CN113896782B - 一种基于组蛋白h3k27位点翻译后修饰的多肽探针及其制备方法和用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种基于组蛋白H3K27位点翻译后修饰的多肽探针，其氨基酸序列结构如下所示，
Figure DDA0003305312910000011
本发明基于组蛋白H3的氨基酸序列，以H3K27位点为中心进行设计，以保护的赖氨基酸为原料，经过非天然氨基酸和多肽的合成，实现了这种多肽探针的合成。本发明发现了与组蛋白H3K27位点乙酰化和巴豆酰化修饰的靶标蛋白STAT3。本发明能提高多肽探针与组蛋白赖氨酸翻译后修饰靶标蛋白的结合，对于寻找组蛋白H3K27翻译后修饰Readers、Writers和Erasers等调控蛋白提供了一种新的思路。

Description

一种基于组蛋白H3K27位点翻译后修饰的多肽探针及其制备方法和用途
技术领域
本发明属于生物化学领域，涉及一种多肽探针，具体来说是一种基于组蛋白H3K27位点翻译后修饰修饰的多肽探针及其制备方法和用途。
背景技术
近年来，随着表观遗传学的深入发展，DNA的甲基化乙酰化等修饰、RNA的甲基化乙酰化等修饰以及组蛋白的各类修饰被相继发现。越来越多的证据表明，组蛋白的翻译后修饰(PTM)在多种生物过程中起着关键作用，如细胞分化和器官发育，组蛋白的异常修饰可导致癌症等疾病。赖氨酸的翻译后修饰(PTM)是调节多种生物过程的重要组蛋白标记；然而，许多新发现的组蛋白赖氨酸PTM的功能作用和调节机制尚不清楚。
2011年芝加哥大学的赵英明研究团队发现赖氨酸巴豆酰化(Kcr)是种新的组蛋白标记类型，并且研究表明组蛋白赖氨酸巴豆酰化独特的结构和基因组定位说明它在机制和功能上不同于组蛋白赖氨酸乙酰化(Kac)。随后关于组蛋白赖氨酸巴豆酰化Reader、Writer和Eraser以及巴豆酰化修饰相关的调控机制研究逐渐兴起。
经过近十年的研究，组蛋白巴豆酰化修饰相关的调控机制和涉及到的蛋白还是非常有限；为了寻找和验证组蛋白赖氨酸巴豆酰化相关的蛋白，化学生物学家们也开发了各类方法来进行验证和探索。
2014年，香港大学李祥实验室开发了H3K4Cr多肽探针，通过光交联将赖氨酸巴豆酰化介导的非共价蛋白质-蛋白质相互作用转化为不可逆的共价键，发现了SIRT3具有组蛋白巴豆酰化的消除活力。
2017年北京大学陈鹏课题组与香港大学李祥课题组合作设计了赖氨酸巴豆酰化修饰的光交联探针(K*cr)和带有保护基团的光交联探针(PNBK*)两个探针，将这两种探针分别引入到组蛋白H3的56位和79位，并通过光交联基团捕捉到了H3上79位巴豆酰化的去乙酰化酶Sirt3。
香港大学李祥实验室2021年6月设计了一种可光交联、可点击和可切割的三功能氨基酸ADdis-Cys，与质谱(ADdis-Cys-MS)结合使用成功地识别了几个组蛋白H3K4甲基化和巴豆酰化的Readers。然而，目前报道的组蛋白翻译后修饰多肽探针都是在组蛋白多肽序列中上插入功能性共价交联基团，这改变了原本多肽的氨基酸序列，而且插入了较大的共价反应结构，这对于组蛋白多肽和靶标蛋白的识别和结合有负面影响。
组蛋白H3上丰富的赖氨酸残基以及各类PTM修饰对基因的表达，细胞分化和癌症的发生有密切的关系，近些年来，研究者对组蛋白H3赖氨酸PTM修饰相关的结合蛋白进行了多项研究，证明了组蛋白H3赖氨酸的PTM修饰对细胞的生长发育，基因的表达调控以及肿瘤的发生具有重要的作用。
发明内容
针对现有技术中的上述技术问题，本发明提供了一种基于组蛋白H3K27位点翻译后修饰的多肽探针及其制备方法和用途，所述的这种基于组蛋白H3K27位点翻译后修饰的多肽探针能提高多肽探针与组蛋白赖氨酸翻译后修饰靶标蛋白的结合，和目前的多肽探针相比具有结构精简，易合成的优势；不需要在序列中插入结构复杂并且对于组蛋白多肽和靶标蛋白的识别和结合有负面影响的共价反应基团，这对于抓取组蛋白H3K27位点翻译后修饰的互作蛋白以及探索新的靶标蛋白具有更大的优势。
本发明提供了一种基于组蛋白H3K27位点翻译后修饰的多肽探针，其氨基酸序列结构如下所示，
Figure BDA0003305312890000021
其中，R1为炔基、叠氮、荧光团或者生物素；R2为氢、甲基、乙酰基、磺酰基、丙烯酰基或者巴豆酰基；R3为氢、甲基、乙酰基、磺酰基、丙烯酰基或者巴豆酰基；Y为碳原子或者氧原子；m为1或者4。
进一步的，所述的Y为氧原子；m为4，非天然氨基酸替换赖氨酸，所述的非天然氨基酸的结构式为：
Figure BDA0003305312890000031
本发明还提供了上述基于组蛋白H3K27位点翻译后修饰的多肽探针的制备方法，包括如下步骤：
1)将4-(2′,4′-二甲氧基苯基-芴甲氧羰基-氨甲基)-苯氧基乙酰氨基-甲基二苯甲胺(Rink Amide MBHA)树脂用二氯甲烷(DCM)溶胀；
2)用溶于N,N-二甲基甲酰胺(DMF)体积百分比浓度为50％的吗啡啉脱去Fmoc保护基，之后分别用N,N-二甲基甲酰胺、二氯甲烷交叉洗涤；
3)根据
Figure BDA0003305312890000032
的结构式，从Fmoc保护的氨基酸5eq以起始树脂负载度计算，2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)5eq混合用N,N-二甲基甲酰胺溶解充分，随后加入N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)10eq活化，加入树脂反应；反应结束之后分别用N,N-二甲基甲酰胺、二氯甲烷交叉洗涤，相同的方法连接下一个氨基酸，直到接好一条完整的基于组蛋白H3K27的多肽骨架；
4)接下来按照氨基酸合成的方法连接氨基乙酸(Ahx)和基团R1，然后用钯单独脱去H3K27位点氨基酸的Alloc/Ally保护，最后连接R2和R3基团。
本发明还提供了一种非天然氨基酸的制备方法，其化学反应的方程式为：
以主链和侧链均为Boc保护的赖氨酸a作为起始原料，用叔丁醇给原料
a的羧基添加叔丁基保护，得到完全保护的赖氨酸b；然后通过水合氧化钌和高碘酸钠的催化，赖氨酸b侧链氨基临近的碳原子被氧化形成羰基，从而得到中间产物c；然后用硼氢化钠还原中间产物c，从而得到氨基酸侧链羟基替换氨基的中间产物d；然后用溴丙烯给中间产物d的侧链羟基添加烯丙基(Ally)保护，得到中间产物e；然后用三氟乙酸脱去主链氨基和羧基的保护基得到中间产物f；最后用芴甲氧羰酰琥珀酰亚胺(Fmoc-OSu)给中间产物f的主链氨基添加Fmoc保护基，从而得到可直接用于多肽固相合成的终产物非天然氨基酸g。
上述反应的方程式如下所示：
Figure BDA0003305312890000041
本发明还提供了上述的多肽探针在制备靶向和抓取识别组蛋白乙酰化和巴豆酰化修饰蛋白STAT3的药物中的用途。
本发明基于组蛋白H3的氨基酸序列，以H3K27位点为中心进行设计，以保护的赖氨基酸为原料，经过天然氨基酸和多肽的合成，实现了这种多肽探针的合成，并对其进行了初步的应用验证，发现了能与组蛋白H3K27位点乙酰化和巴豆酰化修饰相互作用的靶标蛋白STAT3。本发明能提高多肽探针与组蛋白赖氨酸翻译后修饰靶标蛋白的结合，对于寻找组蛋白H3K27翻译后修饰Readers、Writers和Erasers等调控蛋白提供了一种新的思路。
本发明和已有技术相比，其技术进步是显著的。本发明的这种多肽探针能够增强与组蛋白翻译后修饰靶标蛋白的相互作用；该多肽探针下拉蛋白后蛋白质二级质谱能够检测到之前研究报道的组蛋白H3K27乙酰化和巴豆酰化修饰Readers、Writers和Erasers等翻译后修饰调控蛋白以及相关家族蛋白。
附图说明
图1A)为组蛋白H3K27翻译后修饰多肽探针的合成。
图1B)为一系列组蛋白翻译后修饰多肽探针的结构。
图1C)为组蛋白H3K27Cr多肽探针下拉细胞裂解液后LC-MS/MS检测到靶标蛋白STAT3。
图2A)为STAT3蛋白的瞬时转染与一系列组蛋白翻译后修饰多肽探针pull down检测STAT3蛋白。
图2B)为与STAT3蛋白相互作用较强的组蛋白H3K27乙酰化和巴豆酰化多肽探针结构。
图2C)为免疫共沉淀(Co-IP)检测H3K27Ac与STAT3的相互作用。
图2D)为Pull down实验检测Biotin-H3K27Ac和Biotin-H3K27Cr多肽探针与STAT3的相互作用。
图3A)为根据组蛋白H3K27巴豆酰化修饰改造的新型多肽探针结构。
图3B)为与传统多肽探针对比，新型多肽探针Biotin-H3g27Cr pull down检测到与STAT3蛋白更强的相互作用。
图4A)为HEK-293细胞和STAT3稳定表达细胞系STAT3-HEK-293细胞的组蛋白提取。
图4B)为WB检测HEK-293细胞和STAT3-HEK-293细胞的组蛋白H3K27翻译后修饰表达水平。
图4C)为WB检测瞬时转染STAT3蛋白的HeLa细胞的组蛋白H3K27翻译后修饰表达水平。
图4D)为WB检测瞬时转染STAT3蛋白及添加STAT3磷酸化抑制剂的HEK-293T细胞的组蛋白H3K27翻译后修饰表达水平。
图5为基于组蛋白H3氨基酸序列设计合成的H3K27位点翻译后修饰多肽探针结构及通过蛋白质质谱检测到靶标蛋白STAT3。
具体实施方式
下面结合附图对本发明进一步说明。
实施例1、H3K27翻译后修饰多肽和H3g27Cr等多肽探针的制备及纯化步骤：(1)多肽固相合成：多肽固相合成于Rink Amide MBHA树脂按照标准的Fmoc固相合成策略。
具体操作如下：将4-(2′,4′-二甲氧基苯基-芴甲氧羰基-氨甲基)-苯氧基乙酰氨基-甲基二苯甲胺树脂用二氯甲烷溶胀10分钟(两遍)。N,N-二甲基甲酰胺体积百分比浓度为50％的吗啡啉脱去Fmoc保护基30分钟每次，共两次。之后分别用N,N-二甲基甲酰胺、二氯甲烷交叉洗涤各五次。Fmoc保护的氨基酸5eq以起始树脂负载度计算)，2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯5eq混合用N,N-二甲基甲酰胺溶解充分，随后加入N,N-二异丙基乙胺10eq活化。加入树脂反应2小时(根据氨基酸位阻，氨基酸残基大的基团反应时间加长，或者增加反应次数)。反应结束之后分别用N,N-二甲基甲酰胺、二氯甲烷交叉洗涤各五次，相同的方法连接下一个氨基酸，直到接好一条完整的多肽骨架，其中K27位点接入不同的氨基酸/非天然氨基酸得到相应不同的多肽探针，其中包括H3K27多肽(m＝4、Y为N原子)、H3S27多肽(m＝1、Y为O原子)、H3g27多肽(m＝4、Y为O原子)；接下来连接氨基乙酸(Ahx)和基团R1(炔基、叠氮、荧光团或者生物素)，然后用钯脱去H3K27位点赖氨酸的Alloc保护、H3S27位点丝氨酸的Ally保护以及H3g27位点非天然氨基酸的Ally保护，最后连接R2和R3等PTM修饰，流程如图1A，得到的一系列多肽探针结构如图1B和图3A。
本发明还提供了上述非天然氨基酸的制备方法，其化学反应的方程式为：
Figure BDA0003305312890000061
具体反应操作过程如下：以主链和侧链均为Boc保护的赖氨酸a作为起始原料，用叔丁醇给原料a的羧基添加叔丁基保护，得到完全保护的赖氨酸b；然后通过水合二氧化钌和高碘酸钠的催化，赖氨酸b侧链氨基临近的碳原子被氧化形成羰基，从而得到中间产物c；然后用硼氢化钠还原中间产物c，从而得到氨基酸侧链羟基替换氨基的中间产物d；然后用溴丙烯给中间产物d的侧链羟基添加烯丙基(Ally)保护，得到中间产物e；然后用三氟乙酸脱去主链氨基和羧基的保护基得到中间产物f；最后用芴甲氧羰酰琥珀酰亚胺(Fmoc-OSu)给中间产物f的主链氨基添加Fmoc保护基，从而得到可直接用于多肽固相合成的终产物非天然氨基酸g。
(2)将多肽从树脂上切下：取20mg树脂与EP管中，加入0.5ml的TFA/TIPS/H2O/EDT(v:v:v:v＝94:1:2.5:2.5)剪切液震荡反应1h,树脂过滤除去，用氮气把剪切液吹干，然后加入0.5ml冷的乙醚沉淀两分钟；离心弃去上清，沉淀的多肽于空气中挥干。
(3)多肽的纯化：将反应完全的反应液离心，过膜，使用高效液相色谱纯化。
实施例2、H3K27Cr多肽探针与蛋白孵育后的质谱学分析：
H3K27Cr多肽探针与纯蛋白/细胞裂解液孵育，然后通过click反应连接上生物素，通过pull down实验下拉与探针结合的蛋白，Beads充分洗干净后取部分跑胶后考马斯亮蓝染色或者WB检测，用于做质谱的Beads加入200μL 50mM Tris，PH8.5 6M Urea，加10mM DTT37℃30min。加20mM IAA，避光，37℃30min。50mM Tris，PH8.5稀释三倍，然后加2μg胰酶，37度，酶切16-18小时。酶切完毕，收取上清，Beads用ddH2O洗干净后与上清汇合，旋干，C18柱除盐，最后送样做蛋白质二级质谱分析，实验结果如图1C和图5所示，检测到了靶标蛋白STAT3。
实施例3、H3K27翻译后修饰多肽和H3g27Cr等多肽探针的Pull down实验：
收集表达STAT3的HEK-293细胞裂解液，与带biotin的H3K27多肽探针在25℃下孵育12h，然后将适量SA的beads用细胞裂解液洗三遍，将洗过的beads与上述反应的细胞裂解液在4℃摇床下充分孵育1-2h；离心，用带0.1％TritonX-100的PBS洗beads，每次beads在摇床上摇5分钟再离心，重复五次，彻底将非特异性结合的蛋白洗净；beads洗好后除尽上清，用2×loading buffer 20ul混匀beads。由于SA与biotin的亲和性很高，一般采用将beads沸水浴煮30分钟，最高速离心1分钟，弹匀beads与上清，再次离心，重复三遍，使上清液体均匀，取上清提取液进行Western Blot实验分析，实验结果如图2A，图2D和图3B所示，发现组蛋白H3K27乙酰化和巴豆酰化修饰多肽探针与STAT3的相互作用较强，同时新型多肽探针Biotin-H3g27Cr能够提高与STAT3的相互作用。
实施例4、蛋白质印记检测靶标蛋白STAT3：
用加入了蛋白酶抑制剂的细胞裂解液收取细胞内的蛋白，Bradford法测定蛋白浓度，SDS-PAGE，转膜(大分子量蛋白用0.45μm的PVDF膜，小分子量的组蛋白用0.22μm的PVDF膜)，5％脱脂牛奶封闭，一抗孵育后回收，TBST洗三次，每次10分钟；二抗孵育；TBST洗三次，每次10min，最后显影检测，结果如图2A所示，与对照组相比，检测到了较高的STAT3蛋白表达水平。
实施例5、免疫共沉淀(Co-IP)检测H3K27Ac与STAT3的相互作用：
用加入了蛋白酶抑制剂的细胞裂解液收取细胞内的蛋白，Bradford法测定蛋白浓度，加入抗体孵育过夜；取protein A(兔抗)/G(鼠抗)修饰的beads，用细胞裂解液洗三遍，加入上述样品管中，4℃摇3小时。将反应充分的beads用细胞裂解液洗5遍。向离心管中加入25μL 2X SDS PAGE上样缓冲液，沸水浴煮30分钟。离心后收集上清，最高速离心1分钟，弹匀共重复3次后取上清进行蛋白免疫印迹分析，检测结果如图2C，发现STAT3蛋白能够与组蛋白H3K27乙酰化相互作用。
实施例6、STAT3稳定表达细胞组蛋白提取及H3K27翻译后修饰表达水平检测：(1)细胞组蛋白提取：将培养好的细胞(约每毫升5x106细胞总计数)收集于15ml离心管，4度1200rpm离心5min得到细胞沉淀。然后用5ml冷PBS缓冲液洗涤细胞1～2次。用2.5ml(约每毫升2x107细胞密度)预冷的细胞核裂解液R1(10mM Tris Cl pH 8.0，150mM NaCl，1.5mMMgCl2，0.5％NP40，1mM PMSF)重悬细胞，转移至1.5ml tube管，上下轻轻混匀后放置在冰上5min或4度振动孵育10min)。4度800g离心10min，小心弃去上清得到细胞核沉淀。然后用5ml不含NP40的冷裂解液洗涤细胞核一次。将细胞核沉淀重悬于500μL0.4M H2SO4溶液(约每毫升2x107细胞)，溶解后混悬冰上反应30～60min或者4度过夜。4度10000rpm高速离心5min，轻轻转移上清酸可溶部分至干净的1.5ml tube管。逐滴加入132μL TCA至终浓度为20％(例如1ml加250μL TCA)，上下混匀后可以观察到白色沉淀产生，放置在冰上反应30～60min。4度14000rpm高速离心10min，小心弃去上清保留沉淀，用冰丙酮(含有0.1％醋酸)温和洗涤沉淀。4℃，4000rpm高速离心5min，小心弃去上清，再次用冰丙酮温和洗涤沉淀两次。4℃，14000rpm高速离心5min，室温下约5min晾干沉淀。得到的白色沉淀就是组蛋白，冷冻干燥后-20℃保存。使用时，用300～500μL双蒸水进行预先溶解并测定蛋白浓度，同时进行SDS-PAGE鉴定，结果如图4A所示，与细胞裂解液对比发现成功提取到了组蛋白H1、H2、H3和H4。
(2)H3K27翻译后修饰表达水平检测：收取不同细胞以及加入STAT3抑制剂后的细胞系提取的组蛋白后，Protein A280方法测定组蛋白浓度，用15％的蛋白胶进行SDS-PAGE，由于组蛋白分子量较小，采用用0.22μm的PVDF膜进行转膜，然后5％脱脂牛奶封闭，用H3K27各个不同翻译后修饰的一抗孵育后回收，TBST洗三次，每次10分钟；二抗孵育；TBST洗三次，每次10min，最后显影检测，结果如图4B，4C和4D所示，不同的细胞系WB实验结果均发现STAT3蛋白确实对组蛋白H3K27位点翻译后修饰修饰有影响，过表达STAT3蛋白会使H3K27Ac和H3K27Cr修饰水平下降，使用抑制剂降低STAT3和磷酸化STAT3的表达量能使H3K27Ac和H3K27Cr修饰水平重新提高；这些实验结果进一步证明了本发明的多肽探针抓取到和组蛋白H3K27翻译后修饰相互作用的靶标蛋白STAT3在组蛋白翻译后修饰调控功能上的重要性，充分说明本发明的多肽探针在表观遗传学以及组蛋白翻译后修饰相关疾病治疗和药物研发方面具有重要的用途。

Claims (4)

1.一种基于组蛋白H3K27位点翻译后修饰的多肽探针，其特征在于，其氨基酸序列结构如下所示，
Figure FDA0004171685030000011
其中，R1为炔基、叠氮、荧光团或者生物素；R2为氢；R3为乙酰基或者巴豆酰基；Y为氮或者氧原子；m为4。
2.根据权利要求1所述的一种基于组蛋白H3K27位点翻译后修饰的多肽探针，其特征在于，所述的Y为氧原子；m为4，采用非天然氨基酸替换赖氨酸，所述的非天然氨基酸的结构式为：
Figure FDA0004171685030000012
3.权利要求1所述的一种基于组蛋白H3K27位点翻译后修饰的多肽探针的制备方法，包括如下步骤：
1)将4-(2′,4′-二甲氧基苯基-芴甲氧羰基-氨甲基)-苯氧基乙酰氨基-甲基二苯甲胺树脂用二氯甲烷溶胀；
2)用溶于N,N-二甲基甲酰胺体积百分比浓度为50％的吗啡啉脱去Fmoc保护基，之后分别用N,N-二甲基甲酰胺、二氯甲烷交叉洗涤；
3)根据
Figure FDA0004171685030000013
的结构式，从Fmoc保护的氨基酸5eq以起始树脂负载度计算，2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯5eq混合用N,N-二甲基甲酰胺溶解充分，随后加入N,N-二异丙基乙胺10eq活化，加入树脂反应；反应结束之后分别用N,N-二甲基甲酰胺、二氯甲烷交叉洗涤，相同的方法连接下一个氨基酸，直到接好一条完整的基于组蛋白H3K27的多肽骨架；
4)接下来按照氨基酸合成的方法连接氨基乙酸Ahx和基团R1，然后用钯单独脱去H3K27位点氨基酸的Alloc/Ally保护，最后连接R2和R3基团。
4.权利要求1所述的一种基于组蛋白H3K27位点翻译后修饰的多肽探针在制备靶向和抓取识别组蛋白乙酰化和巴豆酰化修饰蛋白STAT3的药物中的用途。
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Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2610266A1 (en) * 2011-12-27 2013-07-03 PTM Biolabs, Inc. Reagents and methods for detecting protein crotonylation
CN110824168A (zh) * 2018-08-10 2020-02-21 天津医科大学 一种多肽探针及其在翻译后修饰的结合蛋白鉴定中的应用

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20130224880A1 (en) * 2011-05-27 2013-08-29 Ptm Biolabs, Inc. Reagents and methods for detecting protein crotonylation
US20130196867A1 (en) * 2011-12-16 2013-08-01 The University Of North Carolina At Chapel Hill Combinatorial post-translationally-modified histone peptides, arrays thereof, and methods of using the same

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2610266A1 (en) * 2011-12-27 2013-07-03 PTM Biolabs, Inc. Reagents and methods for detecting protein crotonylation
CN103183725A (zh) * 2011-12-27 2013-07-03 杭州景杰生物科技有限公司 一种蛋白质赖氨酸巴豆酰化修饰的检测及亲和试剂开发的方法
CN110824168A (zh) * 2018-08-10 2020-02-21 天津医科大学 一种多肽探针及其在翻译后修饰的结合蛋白鉴定中的应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
NEAT1 regulates neuroglial cell mediating Aβ clearance via the epigenetic regulation of endocytosis‑related genes expression;Ziqiang Wang等;《Cellular and Molecular Life Sciences》;第1-14页 *

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