2从小鼠尾静脉取少量血，制备抗血清。

3.3间接ELISA方法检测抗血清效价。

抗血清ELISA效价：下表中C1812-1,2,3,4,5分别代表5只免疫小鼠的编号

																1k	2k	4k	8k	16k	32k	64k	128k	256k	512k	1024k
	C1812-1	0.048	1.864	1.765	1.513	1.264	0.981	0.813	0.694	0.513	0.268	0.185
															C1812-2	0.051	1.621	1.610	1.496	1.304	1.013	0.923	0.792	0.621	0.316	0.198
	C1812-3	0.052	1.672	1.653	1.468	1.283	0.946	0.876	0.736	0.581	0.294	0.215
															C1812-4	0.049	1.354	1.310	1.286	1.019	0.753	0.623	0.586	0.426	0.189	0.132
	C1812-5	0.050	1.753	1.351	1.315	1.095	0.956	0.895	0.698	0.496	0.251	0.179

上表为C1812-1,2,3,4,5的抗血清ELISA结果，其效价分别为1:256K、1:512K、1:512K、1:512K、1:512K。

4细胞融合及亚克隆

4.1骨髓瘤细胞制备

融合前一周，复苏SP2/0细胞，正常培养至对数期。

4.2脾细胞制备

选定要融合的小鼠，融合当天用颈椎脱臼法处死，取脾，标准流程收集脾细胞并计数。

4.3细胞融合

按1:3-1：10的比例混合骨髓瘤细胞和脾细胞，标准流程进行细胞融合操作，随后用HAT DMEM完全培养基培养，融合后3天即可以看到杂交瘤细胞，第7天换1/2HAT完全培养基，第8天换1/2HT培养基。融合后10天左右开始进行筛选检测。

细胞融合结果：融合后用HAT选择性培养基培养，显微镜下观察，看到多个生长的杂交瘤细胞，证明融合操作成功。

4.4融合筛选

吸取细胞上清100ul/孔进行间接ELISA检测。根据ELISA结果，判断阳性孔；用单道移液器挑检整板检测出的阳性孔，进行第二次复检，进一步确认阳性孔。

4.5亚克隆

对复筛的阳性孔细胞做两轮亚克隆。(因为第一次亚克隆得到的阳性孔细胞株尚不稳定，有可能包含多个杂交瘤细胞，普遍认为第二次亚克隆后杂交瘤细胞为单个细胞株，并确定为阳性)。

第一次亚克隆有限稀释阳性孔中细胞至多个孔中，加HT DMEM培养基培养，7天左右在显微镜下观察，间接ELISA检测有克隆生长的孔，取OD值高的孔为阳性孔；挑取阳性孔的细胞进行第二次亚克隆，检测出稳定阳性的杂交瘤细胞株，作为最终制备单抗的细胞，并扩大培养。

4.6单克隆抗体亚型鉴定

用美国Southern Biotech的单抗亚型鉴定试剂盒分别测各个上清的亚型。准备好包被有免疫原蛋白的板条，50ng/孔，每个克隆收集600ul上清，分别滴加到6个对应蛋白的酶标孔中，100ul/孔，37℃孵育1h,PBST洗三遍，将稀释好的分型二抗抗IgM，IgA，IgG1，IgG2a，IgG2b，IgG3的抗体加入6个孔中，37℃孵育1h,PBST洗三遍，TMB显色。有信号反应的孔对应的鉴定二抗亚型即为该抗体的亚型。

4.7经过两轮亚克隆及复检，确定以下阳性细胞株及亚型。

最终确定9#阳性细胞株。

5.腹水制备及抗体纯化

5.1腹水制备

将上述阳性细胞扩大培养并注射至Balb/C小鼠(经弗氏不完全佐剂至敏)的腹腔，一般7-10日可见小鼠腹部隆起即代表有腹水产生。当小鼠有明显腹水产生时及时抽取腹水。

5.2将上述腹水，进行纯化，纯化后抗体纯度大于90％。

纯化方法：Protein A+G柱亲和纯化各亚型抗体:

(1)腹水离心，吸出淡黄色液体计算体积。

(2)将Protein A+G填料装入重力纯化柱内，用PBS洗涤三次，每次用10x柱体积的PBS。

(3)将腹水装入柱子内，4℃温和混匀2-4h。

(4)放出流穿液，备用。

(5)用PBS洗涤Protein A+G填料三次，用预冷的pH 3.0HCL-Glycine洗脱液洗脱抗体，收集下的抗体立即用10xPBS中和液中和。

(6)检测抗体浓度，合并高浓度收集管。

(7)装洗脱下的浓度较高的抗体。

(8)对PBS透析，4℃透析过夜。

5.3检测浓度纯度后，调整浓度，最终抗体浓度如下：

5.4Western Blot检测CPs抗体可以检测相应CPs，

采用与多克隆抗体Western Blot检测一样的步骤

结果见图4：利用CP3单克隆抗体WB可以检测到骨吸收上清样本和人血清中均存在CP3的表达。

实施例4：制备电化学发光检测试剂盒

制备方法包括步骤如下：

1)链霉亲和素偶联的磁性微粒工作液的制备将链霉亲和素偶联的磁微粒悬浮液，磁分离去除上清，用pH为6.8，浓度为0.1mol/L的PBS缓冲液重悬至浓度为0.5mg/mL，所述缓冲液含有0.5wt％的牛血清白蛋白、0.05wt％的Triton X-100、0.05wt％proclin 300和0.05wt％叠氮钠；

2)生物素标记的CP3抗体的制备

取1mg CP3单克隆抗体，加入适量PBS缓冲液(0.05M，pH 7.0-7.6)调整抗体总浓度至1mg/ml，并加入透析袋中进行透析，每隔3-4小时换一次透析液，更换3-4次，透析后将抗体转移至离心管或冻存管内；

准确称取1mg N-羟基琥珀酰亚胺活化的生物素(NHS-biotin)，加入适量水调整其浓度为2mg/mL，得NHS-biotin水溶液；

将NHS-biotin水溶液加入抗体中，使NHS-biotin与抗体按照5:1的摩尔比在室温混匀反应1小时，得生物素标记的CP3抗体溶液粗产品；

将生物素标记的CP3抗体溶液转移至透析袋，于PBS缓冲液(0.1M，pH 7.4)透析，每隔3～4小时换一次透析液，更换3～4次，透析后收集生物素标记的CP3抗体至离心管或冻存管内，≤-15℃冷冻保存备用。

3)三联吡啶钌标记抗CP3抗体的制备

用DMSO配制浓度为10mg/mL的Ru-NHS溶液；用PBS缓冲液(0.1M，pH 7.4)配制浓度为1mg/mL的抗CP3抗体(多克隆抗体)溶液；

在1mL抗CP3抗体溶液中加入10μL新配制的Ru-NHS溶液，37℃避光反应2小时，然后加入20μL 2M的甘氨酸终止反应，将反应液于PBS缓冲液(0.1M，pH 7.4)透析过夜，更换3～4次透析液，回收三联吡啶钌标记的抗CP3抗体溶液，≤-15℃冷冻保存备用。

4)生物素标记的CP3抗体工作液以及三联吡啶钌标记抗CP3抗体工作液的制备

配制pH为6.5，浓度为0.1mol/L的磷酸盐缓冲液，所述缓冲液含有2wt％BSA、0.1wt％酪蛋白、1wt％氯化钠、1wt％蔗糖、2wt％小牛血清、0.5wt％Triton X-100、0.2wt％proclin 300；然后用该缓冲液配制抗体浓度为1mg/L的生物素标记的CP3抗体工作液，以及抗体浓度为8mg/L三联吡啶钌标记的抗CP3抗体工作液。

5)校准品和质控品工作液的配制

配制pH＝7.4，浓度为0.1mol/L的N-(2-羟乙基)哌嗪-N′-(2-乙磺酸)(HEPES)缓冲液，所述缓冲液含有1wt％BSA、20wt％人血清、1wt％氯化钠、5wt％乙二醇、0.1wt％Tween-20、0.2wt％proclin 300；然后用该缓冲液配制CP3校准品和质控品工作液，校准品共6个点，CP3的浓度分别为0ng/mL、0.2ng/mL、1ng/mL、5ng/mL、25ng/mL、100ng/mL。质控品分高、低两个浓度，CP3的浓度分别为1ng/mL、25ng/mL。

6)清洗液的配制

配制176mmol/L的KOH溶液，所配清洗液中含有0.15wt％Brij-35。

7)化学发光底物液的配制

pH＝6.5，浓度为0.15mol/L的磷酸盐缓冲液添加0.15mol/L三丙胺、0.05wt％Brij-35、0.01wt％proclin 300。

将链霉亲和素包被的磁珠微粒工作液12mL/瓶、生物素标记的CP3抗体工作液12mL/瓶、三联吡啶钌标记的抗CP3抗体工作液12mL/瓶、校准品/质控品工作液1.0mL/瓶分装后，组装在一起，保存于2～8℃，将化学发光底物液380mL/瓶、清洗液380mL/瓶单独包装，保存于20～25℃。

试剂盒使用方法包括步骤如下：

试剂盒使用方法包括步骤如下：夹心法原理。总检测时间：18分钟。

(1)将样本(或校准品或质控品)、生物素标记的CP3抗体工作液各20uL，37℃一起孵育9分钟。

(2)将三联吡啶钌标记的抗CP3抗体工作液20uL和包被链霉亲合素的磁珠微粒工作液20ul加入到反应杯中，再次37℃孵育9分钟，形成抗体-抗原-抗体夹心复合物溶液，并在生物素和链霉亲和素的相互作用下形成固相。

(3)将反应液吸入测量池中，通过电磁作用将磁珠吸附在电极表面。未与磁珠结合的物质通过清洗液除去。紧接着，蠕动泵加入含三丙胺的化学发光底物液20ul，同时给电极加压，使复合体化学发光，并通过光电倍增器测量发光强度。

(4)通过检测仪的定标曲线得到最后的检测结果。

试剂盒的性能评估：

1.标准曲线:在上述实验确定的反应条件下,将校准品浓度(X)和相对发光强度值(Y)分别取以10为底的对数,然后以标准品浓度的对数为横坐标,以相对发光强度值的对数为纵坐标,对标准品的浓度和相对发光强度值,进行双对数直线回归拟合,得到回归曲线lgY＝3.569+0.9067gX,r＝0.991。

2.线性范围:10-1000ng/ml(由最低限和最高限决定)。对高值样本进行系列稀释,重复测定21次，低于最低限的测量值报告为<10μg/L(ng/mL)。高于最高限的数值报告为>1000μg/L(ng/mL)。

3.灵敏度:平行测定10孔零校准品(SO)发光强度,计算平均值(x)和标准差(2s),以x±2s的发光值,代入线性方程计算出对应浓度,重复5次,得出灵敏度最低检出限(即能够区分两个样本的最低差值)为0.8ng/mL。

4.特异性:本方法选择β-CrossLaps，N-MID骨钙素、甲状旁腺素(PTH)和25-OH-维生素D等骨生化标志物。分别以高于各个指标血清浓度正常值10-100倍浓度加标,检测值均低于0.8ng/mL,确定与CP3无交叉反应。

实施例5：骨质疏松患者和正常人之间CPs的表达量差异

骨量正常和骨质疏松组各20例，两组匹配年龄和性别，入选排除标准：

纳入标准为：骨质疏松组：双能X线吸收测定法(DXA)测量骨密度值低于同性别、同种族健康成人的骨峰值2.5个标准差；骨量正常组：DXA测量骨密度值低于同性别、同种族健康成人的骨峰值1个标准差及以内；自愿签署知情同意书的患者。

排除标准为：入组12个月内使用影响骨代谢药物超过6个月，如双膦酸盐、糖皮质激素、激素替代治疗等；罹患可能影响骨代谢的疾病，如糖尿病、肿瘤、甲状旁腺功能异常、甲状腺功能异常、性腺疾病、肾上腺疾病、神经肌肉疾病、骨关节炎、自身免疫性疾病伴发关节或椎体病变等；罹患发热(腋温大于37.2℃)、血细胞计数异常、肝肾功能损害等系统性疾病。

图5表示骨质疏松组β-CTX和CP3浓度均高于骨量正常组，预示CP3是潜在的诊断骨质疏松的分子标记物。

图6的相关性分析表明CP3浓度和β-CTX浓度高度正相关(R²＝0.779)。R²为正，说明CP3浓度趋势与β-CTX浓度趋势一致，β-CTX是临床最常用骨吸收标志物，CP3有望成为骨吸收标志物，提高骨质疏松诊断率。

序列表

<110> 中南大学湘雅二医院

<120> 骨转换指标物在制备骨质疏松预测诊断制剂中的应用及试剂盒

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Gly Ala Pro Gly Pro Gln Gly Phe Gln

1 5

<210> 2

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Gly Pro Pro Gly Pro Ala Gly Phe Ala

1 5

Claims (10)

1.骨转换指标物在制备骨质疏松预测诊断制剂中的应用，其特征在于，所述的骨转换指标物的序列如下：

CP1：Gly-Ala-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly-Phe-Gln，

CP3：Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Ala-Gly-Phe-Ala。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，骨质疏松预测诊断制剂为检测CP1和/或CP3含量的试剂。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的检测CP1和/或CP3含量的试剂包括电化学发光法检测CP1和/或CP3含量的试剂。

4.根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于，所述的检测CP1和/或CP3含量的试剂的检测对象包含体液，优选血清。

5.一种骨质疏松预测诊断试剂盒，其特征在于，包含检测骨转换指标物CP1和/或CP3的试剂；

CP1序列：Gly-Ala-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly-Phe-Gln，

CP3序列：Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Ala-Gly-Phe-Ala。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述的检测骨转换指标物CP1和/或CP3的试剂为检测骨转换指标物CP1和/或CP3含量的试剂。

7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述的检测骨转换指标物CP1和/或CP3含量的试剂为电化学发光法检测CP1和/或CP3含量的试剂。

8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述的电化学发光法检测CP1和/或CP3含量的试剂包含检测CP1和/或CP3所需抗体。

9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，还包括电化学发光法检测CP1和/或CP3含量所需的其他试剂。

10.根据权利要求5-9任一项所述的试剂盒，其特征在于，检测对象包含体液，优选血清。

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