CN113881752A

CN113881752A - 一种用于检测核酸胞嘧啶脱氨酶apobec3b的试剂盒及其应用

Info

Publication number: CN113881752A
Application number: CN202111480097.7A
Authority: CN
Inventors: 张艺瀚; 卢宇靖; 郭晓纯; 钟家本; 方志远
Original assignee: Guangdong University of Technology
Current assignee: Guangdong University of Technology
Priority date: 2021-12-07
Filing date: 2021-12-07
Publication date: 2022-01-04
Anticipated expiration: 2041-12-07
Also published as: CN113881752B

Abstract

本发明提供了一种单链DNA，以及一种用于检测核酸胞嘧啶脱氨酶APOBEC3B的试剂盒及其应用。本发明的试剂盒结合荧光检测能够灵敏且稳定地检测出不同浓度APOBEC3B的活性，更重要的是应用在筛选抑制剂上，可以避免检出假阳性抑制剂，且方便快捷、价格较低、原材料用量小，可以高通量筛选APOBEC3B抑制剂。并且能检测出不同组织、细胞中APOBEC3B的表达水平。

Description

一种用于检测核酸胞嘧啶脱氨酶APOBEC3B的试剂盒及其应用

技术领域

本发明涉及涉及一种用于检测核酸胞嘧啶脱氨酶APOBEC3B的试剂盒及其应用。

背景技术

人载脂蛋白B mRNA 编辑酶催化多肽（apolipoprotein B m RNA-editing enzymecatalytic polypeptide , APOBEC）是人体内具有胞嘧啶脱氨酶活性的限制因子，共有11个成员，分别为APOBEC1（简称A1），APOBEC2（简称A2），AID，APOBEC3A（简称A3A），APOBEC3B（简称A3B），APOBEC3C（简称A3C），APOBEC3DE（简称A3DE），APOBEC3F（简称A3F），APOBEC3H（简称A3H）和APOBEC4（简称A4）。

近年来大量的基因组学研究显示，肿瘤能利用达尔文式的进化在细胞层面上完成选择、竞争和适应，从而实现肿瘤发生、微环境适应、浸润、转移以及耐药性的产生。这种基因组不稳定性赋予癌症高度复杂和动态的属性，其前提条件是 DNA 突变的不断产生。大规模的肿瘤细胞全基因组测序结果表明，由酶介导的主动的 DNA 突变是造成基因组异质性的主要途径之一，而核酸胞嘧啶脱氨酶APOBEC家族正是这一过程的作用酶。 APOBEC 家族酶能作用于单链 DNA 中的脱氧胞苷并通过脱氨基反应将其转化为脱氧尿苷，这一过程经过 DNA 复制/修复机制最终能产生包含 C>T 转换在内的多种突变。在正常细胞中这些突变对抵御病毒转导的外源核酸至关重要，但在肿瘤细胞中异常激活的 APOBEC 家族酶则推动了异质性的积累，并通过促进分支进化产生临床上难以治愈的耐药性克隆。

其中，APOBEC3B是胞苷脱氨酶中主导肿瘤基因组突变的酶。在APOBEC家族中，APOBEC3B是唯一核定位的成员，它在肿瘤细胞内选择性识别并编辑5’-TC短序列，并能在DNA损伤修复机制下形成极具特征的TC>TT或TC>TG突变标签。一项于2013年发表在Nature期刊的研究结果表明，在乳腺癌中A3B是APOBEC家族酶中唯一普遍异常激活的成员，并且其表达量与TC短序列突变程度呈正相关。大规模肿瘤基因组测序表明，这些TC短序列突变标签大量存在于约50%的人类肿瘤中，而在胞苷脱氨酶家族中仅APOBEC3B在这些肿瘤中mRNA过表达。进一步的证据表明，APOBEC3B在肿瘤中的高表达与差的临床预后相关联。

肿瘤细胞中持续的APOBEC3B活性能促使肿瘤组织分支进化与耐药性克隆产生。在非小细胞肺癌中，晚期的细胞克隆中能检测到APOBEC酶对肺癌驱动基因（如PTPRD、EP300及TGFBR1等）的突变，而在头颈癌中，APOBEC3B异常激活则能产生PIK3CA螺旋结构域突变（E542/545L）。这些结果预示了常见的原癌基因或药物靶点能成为APOBEC3B的编辑对象。在ER阳性乳腺癌中，APOBEC3B的高表达与较差的辅助疗法效能相关联，并且是他莫昔芬疗法耐药性产生的原因，因此APOBEC3B是一个经过初步验证的抗肿瘤药物耐药性产生靶标。

鉴于APOBEC3B在癌症发生发展中的重要作用，发掘能够检测APOBEC3B活性的技术手段，并将其应用于APOBEC3B抑制剂筛选，以期筛选出能有效抑制APOBEC3活性的化合物；以及应用于组织/细胞中APOBEC3B含量的检测，辅助进行医学诊断，以上目的具有重要意义。

当前对APOBEC3B活性检测的手段不多，主要包括PAGE凝胶电泳、核磁滴定、表面等离子体共振技术、等温滴定量热法等手段，这些手段存在着操作繁琐、耗时、价格高昂、原材料用量大等缺点。目前已报道一种基于FRET效应与UDG酶参与的APOBEC3B生物传感器，并且已经应用于APOBEC3B抑制剂高通量筛选。但遗憾的是，通过该生物传感器筛选出的APOBEC3B抑制剂，大部分实际上为抑制UDG酶活性的假阳性抑制剂。因此，设计出一个方便快捷、价格较低、原材料用量小且能避免筛选出假阳性抑制剂的试剂盒是一个十分有前景的想法。

发明内容

为了解决上述现有技术存在的不足和缺点，本发明的目的在于提供一种单链DNA，以及一种用于检测核酸胞嘧啶脱氨酶APOBEC3B的试剂盒及其应用。

本发明通过设计合成一段带有APOBEC3B识别位点5’-TCA的单链DNA，该单链DNA的5’端被荧光基团修饰，3’端被淬灭基团修饰，该单链DNA与APOBEC3B共同孵育，胞嘧啶C会在APOBEC3B的作用下被突变为尿嘧啶U，这时加入能在5’-TCA处断裂该单链DNA的限制性内切酶BspH Ⅰ，由于上述突变，该单链DNA无法被酶切，保持完整，此时激发荧光基团，由于FRET效应，荧光基团会被淬灭；如果APOBEC3B活性被抑制，BspH Ⅰ 酶将会在5’-TCA处切开该单链DNA，荧光基团和淬灭基团分离，此时激发荧光，荧光基团将被激发并发出对应荧光。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种单链DNA，所述单链DNA带有核酸胞嘧啶脱氨酶APOBEC3B识别位点，所述核酸胞嘧啶脱氨酶APOBEC3B识别位点能够被限制性核酸内切酶识别后切开，所述单链DNA的5’端被荧光基团修饰，3’端被淬灭基团修饰。

优选地，所述核酸胞嘧啶脱氨酶APOBEC3B识别位点为5’-TCA，所述限制性核酸内切酶为能在5’-TCA处切开所述单链DNA的限制性内切酶BspH Ⅰ。

优选地，所述单链DNA的序列如SEQ ID NO:1所示；

所述荧光基团包括FAM、TET、JOE、HEX、CY3、TAMRA、ROX、Texas Red、LC RED640、CY5和LC RED705中的至少一种，所述淬灭基团包括FAM、TET、JOE、HEX、CY3、TAMRA、ROX、TexasRed、LC RED640、CY5、LC RED705、BHQ1、BHQ2、BHQ3和DABCYL中的至少一种。

本发明提供了一种用于检测核酸胞嘧啶脱氨酶APOBEC3B的试剂盒，所述试剂盒包括上述所述的单链DNA，所述单链DNA的互补链、限制性核酸内切酶BspH Ⅰ，以及缓冲液。

优选地，所述缓冲液为第一缓冲液、第二缓冲液、第三缓冲液或第四缓冲液；

所述第一缓冲液包括10–50 mM CH₃COOK, 10-100 mM Tris-acetate，10-100 mM(CH₃COO)₂Mg，0.1-10 μg/mL BSA, pH 5-8；优选地，所述第一缓冲液包括50 mM CH₃COOK,20 mM Tris-acetate，10 mM (CH₃COO)₂Mg，0.1 μg/mL BSA, pH 7.9；

所述第二缓冲液包括50-150 mM NaCl, 10-50 mM KCl，5-20 mM Na₂HPO₄，1-10 mMKH₂PO₄, pH 5-8;

所述第三缓冲液包括5-100 mM HEPES, 50-200mM NaCl，pH 5-8;

所述第四缓冲液包括5-50 mM Tris-HCl, 0.5-5 mM EDTA, pH 5-8。

优选地，所述单链DNA的互补链的序列如SEQ ID NO:5所示。

本发明提供了一种用于检测核酸胞嘧啶脱氨酶APOBEC3B的方法，所述方法包括以下步骤：

（1）将缓冲液、核酸胞嘧啶脱氨酶APOBEC3B、上述所述的单链DNA加入EP管中孵育；优选地，所述步骤（1）中孵育的温度为37 ℃，孵育的时间为1-3 h；

（2）加入所述单链DNA的互补链、限制性核酸内切酶BspH Ⅰ孵育；优选地，所述步骤（2）中孵育的温度为37 ℃，孵育的时间为1-4 h；

（3）对步骤（2）中孵育后的产物进行荧光检测；优选地，所述荧光检测的激发波长为400-700 nm，检测范围为200-1000 nm，扫描速度为800-1200 nm/min。

本发明提供了一种用于筛选核酸胞嘧啶脱氨酶APOBEC3B抑制剂的试剂盒，所述试剂盒包括上述所述的试剂盒，以及核酸胞嘧啶脱氨酶APOBEC3B。

本发明提供了一种用于筛选核酸胞嘧啶脱氨酶APOBEC3B抑制剂的方法，所述方法包括以下步骤：

S1，将待测化合物与核酸胞嘧啶脱氨酶APOBEC3B在缓冲液中反应；

S2，加入上述所述的单链DNA，充分混匀后反应；

S3，加入所述单链DNA的互补链和限制性核酸内切酶BspH Ⅰ，充分混匀后反应；

S4，对步骤S3中反应后的产物进行荧光检测。

本发明提供了上述所述的单链DNA、限制性核酸内切酶BspH Ⅰ或上述所述的试剂盒在制备用于检测核酸胞嘧啶脱氨酶APOBEC3B的试剂盒或者用于筛选核酸胞嘧啶脱氨酶APOBEC3B抑制剂中的应用。

本发明在检测核酸胞嘧啶脱氨酶APOBEC3B时，由核酸胞嘧啶脱氨酶APOBEC3B和限制性核酸内切酶BspH Ⅰ参与调控FRET效应，先由核酸胞嘧啶脱氨酶APOBEC3B识别并编辑核酸位点，再加入限制性核酸内切酶BspH Ⅰ后无法识别酶切位点，导致荧光基团被淬灭基团所淬灭的FRET效应。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明的试剂盒结合荧光检测能够灵敏且稳定地检测出不同浓度APOBEC3B的活性，更重要的是应用在筛选抑制剂上，可以避免检出假阳性抑制剂，且方便快捷、价格较低、原材料用量小，可以高通量筛选APOBEC3B抑制剂。并且能检测出不同组织、细胞中APOBEC3B的表达水平。

附图说明

图1为本实施例1所述BspH Ⅰ底物筛选TBE-PAGE结果图。

图2为本实施例2中所述5’-6-FAM、3’-TAMRA修饰APOBEC3B探针的检测方案示意图。

图3为本实施例3中所述5’-HEX、3’-BHQ修饰APOBEC3B探针的检测方案示意图。

图4为本实施例4中所述APOBEC3B活性检测方案的聚丙烯酰胺凝胶电泳图。

图5（A）为本实施例5中使用含有50 mM K⁺的buffer作为反应缓冲液的TAMRA与FAM荧光强度比值。

图5（B）为本实施例5中使用含有50 mM Mg²⁺的buffer作为反应缓冲液的TAMRA与FAM荧光强度比值。

图5（C）为本实施例5中使用含有50 mM Na⁺的buffer作为反应缓冲液的TAMRA与FAM荧光强度比值。

图5（D）为本实施例5中使用含有50 mM K⁺和10 mM Mg²⁺的buffer作为反应缓冲液的TAMRA与FAM荧光强度比值。

图5（E）为本实施例5中使用含有50 mM K⁺和10 mM Na⁺的buffer作为反应缓冲液的TAMRA与FAM荧光强度比值。

图5（F）为本实施例5中使用含有50 mM Mg²⁺和10 mM K⁺的buffer作为反应缓冲液的TAMRA与FAM荧光强度比值。

图5（G）为本实施例5中使用含有50 mM Mg²⁺和10 mM Na⁺的buffer作为反应缓冲液的TAMRA与FAM荧光强度比值。

图5（H）为本实施例5中使用含有50 mM Na⁺和10 mM K⁺的buffer作为反应缓冲液的TAMRA与FAM荧光强度比值。

图5（I）为本实施例5中使用含有50 mM Na⁺和10 mM Mg²⁺的buffer作为反应缓冲液的TAMRA与FAM荧光强度比值。

图6为本实施例6中所述不同APOBEC3B浓度体系的TAMRA与FAM荧光强度比值。

图7为本实施例7中所述TAMRA/FAM值与APOBEC3B浓度梯度的线性拟合情况。

图8（a）为本实施例8中MN1的化学结构式。

图8（b）为本实施例8中在不同浓度的APOBEC3B和MN1存在下的荧光光谱（点划线）。

图8（c）为本实施例8中含有不同浓度APOBEC3B和MN1的TAMRA/FAM值，1-9中APOBEC3B的添加量为：（1）0nM; （2）200nM; （3）400nM; （4）600nM; （5）800nM; （6）1000nM;（7）1000nM+1μM MN1; （8）1000nM+2μM MN1; （9）1000nM+4μM MN1。

图8（d）为本实施例8中对APOBEC3B的抑制率与MN1浓度之间的线性关系。

图9为本实施例10中所述四种细胞总蛋白的TAMRA与FAM荧光强度比值。

图10为本实施例10中所述四种细胞总蛋白的抗APOBEC3B的Western blot结果图。

具体实施方式

下面结合具体实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

实施例1：最佳单链DNA序列筛选。

将5 μM表1所示单链DNA (21-a、21-b、24-a 和 24-b) 与其互补序列以1:1的比例混合。将混合物加热至95 ℃，然后自然冷却至室温。将 2 U BspHI添加到每个样品中，并在37 ℃下孵育 4 h。然后，将混合物加载到20%聚丙烯酰胺凝胶中，电泳在Tris-borate-EDTA(TBE) buffer (90 mM Tris, 90 mM boric acid, 2 mM EDTA, 和 12.5 mM MgCl₂ ，pH8.0)中进行，电压设置为45 V 30 min，100 V 120 min。

为了选出BspH Ⅰ最合适的底物，我们对表1所示的序列进行了筛选。结果显示，与没有加入BspH Ⅰ的对照（图1a, c, e, g）相比，加入BspH Ⅰ后（图1b, d, f, h），只有21-a在聚丙烯酰胺凝胶中显示出明显的被酶切后的条带。对比21-a，其它的序列（21-b、24-a、24-b）与没有加入BspH Ⅰ的对照组相比没有明显区别。因此，选择21-a为最优单链DNA序列，后续对该序列进行荧光基团修饰。

表1 筛选单链DNA序列

序列名称	序列(5’→3’)
		21-a	TATAAGTTATCATGATATATA
21-b	TATATCATGAAATTATATATA
		24-a	TATAAGTTATCATGATATATAAAA
24-b	TATATCATGAAATTATATATAAAA
		CS of 21-a	TATATATCATGATAACTTATA
CS of 21-b	TATATATAATTTCATGATATA
		CS of 24-a	TTTTATATATCATGATAACTTATA
CS of 24-b	TTTTATATATAATTTCATGATATA

实施例2：5’-6-FAM、3’-TAMRA修饰APOBEC3B底物的检测方案。

本实施例APOBEC3B活性检测步骤如图2. 首先，APOBEC3B底物6-FAM-5’-TATAAGTTATCATGATATATA-3’-TAMRA经过APOBEC3B编辑，胞嘧啶C突变为尿嘧啶U。之后，底物与其互补链杂交形成一个双链底物。加入BspH Ⅰ后，底物保持完整。使用492 nm的激发波长来激发6-FAM，6-FAM会被TAMRA所淬灭而发出TAMRA的黄色荧光。相反的，如果底物序列没有经过APOBEC3B编辑，加入BspH Ⅰ后，底物会断裂。此时用492 nm的激发波长来激发6-FAM，将会发出6-FAM的绿色荧光。

实施例3：5’-HEX、3’-BHQ修饰APOBEC3B底物的检测方案。

本实施例APOBEC3B活性检测步骤如图3. 首先，APOBEC3B底物HEX-5’-TATAAGTTATCATGATATATA-3’-BHQ经过APOBEC3B编辑，胞嘧啶C突变为尿嘧啶U。之后，底物与其互补链杂交形成一个双链底物。加入BspH Ⅰ后，底物保持完整。使用535 nm的激发波长来激发HEX，HEX会被BHQ所淬灭而无法检测到荧光。相反的，如果底物序列没有经过APOBEC3B编辑，加入BspH Ⅰ后，底物序列会断裂。此时用535 nm的激发波长来激发HEX，将会发出HEX的粉色荧光。

实施例4：TBE-PAGE验证本发明试剂盒。

在EP管中将5 μM 实施例2中APOBEC3B底物分别与0、500、3000和6000 nMAPOBEC3B在buffer（50 mM CH₃COOK, 20 mM Tris-acetate，10 mM (CH₃COO)₂Mg，0.1 μg/mLBSA, pH 7.9）中混匀，置于37 ℃反应1 - 3 h后，加入等量的底物互补链并加入2 U 限制性核酸内切酶BspHI，孵育2 - 6 h。设置对照组为仅有APOBEC3B底物及其互补链形成的双链DNA。将孵育后样品加载于20%聚丙烯酰胺电泳凝胶中，浸没在1×TBE核酸电泳缓冲液中进行电泳，电压设置为45 V电泳30 min，100 V电泳120 min。结束后在凝胶成像系统进行显影。结果如图4，可见随着APOBEC3B浓度的增加，被限制性核酸内切酶BspH Ⅰ切割后产生的切割产物（箭头指示）逐渐减少。并且在加入了APOBEC3B的实验组中，因APOBEC3B结合在脱氨位点导致互补链无法与底物形成双链，观察到了单链DNA的存在（底端条带）。由此初步证实了我们所设计的用于检测APOBEC3B的试剂盒是可行的。

实施例5：最佳反应缓冲液筛选。

将75nM的实施例2中APOBEC3B底物和不同浓度的APOBEC3B（0, 200, 400, 600,800, 1000 nM）加入无离子的buffer中，向体系中加入不同浓度组合的K⁺、Na⁺和Mg²⁺。充分混匀后将混合液置于37 ℃反应1 h，使脱氨反应发生。反应结束后向混合液中加入3 eq.的引物互补链和0.5 U的BspH Ⅰ。充分混匀后将混合液置于37 ℃反应1 h，使酶切反应发生。收集记录500-700 nm波长范围、激发波长为492 nm的发射光谱。

结果显示，对比50mM Na⁺单独存在的情况，50 mM K⁺或50 mM Mg2+单独存在时，组内的稳定性更高，且对不同浓度的APOBEC3B的区分能力更强（图5（A）-图5（C））。此外，相对于其它的离子类型和离子浓度的组合，在50 mM K⁺和10 mM Mg²⁺共同存在时，检测体系稳定性最高，区分能力最强，且检测范围最广（图5（D）-图5（I））。在后续的实验中将使用含有50mM K⁺和10 mM Mg²⁺的buffer作为反应的缓冲液。

实施例6：荧光滴定验证本发明试剂盒可行性。

在EP管中将75 nM的实施例2中APOBEC3B底物和不同浓度的APOBEC3B充分混匀在buffer（50 mM CH₃COOK, 20 mM Tris-acetate，10 mM (CH₃COO)₂Mg，0.1 μg/mL BSA, pH7.9）中充分混匀，置于37 ℃环境中孵育1 - 3 h，使APOBEC3B作用于底物。孵育结束后向体系中加入3eq.底物互补链和0.5U限制性核酸内切酶BspH Ⅰ，充分混匀后置于37 ℃环境中孵育1-3 h，使限制性核酸内切酶BspH Ⅰ在核酸底物上发生酶切反应。进行荧光测定，在荧光分光光度计中设置激发波长为492 nm，收集500-700 nm的谱图，扫描速度为800 nm/min。

本实施例中，共设置了11个APOBEC3B浓度组，分别是0 nM、100 nM、200 nM、300nM、400 nM、500 nM、600 nM、700 nM、800 nM、900 nM、1000 nM和1100 nM，通过荧光滴定验证该试剂盒的可行性。实验结果如图6所示，随着APOBEC3B浓度的增加，FAM的荧光强度逐渐下降，TAMRA的荧光强度逐渐上升，TAMRA与FAM的荧光强度比值逐渐增大，符合实验预期。基于荧光共振能量转移的作用，在反应体系中，随着APOBEC3B浓度的增加，有越来越多的核酸底物被APOBEC3B编辑突变，以致限制性核酸内切酶BspH Ⅰ酶切位点消失，BspH Ⅰ酶无法切割核酸底物，因此荧光基团FAM的激发能诱发TAMRA发出荧光，且FAM自身的荧光强度衰减。该实施例中，所设计的试剂盒使用荧光滴定可以灵敏地检测到体系中不同浓度的APOBEC3B，且每个浓度组设置了3次重复实验，实验数据展示了较好的稳定性。

实施例7：最小检测限计算。

将实施例4中所得实验数据以APOBEC3B浓度为横坐标，TAMRA/FAM荧光强度比值为纵坐标进行线性拟合，如图7，当APOBEC3B的浓度为400 - 1100 nM时，拟合曲线呈现出较好的线性关系，拟合度R²=0.9891，因此该范围为APOBEC3B的线性检测范围。接着利用公式计算本发明检测方法的检测限，公式为LOD=K×S _b/m，其中m是APOBEC3B浓度（C）与TAMRA/FAM拟合出的直线的斜率，S_b为仪器的标准偏差，K值参考国际纯粹和应用化学联合会建议一般情况下取3。因此，根据上述公式代入计算，求得本发明检测方法的检测限为21 nM。该结果展现出了本发明检测方法对APOBEC3B良好的检测能力。

实施例8：本发明试剂盒筛选APOBEC3B抑制剂能力。

将多个浓度非特异性APOBEC3非共价抑制剂MN1（金精三羧酸）（图8（a））与1000 nMAPOBEC3B在buffer中提前作用1 h。再加入75 nM的APOBEC3B底物，充分混匀后将混合液置于37 ℃反应1 h，使脱氨反应发生。反应结束后向混合液中加入3 eq.底物互补链和0.5 UBspH Ⅰ。充分混匀后将混合液置于37 ℃反应1 h，使酶切反应发生。激发波长492 nm记录发射光谱，收集500-700 nm的波长范围图谱。

当1000 nM APOBEC3B和2 μM MN1加入荧光检测仪器后，荧光曲线落在了APOBEC3B浓度为200 nM和400 nM之间的曲线的位置（图8（b）），且随着MN1浓度增加，TAMRA/FAM值逐渐减小，意味着APOBEC3B的活性逐渐降低（图8（c））。我们的结果表明，所设计的试剂盒可以鉴定出MN1为抑制APOBEC3B活性的有效化合物，且对APOBEC3B的IC₅₀值为0.87 μM（图8（d））。因此，我们所设计的试剂盒是有能力筛选出APOBEC3B抑制剂的。

实施例9：细胞内APOBEC3B含量检测。

T25培养瓶中的细胞（MDA-MB-231、MCF-7、HeLa、SK-BR-3）用含有10% FBS的DMEM培养基在37 ℃、5% CO₂环境培养。细胞用预冷的PBS洗涤，然后用胰蛋白酶消化脱落。终止消化后，用1.5 ml EP管收集悬浮液，2500 - 3000 rpm离心10 min，去上清。细胞颗粒沉淀用PBS重悬洗涤，2500 - 3000 rpm离心10 min，去上清。每种细胞添加100 μL RIPA和适量的蛋白酶磷酸化酶抑制剂，随后置于冰上裂解20 min。细胞裂解液在12,000 rpm离心20 min，收集上清液。用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定上清液总蛋白浓度。用前述试剂盒检测不同细胞相同质量蛋白中APOBEC3B的活性。

该实施例结果如图9所示，我们的结果显示，四种细胞的总蛋白加入荧光检测仪器后，MDA-MB-231显示出相对最大的TAMRA/FAM值，即具有相对最高的APOBEC3B活性，MCF-7和HeLa次之，而SK-BR-3显示出相对最小的APOBEC3B活性。Western blot也验证了我们的结果，MDA-MB-231的APOBEC3B表达量相对最高，紧接着为MCF-7和HeLa，SK-BR-3的APOBEC3B表达量相对最少（图10）。此前也有研究证明MDA-MB-231中APOBEC3B mRNA转录水平是最高的，其次为MCF-7，而SK-BR-3中则未检测到APOBEC3B mRNA转录。因此，本发明所设计的试剂盒有能力检测细胞内APOBEC3B的表达水平。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合和简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 广东工业大学

<120> 一种用于检测核酸胞嘧啶脱氨酶APOBEC3B的试剂盒及其应用

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 1

tataagttat catgatatat a 21

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 2

tatatcatga aattatatat a 21

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 3

tataagttat catgatatat aaaa 24

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 4

tatatcatga aattatatat aaaa 24

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 5

tatatatcat gataacttat a 21

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 6

tatatataat ttcatgatat a 21

<210> 7

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 7

ttttatatat catgataact tata 24

<210> 8

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 8

ttttatatat aatttcatga tata 24

Claims

1.一种单链DNA，其特征在于，所述单链DNA带有核酸胞嘧啶脱氨酶APOBEC3B识别位点，所述核酸胞嘧啶脱氨酶APOBEC3B识别位点能够被限制性核酸内切酶识别后切开，所述单链DNA的5’端被荧光基团修饰，3’端被淬灭基团修饰。

2.根据权利要求1所述的单链DNA，其特征在于，所述核酸胞嘧啶脱氨酶APOBEC3B识别位点为5’-TCA，所述限制性核酸内切酶为能在5’-TCA处切开所述单链DNA的限制性内切酶BspH Ⅰ。

3.根据权利要求1所述的单链DNA，其特征在于，所述单链DNA的序列如SEQ ID NO:1所示；

所述荧光基团包括FAM、TET、JOE、HEX、CY3、TAMRA、ROX、Texas Red、LC RED640、CY5和LCRED705中的至少一种，所述淬灭基团包括FAM、TET、JOE、HEX、CY3、TAMRA、ROX、Texas Red、LCRED640、CY5、LC RED705、BHQ1、BHQ2、BHQ3和DABCYL中的至少一种。

4.一种用于检测核酸胞嘧啶脱氨酶APOBEC3B的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如权利要求1-3任一所述的单链DNA，所述单链DNA的互补链、限制性核酸内切酶BspH Ⅰ，以及缓冲液。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述缓冲液为第一缓冲液、第二缓冲液、第三缓冲液或第四缓冲液；

所述第一缓冲液包括10–50 mM CH₃COOK, 10-100 mM Tris-acetate，10-100 mM(CH₃COO)₂Mg，0.1-10 μg/mL BSA, pH 5-8；

所述第三缓冲液包括5-100 mM HEPES, 50-200mM NaCl，pH 5-8;

所述第四缓冲液包括5-50 mM Tris-HCl, 0.5-5 mM EDTA, pH 5-8。

6.一种用于检测核酸胞嘧啶脱氨酶APOBEC3B的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

（1）将缓冲液、核酸胞嘧啶脱氨酶APOBEC3B、如权利要求1-3任一所述的单链DNA加入EP管中孵育；

（2）加入所述单链DNA的互补链、限制性核酸内切酶BspH Ⅰ孵育；

（3）对步骤（2）中孵育后的产物进行荧光检测。

7.一种用于筛选核酸胞嘧啶脱氨酶APOBEC3B抑制剂的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如权利要求4或5所述的试剂盒，以及核酸胞嘧啶脱氨酶APOBEC3B。

8.一种用于筛选核酸胞嘧啶脱氨酶APOBEC3B抑制剂的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

S2，加入如权利要求1-3任一所述的单链DNA，充分混匀后反应；

S4，对步骤S3中反应后的产物进行荧光检测。

9.如权利要求1-3任一所述的单链DNA、限制性核酸内切酶BspH Ⅰ或如权利要求4或5所述的试剂盒在制备用于检测核酸胞嘧啶脱氨酶APOBEC3B的试剂盒或者用于筛选核酸胞嘧啶脱氨酶APOBEC3B抑制剂中的应用。