CN113897397A - 一种基于DNAzyme调控基因编辑的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种基于DNAzyme调控基因编辑的方法。方法包括：将CRISPR/Cas9系统中的gRNA的5’末端进行延长，获得含有5’末端延长片段的gRNA前体；根据所述gRNA前体的碱基序列设计8‑17DNAzyme底物结合臂的序列，获得与gRNA前体形成碱基互补配对的8‑17DNAzyme；将所述gRNA前体和8‑17DNAzyme作为调控CRISPR/Cas9基因编辑系统原料，通过是否加入金属离子对基因编辑进行调控。该方法通过对gRNA进行延长获得gRNA前体，并根据gRNA前体设计DNAzyme序列，实现对基因编辑的精准调控，设计简单，精准靶向具有普适性。

Description

一种基于DNAzyme调控基因编辑的方法
技术领域
本发明属于生物材料技术领域，具体涉及一种基于DNAzyme调控基因编辑的方法。
背景技术
现有技术中如何对CRISPR/Cas9系统中基因编辑调控主要有两种方法：(1)利用miRNA诱导启动CRISPR基因编辑平台：通过设计具有miRNA结合位点的没有活性的sgRNA前体，使得只有在特定miRNA表达的细胞中，才会通过miRNA介导的切割反应产生成熟的sgRNA,继而引导CRISPR基因编辑体系启动工作；该方法需要针对特定的细胞寻找特定的miRNA,再根据miRNA的序列设计gRNA前体，不具有普适性。(2)基于上转换纳米粒子(UCNPs)的CRISPR/Cas9递送系统：在该递送系统中，CRISPR/Cas9通过光敏分子ONA共价锚定在UCNP上(表示为UCNPs-Cas9)，然后用聚乙烯亚胺(PEI)包被(表示为UCNPs-Cas9@PEI)，以形成纳米颗粒。然后，将这些纳米颗粒暴露在近红外光NIR下，上转换纳米粒子(UCNPs)吸收近红外光(NIR)辐射，将其转换为紫外光(UV)辐射，紫外光能够切断光敏分子ONA，从而将CRISPR/Cas9体系从纳米颗粒中释放出来，并将它们按需递送给细胞。但是基于光敏分子的递送系统一般只适用于浅表组织。
因此，急需建立一种设计简单、精准靶向且具有普适性的CRISPR/Cas9活性可控系统，实现对基因编辑的精准调控。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明通过对gRNA进行延长，并设计DNAzyme的碱基序列使得二者形成碱基互补配对，由于DNAzyme的屏蔽作用，CRISPR/Cas9无法识别靶DNA序列，其基因编辑能力被抑制，在特定金属离子的作用下，DNAzyme被激活，对gRNA延长位点特异性切割，使得CRISPR/Cas9系统恢复活性启动基因编辑。
为实现上述目的，本发明实施例提供了一种基于DNAzyme调控基因编辑的方法，所述方法具体包括：
将CRISPR/Cas9系统中的gRNA的5’末端进行延长，获得含有5’末端延长片段的gRNA前体；
根据所述gRNA前体的碱基序列设计8-17DNAzyme底物结合臂的序列，获得与gRNA前体形成碱基互补配对的DNAzyme；
将所述gRNA前体和8-17DNAzyme作为CRISPR/Cas9基因编辑系统原料，通过是否加入金属离子对基因编辑进行调控。
进一步的，所述gRNA的5’末端进行延长过程中延长的长度为13-15个碱基。
进一步的，所述gRNA前体5’末端的延长片段与所述gRNA连接在一起没有潜在的发夹结构和互补配对情况。
进一步的，所述金属离子包括：锰离子、镁离子。
基于同一发明构思的，本发明实施例还提供了上述基于DNAzyme调控基因编辑的方法在调控增强型绿色荧光蛋白基因表达中的应用，所述增强型绿色荧光蛋白的特异性gRNA、gRNA前体和8-17DNAzyme的基因序列如序列SEQ ID NO:1-3所示。
有益效果：
本发明通过简单的设计将目标gRNA 5’末端延长13-15个碱基成为gRNA前体，然后根据gRNA前体序列设计8-17DNAzyme序列，使得二者碱基互补，由于DNAzyme的屏蔽作用，CRISPR/Cas9无法识别靶DNA序列，其基因编辑能力被抑制，再通过加入特定金属离子，DNAzyme被激活，对gRNA延长位点特异性切割，CRISPR/Cas9系统恢复活性启动基因编辑，实现了CRISPR/Cas9系统的精准调控，且具有普适性。
附图说明
图1为本发明实施例提供的CRISPR/Cas9系统恢复活性启动基因编辑的示意图；
图2为本发明实施例提供的各组流式细胞术检测结果，A为空白对照组，B为gRNA组，C为gRNA前体组，D为gRNA前体+DNAzyme组，E为gRNA前体+DNAzyme+Mn2+组；
图3为本发明实施例提供的各组基因编辑效率统计图。
具体实施方式
为使本发明要解决的技术问题、技术方案和优点更加清楚，下面将结合具体实施例进行详细描述，但本发明的保护范围并不限于以下具体实施例。
除非另有定义，下文中所使用的所有专业术语与本领域技术人员通常理解含义相同。本文中所使用的专业术语只是为了描述具体实施例的目的，并不是旨在限制本发明的保护范围。
除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。
在CRISPR/Cas9系统，对gRNA的5’末端进行延长(延长13-15个碱基)，成为gRNA前体，并与8-17DNAzyme形成碱基互补配对。由于DNAzyme的屏蔽作用，CRISPR/Cas9无法识别靶DNA序列，其基因编辑能力被抑制。如图1所示，在特定金属离子如Mn2+的作用下，DNAzyme被激活，对gRNA延长位点特异性切割，CRISPR/Cas9系统恢复活性启动基因编辑。
gRNA前体5’末端的延长片段与原gRNA末端分别结合DNAzyme活性中心两侧的结合部位，延长片段与原gRNA末端连接部位为DNAzyme切割位点，其中gRNA延长片段的设计原则是与原gRNA连接在一起没有潜在的发夹结构和互补配对情况。
实施例
本发明在增强型绿色荧光蛋白(Enhanced Green Fluorescent Protein,EGFP)标记细胞中的应用证明本发明基于DNAzyme调控基因编辑的方法可行性。利用CRISPR技术沉默EGFP标记的HEK-293T细胞的绿色荧光。
具体步骤如下：
(1)根据EGFP序列，设计EGFP特异性gRNA，然后对gRNA的5’末端进行延长设计gRNA前体；
EGFP gRNA：5’-cucgugaccacccugaccua-3’；
EGFP gRNA前体：
5’-cgucggagucgcuagcucgugaccacccugaccua-3’。
(2)根据gRNA前体设计8-17DNAzyme序列
8-17DNAzyme序列：
5’-gtcacgagtccgagccggtcgaaagcgactccgacg-3’
(3)细胞实验测定基于DNAzyme的CRISPR/Cas9可控基因编辑系统的切割活性
采用流式细胞术测定DNAzyme控制的CRISPR/Cas9的切割活性。
细胞分5组：空白对照组，gRNA组，gRNA前体组，gRNA前体+DNAzyme组，gRNA前体+DNAzyme+Mn2+组。HEK293T细胞以2×105个/孔接种于12孔板中，培养24h后，转染CRISPR/Cas9体系(锐博，riboEDIT CRISPR-Cas9mRNA Standard Set)(各组每孔转染体系成分见表1)，每组3个复孔，转染48h后消化离心，预冷的PBS洗涤两遍并重悬细胞，立即利用流式细胞仪测量细胞中绿色荧光强度，根据空白对照组及各组绿色荧光标记细胞所占比例计算基因编辑的效率。
基因编辑效率＝(空白对照组EGFP阳性细胞率-实验组EGFP阳性细胞率)/空白对照组EGFP阳性细胞率
表1各组每孔CRISPR/Cas9转染体系成分
Figure BDA0003289787900000041
Figure BDA0003289787900000051
结果如图2、3所示，空白对照组EGFP阳性细胞率为97.5％，gRNA组，gRNA前体组，gRNA前体+DNAzyme组，gRNA前体+DNAzyme+Mn2+组。gRNA组的CRISPR/Cas9的基因编辑效率为40.3％，gRNA前体组和的gRNA前体+DNAzyme组的基因编辑效率分别为1％、2％，gRNA前体+DNAzyme+Mn2+组的基因编辑效率为22.5％。由此可见，利用DNAzyme调控CRISPR/Cas9系统的基因编辑活性是可行可控的。
以上所述实施例，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明的技术范围内，根据本发明的技术方案及其构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围内。
序列表
<110> 中南大学
<120> 一种基于DNAzyme调控基因编辑的方法
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
cucgugacca cccugaccua 20
<210> 2
<211> 35
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
cgucggaguc gcuagcucgu gaccacccug accua 35
<210> 3
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
gtcacgagtc cgagccggtc gaaagcgact ccgacg 36

Claims (5)

1.一种基于DNAzyme调控基因编辑的方法，其特征在于，所述方法具体包括：
将CRISPR/Cas9系统中的gRNA的5’末端进行延长，获得含有5’末端延长片段的gRNA前体；
根据所述gRNA前体的碱基序列设计8-17DNAzyme底物结合臂的序列，获得与gRNA前体形成碱基互补配对的8-17DNAzyme；
将所述gRNA前体和8-17DNAzyme作为调控CRISPR/Cas9基因编辑系统原料，通过是否加入金属离子对基因编辑进行调控。
2.根据权利要求1所述的基于DNAzyme调控基因编辑的方法，其特征在于，所述gRNA的5’末端进行延长过程中延长的长度为13-15个碱基。
3.根据利要求1所述的基于DNAzyme调控基因编辑的方法，其特征在于，所述gRNA前体5’末端的延长片段与所述gRNA连接在一起没有潜在的发夹结构和互补配对情况。
4.根据权利要求1所述的基于DNAzyme调控基因编辑的方法，其特征在于，所述金属离子包括：锰离子、镁离子。
5.权利要求1-4任意所述的基于DNAzyme调控基因编辑的方法在调控增强型绿色荧光蛋白基因表达中的应用，其特征在于，所述增强型绿色荧光蛋白的特异性gRNA、gRNA前体和8-17DNAzyme的基因序列如序列SEQ ID NO:1-3所示。
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