CN113907179A - 一种用降低花生蛋白致敏性的处理方法 - Google Patents

一种用降低花生蛋白致敏性的处理方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用降低花生蛋白致敏性的处理方法，属于食品加工的技术领域，本发明用多酚处理花生蛋白，通过加快花生蛋白的消化速率，结合花生蛋白线性表位，促进花生蛋白交联聚集而稳定性下降等多种机制降低花生蛋白致敏性。本发明工艺步骤简单、绿色环保、不会对花生蛋白自身的品质有影响，安全无毒，并且对过敏患者有一定的免疫调节能力。

Description

一种用降低花生蛋白致敏性的处理方法
技术领域
本发明属于食品加工的技术领域，具体涉及一种降低花生蛋白致敏性的方法。
背景技术
花生被联合国粮农组织列为全球范围内最常见的8大类食物过敏原之一。花生过敏能导致婴幼儿、儿童、青少年及成人极度严重的过敏反应，局部症状包括腹痛、呕吐、痉挛和腹泻，轻度花生过敏亦普遍伴随这些症状。花生过敏除发生消化道症状外，存在对其他特应性疾病的易感性，亦见并发症如过敏性鼻炎、支气管哮喘及特应性皮炎等，严重见过敏性休克，且休克发病率较其他食物过敏性疾病高。较多食品中含有花生蛋白成分，意外摄入过敏原引发过敏反应的年发病率为3％～50％，使得识别和限制饮食困难，影响疾病防治。
传统的降低食品致敏性的方法包括加热、高压、微波辐照、发酵、酶水解等方法。热加工是常见的食品加工方法，热加工通过破坏过敏原蛋白质表面的构象性表位使其与IgE结合活性降低，从而降低致敏性，但是不同过敏原降低的程度不同，并且热加工可能会对糖，脂质等其它食物组份产生影响，甚至热加工可能使食物产生新的过敏表位，或使原本隐藏的表位暴露，提高了其与IgE的结合能力，导致食物致敏性的增强。高压可以诱导蛋白质结构变化，通过重组食物过敏原来改变过敏原的反应活性，但是由于其成本高，作用效果不明确，不适于商业化生产。微波辐照处理对过敏原的结构性能也会产生影响，微波是电磁波，利用微波能量加热与传统方法不同，是通过旋转偶极水分子和食物中的离子成分来吸收微波能量实现加热效果。辐照处理改变了过敏原表位的结构，可用于降低蛋白质的致敏性，但部分食品有明文规定不允许使用辐照处理的原料，极大地限制了辐照技术的应用。菌种发酵蛋白可以水解破坏一些过敏原表位，但配方中所含益生菌的真正安全性尚未得到充分评估，其应用仍存在限制性。酶水解可以断裂过敏原蛋白肽键，将过敏蛋白水解成小分子肽段，降低其分子量，或是通过改变过敏原表位的三级结构和切除过敏原蛋白表面的一些表位作用，从而达到降低其致敏性的目的，目前酶水解法工艺成熟，成本较低，但水解过程中容易产生一些苦味肽，严重影响酶水解法在降低食物蛋白致敏性中的开发和应用。
多酚是众所周知的具有免疫调节活性的药理活性化合物，广泛存在于蔬菜，水果和茶等人们日常消耗的食物中，以黄酮，酚酸、单宁等形式存在。直接的多酚摄入可以调节过敏反应中涉及的相关细胞因子的释放。此外，利用多酚与蛋白质的天然结合特性，可以制备出稳定的多酚－致敏蛋白复合物来达到降低抑制炎症的目的，并且在不损伤细胞的情况下多酚－致敏蛋白复合物可以通过调节信号转导途径来抑制炎症的发生，是降低食物蛋白致敏性的潜在方法。目前已有专利利用多酚制备低致敏性牛奶、奶粉、大豆等，但其制备方法仍存在步骤繁琐，需要加热加压、调节pH，可能对食物蛋白本身造成影响等缺陷。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足，为花生加工产品提供一种降低花生蛋白致敏性的处理方法。本发明用多酚处理花生蛋白，通过加快花生蛋白的消化速率，结合花生蛋白线性表位，促进花生蛋白交联聚集而稳定性下降等多种机制降低花生蛋白致敏性。
本发明的技术方案如下：
一种降低花生蛋白致敏性的处理方法，包括如下步骤：
(1)去皮花生依次经过液氮研磨、脱脂、浸提、离心、冷冻干燥处理，获得花生蛋白粉末；
(2)将上述花生蛋白粉末配置成花生蛋白溶液，与不同多酚溶液混合孵育。
在本发明的一个优选实施方案中，所述花生蛋白溶液与多酚溶液浓度比为20:1。
在本发明的一个优选实施方案中，所述花生蛋白溶液与多酚溶液体积比为20:1。
在本发明的一个优选实施方案中，所述孵育条件为室温，静置，15min。
在本发明的一个优选实施方案中，所述多酚包括根皮苷、儿茶素、绿原酸、表儿茶素、芦丁。
本发明的有益效果是：
1、多酚可以通过与构成花生过敏原的线性表位氨基酸结合而修饰表位导致其IgE结合能力降低，引起花生蛋白聚集破坏蛋白质稳定性，以及与花生过敏原的结合破坏其表位构象等多种途径降低花生蛋白致敏性。
2、本发明工艺步骤简单、绿色环保，不会对花生蛋白自身的品质有影响，安全无毒，并且对过敏患者有一定的免疫调节能力。
附图说明
图1是不同多酚处理后Arah1圆二色谱图；
图2是不同多酚处理后Arah1二级结构组成图；
图3是不同多酚处理后Arah1二级结构含量变化图；
图4是不同多酚处理后Arah1荧光光谱图；
图5是根皮苷与Ara h1的分子模拟对接图；
图6是儿茶素与Ara h1的分子模拟对接图；
图7是绿原酸与Ara h1的分子模拟对接图；
图8是表儿茶素与Ara h1的分子模拟对接图；
图9是芦丁与Ara h1的分子模拟对接图；
图10是不同多酚处理的花生蛋白对BALB/c小鼠过敏症状的影响图；
图11是不同多酚处理的花生蛋白对小鼠血清特异性IgE水平的影响图；
图12是不同多酚处理的花生蛋白对小鼠血清IgG1水平的影响图；
图13是不同多酚处理的花生蛋白对小鼠血清中组胺水平的影响图；
图14是不同多酚处理的花生蛋白对小鼠血清IFN-γ水平的影响图；
图15是不同多酚处理的花生蛋白对小鼠血清IL-4水平的影响图；
图16是不同多酚处理的花生蛋白对小鼠血清IL-5水平的影响图。
具体实施方式
以下通过具体实施方式结合附图对本发明的技术方案进行进一步的说明和描述。
实施例1
(1)去皮生花生在液氮条件下经粉碎机粉碎后过筛，得到粗花生粉末。取100g粉碎后的花生粉末，加入500mL Tris Buffer(20mM、pH 7.2)，室温摇床振荡1h后，4℃下6000rpm，离心15min。去除上层油脂层后，再次4℃5000rpm离心10min，取上清，将上清冻干后得到花生蛋白粉末。花生蛋白粉末储存于－20℃。
(2)将上述所得到的花生蛋白粉配置成0.2mg/mL花生蛋白溶液。分别取500μL、0.2mg/mL花生蛋白溶液或0.2mg/mL Ara h1溶液加入0.01mg/mL的表儿茶素溶液25μL，室温静置孵育15min，配置成表儿茶素－花生蛋白溶液和表儿茶素－Ara h1复合物溶液。
(3)将上述所得表儿茶素－花生蛋白溶液进行傅里叶红外变换光谱分析，对1700-1600cm-1内的酰胺区采用Peakfit软件进行折叠、去卷积的拟合计算得到各个二级结构峰面积，统计占比。表儿茶素处理后的花生蛋白β－折叠增加了135.99％，α－螺旋减少23.82％，β－转角增加7.62％。
(4)将上述所得表儿茶素－Ara h1复合物溶液进行圆二色谱分析。在室温下记录表儿茶素－Ara h1蛋白复合物在190-250nm(扫描速率为30nm/min，响应时间为1s)范围内的远紫外CD光谱，并对PBS光谱进行了减除。结果表明表儿茶素使α－螺旋含量较天然Arah1增加了5.5％。
(5)将上述所得表儿茶素－花生蛋白溶液和表儿茶素－Ara h1复合物溶液使用荧光分光光度计在25℃下，在路径长度为1.0cm的石英试管中进行荧光光谱分析，在295nm的激发波长下测定了蛋白质的内源性荧光，并记录了300-500nm的发射光谱。激发和发射的狭缝宽度设定为5.0nm。结果表明表儿茶素在295nm的激发波长下诱导Ara h1发生了荧光猝灭，色氨酸残基的微环境被改变，使色氨酸残基与配体相互作用的概率更高。
(6)用分子对接模拟对表儿茶素及花生过敏原蛋白Ara h1结合情况进行了分子对接模拟分析。花生过敏原蛋白Ara h1下载自RCSB Protein Data Bank(PDB ID:3SMH)。用ChemBioDraw Ultra14.0软件画出表儿茶素的结构，然后用ChemBio3D Ultra14.0软件转化为三维结构，并使用MMFF94力场进行能量优化，接着用AutodockTools1.5.6合并非极性氢并定义旋转键，最后转化为PDBQT格式。花生过敏原Ara h1使用AutodockTools1.5.6添加极性氢和电荷，最后转化为PDBQT格式。利用Autodock vina1.1.2软件进行分析。蛋白Ara h1活性口袋的坐标设置为：center_x＝46.033，center_y＝-58.167，center_z＝-29.566；size_x＝15，size_y＝18，size_z＝16.5。exhaustiveness参数设置为20，选取分值最高的构象用PyMoL1.7.6进行结果分析并作图。结果表明儿茶素分子位于由氨基酸残基A/Arg-29、A/Arg-35、A/Gln-41、A/Pro-126、C/Arg-35、C/Gln-38、D/Arg-29、D/Asp-31、D/Arg-35、D/Gln-38和D/Gln-41所组成的腔袋，形成范德华力作用。表儿茶素的苯环可以分别与氨基酸残基A/Arg-29、A/Arg-35、C/Arg-35、D/Arg-29和D/Arg-35形成阳离子－π相互作用。此外，表儿茶素的苯环可以与氨基酸残基D/Asp-31形成阴离子－π相互作用。表儿茶素可以与氨基酸残基D/Arg-35(键长：
Figure BDA0003331992940000051
)和D/Gln-41(键长：
Figure BDA0003331992940000061
)形成双重氢键相互作用。
(7)将上述所得表儿茶素－花生蛋白溶液进行体内致敏性分析。首先通过分别经口灌胃10mg花生蛋白粉末(100μL生理盐水稀释，含有10μg霍乱毒素佐剂)或10mg花生蛋白粉末(100μL生理盐水稀释，含有10μg霍乱毒素佐剂和0.1mg多酚)，每周1次，共6次建立花生过敏阳性对照组及多酚处理组。在第42天进行10倍大剂量花生蛋白刺激，测定体温变化及过敏症状评分，收集血清及组织测定相关数据。结果表明表儿茶素能全方位抑制花生对小鼠造成的过敏反应，够调节小鼠体内IL-4、IL-5等相关细胞因子水平，恢复Th1型过敏反应与Th2型过敏反应间的平衡，缓解花生过敏引起的肠道炎症，发挥降低花生蛋白致敏性的作用。
实施例2
(1)去皮生花生在液氮条件下经粉碎机粉碎后过筛，得到粗花生粉末。取100g粉碎后的花生粉末，加入500mL Tris Buffer(20mM、pH 7.2)，室温摇床振荡1h后，4℃下6000rpm，离心15min。去除上层油脂层后，再次4℃5000rpm离心10min，取上清，将上清冻干后得到花生蛋白粉末。花生蛋白粉末储存于－20℃。
(2)将上述所得到的花生蛋白粉配置成0.2mg/mL花生蛋白溶液。分别取500μL、0.2mg/mL花生蛋白溶液或0.2mg/mL Ara h1溶液加入0.01mg/mL的绿原酸溶液25μL，室温静置孵育15min，配置成绿原酸－花生蛋白溶液和绿原酸－Ara h1复合物溶液。
(3)将上述所得绿原酸－花生蛋白溶液进行傅里叶红外变换光谱分析，对1700-1600cm-1内的酰胺区采用Peakfit软件进行折叠、去卷积的拟合计算得到各个二级结构峰面积，统计占比。绿原酸处理使花生蛋白的β－折叠减少，α－螺旋和β－转角略有增加；
(4)将上述所得绿原酸－Ara h1复合物溶液进行圆二色谱分析。在室温下记录绿原酸－Ara h1蛋白复合物在190-250nm(扫描速率为30nm/min，响应时间为1s)范围内的远紫外CD光谱，并对PBS光谱进行了减除。结果表明绿原酸没有对花生蛋白二级结构产生显著影响。
(5)将上述所得绿原酸－花生蛋白溶液和绿原酸－Ara h1复合物溶液使用荧光分光光度计在25℃下，在路径长度为1.0cm的石英试管中进行荧光光谱分析，在295nm的激发波长下测定了蛋白质的内源性荧光，并记录了300-500nm的发射光谱。激发和发射的狭缝宽度设定为5.0nm。结果表明绿原酸在295nm的激发波长下诱导Ara h1发生了荧光猝灭，色氨酸残基的微环境被改变，使色氨酸残基与配体相互作用的概率更高。
(6)用分子对接模拟对绿原酸及花生过敏原蛋白Ara h1结合情况进行了分子对接模拟分析。花生过敏原蛋白Ara h1下载自RCSB Protein Data Bank(PDB ID:3SMH)。用ChemBioDraw Ultra14.0软件画出绿原酸的结构，然后用ChemBio3D Ultra14.0软件转化为三维结构，并使用MMFF94力场进行能量优化，接着用AutodockTools1.5.6合并非极性氢并定义旋转键，最后转化为PDBQT格式。花生过敏原Ara h1使用AutodockTools1.5.6添加极性氢和电荷，最后转化为PDBQT格式。利用Autodock vina1.1.2软件进行分析。蛋白Ara h1活性口袋的坐标设置为：center_x＝46.033，center_y＝-58.167，center_z＝-29.566；size_x＝15，size_y＝18，size_z＝16.5。exhaustiveness参数设置为20，选取分值最高的构象用PyMoL1.7.6进行结果分析并作图。结果表明绿原酸分子位于由氨基酸残基A/Arg-29、A/Asp-31、A/Arg-35、A/Gln-41、A/Pro-126、C/Arg-35、C/Gln-38、D/Arg-29、D/Asp-31、D/Arg-35、D/Gln-38和D/Gln-41所组成的腔袋，形成范德华力作用。同样地，绿原酸的苯环可以分别与氨基酸残基C/Arg-35、D/Arg-29和D/Arg-35形成阳离子－π相互作用。此外，绿原酸的苯环可以与氨基酸残基D/Asp-31形成阴离子－π相互作用。绿原酸可以与氨基酸残基A/Arg-29(键长：2.0和
Figure BDA0003331992940000071
)、D/Arg-35(键长：
Figure BDA0003331992940000081
)、D/Gln-38(键长：
Figure BDA0003331992940000082
)和D/Gln-41(键长：
Figure BDA0003331992940000083
)形成五重氢键相互作用。
(7)将上述所得绿原酸－花生蛋白溶液进行体内致敏性分析。首先通过分别经口灌胃10mg花生蛋白粉末(100μL生理盐水稀释，含有10μg霍乱毒素佐剂)或10mg花生蛋白粉末(100μL生理盐水稀释，含有10μg霍乱毒素佐剂和0.1mg多酚)，每周1次，共6次建立花生过敏阳性对照组及多酚处理组。在第42天进行10倍大剂量花生蛋白刺激，测定体温变化及过敏症状评分，收集血清及组织测定相关数据。结果表明绿原酸处理组一定程度上减弱了花生过敏引起的小肠绒毛组织的脱落，降低IL-4含量，在一定程度上抑制花生对小鼠造成的过敏反应。
实施例3
(1)去皮生花生在液氮条件下经粉碎机粉碎后过筛，得到粗花生粉末。取100g粉碎后的花生粉末，加入500mL Tris Buffer(20mM、pH 7.2)，室温摇床振荡1h后，4℃下6000rpm，离心15min。去除上层油脂层后，再次4℃5000rpm离心10min，取上清，将上清冻干后得到花生蛋白粉末。花生蛋白粉末储存于－20℃。
(2)将上述所得到的花生蛋白粉配置成0.2mg/mL花生蛋白溶液。分别取500μL、0.2mg/mL花生蛋白溶液或0.2mg/mL Ara h1溶液加入0.01mg/mL的根皮苷溶液25μL，室温静置孵育15min，配置成根皮苷－花生蛋白溶液和根皮苷－Ara h1复合物溶液。
(3)将上述所得根皮苷－花生蛋白溶液进行傅里叶红外变换光谱分析，对1700-1600cm-1内的酰胺区采用Peakfit软件进行折叠、去卷积的拟合计算得到各个二级结构峰面积，统计占比。根皮苷处理后的花生蛋白β－折叠增加了163.98％，α－螺旋减少12.31％，β－转角增加19.68％。
(4)将上述所得根皮苷－Ara h1复合物溶液进行圆二色谱分析。在室温下记录根皮苷－Ara h1蛋白复合物在190-250nm(扫描速率为30nm/min，响应时间为1s)范围内的远紫外CD光谱，并对PBS光谱进行了减除。结果表明根皮苷处理导致天然Ara h1中α－螺旋含量减少6.4％。
(5)将上述所得根皮苷－花生蛋白溶液和根皮苷－Ara h1复合物溶液使用荧光分光光度计在25℃下，在路径长度为1.0cm的石英试管中进行荧光光谱分析，在295nm的激发波长下测定了蛋白质的内源性荧光，并记录了300-500nm的发射光谱。激发和发射的狭缝宽度设定为5.0nm。结果表明根皮苷在295nm的激发波长下诱导Ara h1发生了荧光猝灭，色氨酸残基的微环境被改变，使色氨酸残基与配体相互作用的概率更高。
(6)用分子对接模拟对根皮苷及花生过敏原蛋白Ara h1结合情况进行了分子对接模拟分析。花生过敏原蛋白Ara h1下载自RCSB Protein Data Bank(PDB ID:3SMH)。用ChemBioDraw Ultra14.0软件画出根皮苷的结构，然后用ChemBio3D Ultra14.0软件转化为三维结构，并使用MMFF94力场进行能量优化，接着用AutodockTools1.5.6合并非极性氢并定义旋转键，最后转化为PDBQT格式。花生过敏原Ara h1使用AutodockTools1.5.6添加极性氢和电荷，最后转化为PDBQT格式。利用Autodock vina1.1.2软件进行分析。蛋白Ara h1活性口袋的坐标设置为：center_x＝46.033，center_y＝-58.167，center_z＝-29.566；size_x＝15，size_y＝18，size_z＝16.5。exhaustiveness参数设置为20，选取分值最高的构象用PyMoL1.7.6进行结果分析并作图。结果表明根皮苷分子位于由氨基酸残基C/Arg-35、C/Gln-38、D/Arg-29、D/Asp-31、D/Gln-32、D/Arg-35、D/Gln-38、D/Gln-41、D/Thr-125和D/Pro-126所组成的腔袋，形成范德华力作用。根皮苷的苯环可以分别与氨基酸残基C/Arg-35、D/Arg-29和D/Arg-35形成阳离子－π相互作用。此外，根皮苷的苯环可以与氨基酸残基D/Asp-31形成阴离子－π相互作用。根皮苷可以与氨基酸残基C/Gln-38(键长：
Figure BDA0003331992940000091
)、D/Arg-29(键长：
Figure BDA0003331992940000092
)和D/Asp-31(键长：1.9和
Figure BDA0003331992940000101
)形成四重氢键相互作用。
(7)将上述所得根皮苷－花生蛋白溶液进行体内致敏性分析。首先通过分别经口灌胃10mg花生蛋白粉末(100μL生理盐水稀释，含有10μg霍乱毒素佐剂)或10mg花生蛋白粉末(100μL生理盐水稀释，含有10μg霍乱毒素佐剂和0.1mg多酚)，每周1次，共6次建立花生过敏阳性对照组及多酚处理组。在第42天进行10倍大剂量花生蛋白刺激，测定体温变化及过敏症状评分，收集血清及组织测定相关数据。结果表明根皮苷处理使花生过敏原的致敏性降低，减弱了肥大细胞脱颗粒引起的组胺水平的升高，能在一定程度上抑制花生对小鼠造成的过敏反应。
实施例4
(1)去皮生花生在液氮条件下经粉碎机粉碎后过筛，得到粗花生粉末。取100g粉碎后的花生粉末，加入500mL Tris Buffer(20mM、pH 7.2)，室温摇床振荡1h后，4℃下6000rpm，离心15min。去除上层油脂层后，再次4℃5000rpm离心10min，取上清，将上清冻干后得到花生蛋白粉末。花生蛋白粉末储存于－20℃。
(2)将上述所得到的花生蛋白粉配置成0.2mg/mL花生蛋白溶液。分别取500μL、0.2mg/mL花生蛋白溶液或0.2mg/mL Ara h1溶液加入0.01mg/mL的芦丁溶液25μL，室温静置孵育15min，配置成芦丁－花生蛋白溶液和芦丁－Ara h1复合物溶液。
(3)将上述所得芦丁－花生蛋白溶液进行傅里叶红外变换光谱分析，对1700-1600cm-1内的酰胺区采用Peakfit软件进行折叠、去卷积的拟合计算得到各个二级结构峰面积，统计占比。芦丁处理后的花生蛋白β－折叠增加了181.11％，α－螺旋减少15.57％，β－转角增加24.64％。
(4)将上述所得芦丁－Ara h1复合物溶液进行圆二色谱分析。在室温下记录芦丁－Ara h1蛋白复合物在190-250nm(扫描速率为30nm/min，响应时间为1s)范围内的远紫外CD光谱，并对PBS光谱进行了减除。芦丁－Ara h1复合物结合没有对花生蛋白二级结构产生显著影响。
(5)将上述所得芦丁－花生蛋白溶液和芦丁－Ara h1复合物溶液使用荧光分光光度计在25℃下，在路径长度为1.0cm的石英试管中进行荧光光谱分析，在295nm的激发波长下测定了蛋白质的内源性荧光，并记录了300-500nm的发射光谱。激发和发射的狭缝宽度设定为5.0nm。结果表明芦丁在295nm的激发波长下诱导Ara h1发生了荧光猝灭，色氨酸残基的微环境被改变，使色氨酸残基与配体相互作用的概率更高。
(6)用分子对接模拟对芦丁及花生过敏原蛋白Ara h1结合情况进行了分子对接模拟分析。花生过敏原蛋白Ara h1下载自RCSB Protein Data Bank(PDB ID:3SMH)。用ChemBioDraw Ultra14.0软件画出芦丁的结构，然后用ChemBio3D Ultra14.0软件转化为三维结构，并使用MMFF94力场进行能量优化，接着用AutodockTools1.5.6合并非极性氢并定义旋转键，最后转化为PDBQT格式。花生过敏原Ara h1使用AutodockTools1.5.6添加极性氢和电荷，最后转化为PDBQT格式。利用Autodock vina1.1.2软件进行分析。蛋白Ara h1活性口袋的坐标设置为：center_x＝46.033，center_y＝-58.167，center_z＝-29.566；size_x＝15，size_y＝18，size_z＝16.5。exhaustiveness参数设置为20，选取分值最高的构象用PyMoL1.7.6进行结果分析并作图。结果表明芦丁分子位于由氨基酸残基A/Arg-35、A/Gln-38、C/Asp-31、C/Arg-35、C/Gln-38、C/Gln-41、D/Arg-29、D/Asp-31、D/Arg-35、D/Gln-38、D/Gln-41、D/Thr-125和D/Pro-126所组成的腔袋，形成范德华力作用。芦丁的苯环可以分别与氨基酸残基C/Arg-35、D/Arg-29和D/Arg-35形成阳离子－π相互作用。此外，芦丁的苯环可以与氨基酸残基D/Asp-31形成阴离子－π相互作用。芦丁可以与氨基酸残基C/Arg-35(键长：2.0和
Figure BDA0003331992940000111
)和D/Gln-41(键长：
Figure BDA0003331992940000112
)形成三重氢键相互作用。
(7)将上述所得芦丁－花生蛋白溶液进行体内致敏性分析。首先通过分别经口灌胃10mg花生蛋白粉末(100μL生理盐水稀释，含有10μg霍乱毒素佐剂)或10mg花生蛋白粉末(100μL生理盐水稀释，含有10μg霍乱毒素佐剂和0.1mg多酚)，每周1次，共6次建立花生过敏阳性对照组及多酚处理组。在第42天进行10倍大剂量花生蛋白刺激，测定体温变化及过敏症状评分，收集血清及组织测定相关数据。结果表明芦丁能显著降低细胞因子IL-4和IL-5的水平及抑制花生过敏引起的小肠绒毛组织的脱落，在一定程度上抑制花生对小鼠造成的过敏反应。
实施例5
(1)去皮生花生在液氮条件下经粉碎机粉碎后过筛，得到粗花生粉末。取100g粉碎后的花生粉末，加入500mL Tris Buffer(20mM、pH 7.2)，室温摇床振荡1h后，4℃下6000rpm，离心15min。去除上层油脂层后，再次4℃5000rpm离心10min，取上清，将上清冻干后得到花生蛋白粉末。花生蛋白粉末储存于－20℃。
(2)将上述所得到的花生蛋白粉配置成0.2mg/mL花生蛋白溶液。分别取500μL、0.2mg/mL花生蛋白溶液或0.2mg/mL Ara h1溶液加入0.01mg/mL的儿茶素溶液25μL，室温静置孵育15min，配置成儿茶素－花生蛋白溶液和儿茶素－Ara h1复合物溶液。
(3)将上述所得儿茶素－花生蛋白溶液进行傅里叶红外变换光谱分析，对1700-1600cm-1内的酰胺区采用Peakfit软件进行折叠、去卷积的拟合计算得到各个二级结构峰面积，统计占比。儿茶素处理的花生蛋白的二级结构没有发生明显的变化。
(4)将上述所得儿茶素－Ara h1复合物溶液进行圆二色谱分析。在室温下记录儿茶素－Ara h1蛋白复合物在190-250nm(扫描速率为30nm/min，响应时间为1s)范围内的远紫外CD光谱，并对PBS光谱进行了减除。结果表明儿茶素使α－螺旋含量较天然Ara h1增加了5.6％。
(5)将上述所得儿茶素－花生蛋白溶液和儿茶素－Ara h1复合物溶液使用荧光分光光度计在25℃下，在路径长度为1.0cm的石英试管中进行荧光光谱分析，在295nm的激发波长下测定了蛋白质的内源性荧光，并记录了300-500nm的发射光谱。激发和发射的狭缝宽度设定为5.0nm。结果表明儿茶素在295nm的激发波长下诱导Ara h1发生了荧光猝灭，色氨酸残基的微环境被改变，使色氨酸残基与配体相互作用的概率更高。
(6)用分子对接模拟对儿茶素及花生过敏原蛋白Ara h1结合情况进行了分子对接模拟分析。花生过敏原蛋白Ara h1下载自RCSB Protein Data Bank(PDB ID:3SMH)。用ChemBioDraw Ultra14.0软件画出儿茶素的结构，然后用ChemBio3D Ultra14.0软件转化为三维结构，并使用MMFF94力场进行能量优化，接着用AutodockTools1.5.6合并非极性氢并定义旋转键，最后转化为PDBQT格式。花生过敏原Ara h1使用AutodockTools1.5.6添加极性氢和电荷，最后转化为PDBQT格式。利用Autodock vina1.1.2软件进行分析。蛋白Ara h1活性口袋的坐标设置为：center_x＝46.033，center_y＝-58.167，center_z＝-29.566；size_x＝15，size_y＝18，size_z＝16.5。exhaustiveness参数设置为20，选取分值最高的构象用PyMoL1.7.6进行结果分析并作图。结果表明儿茶素分子与氨基酸残基A/Arg-29、A/Arg-35、A/Gln-41、A/Pro-126、C/Arg-35、C/Gln-38、D/Arg-29、D/Asp-31、D/Arg-35、D/Gln-38和D/Gln-41所组成的腔袋，形成范德华力作用。儿茶素的苯环可以分别与氨基酸残基A/Arg-29、A/Arg-35、C/Arg-35、D/Arg-29和D/Arg-35形成阳离子－π相互作用。此外，儿茶素的苯环可以与氨基酸残基D/Asp-31形成阴离子－π相互作用。儿茶素还可以与氨基酸残基D/Arg-35(键长：
Figure BDA0003331992940000131
)和D/Gln-41(键长：
Figure BDA0003331992940000132
)形成双重氢键相互作用。
(7)将上述所得儿茶素－花生蛋白溶液进行体内致敏性分析。首先通过分别经口灌胃10mg花生蛋白粉末(100μL生理盐水稀释，含有10μg霍乱毒素佐剂)或10mg花生蛋白粉末(100μL生理盐水稀释，含有10μg霍乱毒素佐剂和0.1mg多酚)，每周1次，共6次建立花生过敏阳性对照组及多酚处理组。在第42天进行10倍大剂量花生蛋白刺激，测定体温变化及过敏症状评分，收集血清及组织测定相关数据。儿茶素组表现了全方位的抑制作用，能够抑制花生对小鼠造成的过敏反应，够调节小鼠体内IL-4、IL-5等相关细胞因子水平，恢复Th1型过敏反应与Th2型过敏反应间的平衡，缓解花生过敏引起的肠道炎症，发挥降低花生蛋白致敏性的作用。

Claims (6)

1.一种降低花生蛋白致敏性的处理方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)去皮花生依次经过液氮研磨、脱脂、浸提、离心、冷冻干燥处理，获得花生蛋白粉末；
(2)将上述花生蛋白粉末配置成花生蛋白溶液，与不同多酚溶液混合孵育。
2.如权利要求1所述的处理方法，其特征在于：所述花生蛋白溶液与多酚溶液浓度比为10:1～20:1。
3.如权利要求1所述的处理方法，其特征在于：所述花生蛋白溶液与多酚溶液体积比为10:1～20:1。
4.如权利要求1所述的处理方法，其特征在于：所述孵育条件为室温，静置，15～30min。
5.如权利要求1所述的处理方法，其特征在于：多酚包括但不限于根皮苷、儿茶素、绿原酸、表儿茶素、芦丁中的一种或几种组合。
6.一种降低花生蛋白致敏性的处理方法，其特征在于：包括但不限于食品、化妆品、日用品等。
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