CN117802095A - 一种检测核酸胞嘧啶脱氨酶apobec3b活性的化学发光试剂盒及其应用 - Google Patents
一种检测核酸胞嘧啶脱氨酶apobec3b活性的化学发光试剂盒及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于化学发光检测技术领域，特别涉及一种检测核酸胞嘧啶脱氨酶APOBEC3B活性的化学发光试剂盒及其应用。本发明提供了一种单链DNA以及包含该单链DNA的检测核酸胞嘧啶脱氨酶APOBEC3B活性的化学发光试剂盒、筛选核酸胞嘧啶脱氨酶APOBEC3B抑制剂的化学发光试剂盒。本发明提供单链DNA和试剂盒利用化学发光进行显色，能够灵敏且稳定地检测出不同浓度APOBEC3B的活性，可以有效避免化合物对传统生物发光的淬灭干扰，防止检出假阳性，检测方法方便快捷，成本较低，可以适用于高通量筛选APOBEC3B抑制剂。
Description
技术领域
本发明属于化学发光检测技术领域，特别涉及一种检测核酸胞嘧啶脱氨酶APOBEC3B活性的化学发光试剂盒及其应用。
背景技术
APOBEC3B是胞苷脱氨酶中主导肿瘤基因组突变的酶，也是APOBEC家族中唯一核定位的成员，它在肿瘤细胞内选择性识别并编辑5'-TC短序列，并能在DNA损伤修复机制下形成极具特征的TC>TT或TC>TG突变标签。
一项发表于Nature期刊研究的结果表明，在乳腺癌中APOBEC3B是APOBEC家族酶中唯一普遍异常激活的成员，并且其表达量与TC短序列突变程度呈正相关。大规模肿瘤基因组测序表明，这些TC短序列突变标签大量存在于约50%的人类肿瘤中，而在胞苷脱氨酶家族中仅APOBEC3B在这些肿瘤中mRNA过表达。进一步的证据表明，APOBEC3B在肿瘤中的高表达与差的临床预后相关联。肿瘤细胞中持续的APOBEC3B活性能促使肿瘤组织分支进化与耐药性克隆产生。在非小细胞肺癌中，晚期的细胞克隆中能检测到APOBEC酶对肺癌驱动基因（如PTPRD、EP300及TGFBR1等）的突变，而在头颈癌中，APOBEC3B异常激活则能产生PIK3CA螺旋结构域突变（E542/545L）。这些结果预示了常见的原癌基因或药物靶点能成为APOBEC3B的编辑对象。在ER阳性乳腺癌中，APOBEC3B的高表达与较差的辅助疗法效能相关联，并且是他莫昔芬疗法耐药性产生的原因，因此APOBEC3B是一个经过初步验证的抗肿瘤药物耐药性产生靶标。
考虑到APOBEC3B在癌症发生发展中的重要作用，以及APOBEC3B是一种非必需蛋白，它在先天性免疫中的角色可以被其它AOPBEC成员所替代，因此寻找选择性抑制APOBEC3B的抑制剂可以抑制现有抗癌治疗中出现的耐药性，构建起高效灵敏的抑制剂筛选方法尤为重要。
目前在体外针对APOBEC3B酶活性的检测方法非常有限，主要是通过使用荧光标记技术实时监测APOBEC3B的酶活性，并提供定量结果。然而该方法在用于APOBEC3B小分子化合物抑制剂的筛选中存在局限性，部分小分子化合物会淬灭标记的荧光信号，不能提供真实的检测结果。另一种方法是通过基因组测序手段，使用具有APOBEC3B酶特异性的底物，APOBEC3B酶会催化底物上的脱嘌呤嘧啶位点的化学修饰，产生特定的产物，但这种方法技术难度大且价格昂贵。因此，本领域迫切需要开发在体外能够对APOBEC3B酶活性进行特异性检测且方便快捷的技术方法。
发明内容
为了克服现有技术的不足和缺点，本发明的首要目的在于提供一种单链DNA，该单链DNA可基于化学发光法用于检测核酸胞嘧啶脱氨酶APOBEC3B活性或用于筛选核酸胞嘧啶脱氨酶APOBEC3B抑制剂等。
本发明的另一目的在于提供一种检测核酸胞嘧啶脱氨酶APOBEC3B活性的化学发光试剂盒。
本发明的再一目的在于提供一种筛选核酸胞嘧啶脱氨酶APOBEC3B抑制剂的化学发光试剂盒。
本发明的第四个目的在于提供上述单链DNA和试剂盒的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种单链DNA，所述单链DNA具有核酸胞嘧啶脱氨酶APOBEC3B识别位点，所述的单链DNA为核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示和核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示中的至少一种：
SEQ ID NO:3：5’-TTTTTTTTTTGTTGAAGATAAATCATTTTT-3’；
SEQ ID NO:4：5’-TTTTTTTTTTGTTGAAGAAAAATCATTTTT-3’。
所述的单链DNA的5，端优选连接化学连接类基团。
所述的化学连接类基团优选为生物素或地高辛。
优选地，所述的单链DNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
优选地，所述的单链DNA的互补链，其核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示：
SEQ ID NO:8：5’-CCCCCCTTTGACATATCTTCAAC-3’。
一种检测核酸胞嘧啶脱氨酶APOBEC3B活性的化学发光试剂盒，包含上述单链DNA、上述单链DNA的互补链、TMB显色液、显色终止液、脱氨缓冲液和洗脱液。
一种基于化学发光法检测核酸胞嘧啶脱氨酶APOBEC3B活性的方法，包含如下步骤：
（1）在含有上述单链DNA的互补链的PBS溶液中加入EDC，充分混匀后孵育；
（2）将步骤（1）孵育后的混合溶液加入到包被BSA的酶标板中进行孵育，孵育结束后用PBS溶液洗板，再加入质量分数为1%的脱脂奶粉溶液或质量分数为2%的PEG-4000溶液进行封闭，封闭结束后用PBST溶液洗板，得到偶联有互补链的酶标板；
（3）将脱氨缓冲液、核酸胞嘧啶脱氨酶APOBEC3B和上述单链DNA混合均匀后孵育；
（4）将步骤（3）孵育后的混合溶液加入到步骤（2）中的酶标板中进行孵育，孵育结束后用0.1×PBST溶液洗板；
（5）向酶标板中加入SA-HRP（辣根过氧化物酶标记链霉亲和素）或辣根过氧化物酶标记地高辛抗体进行孵育，孵育结束后用0.1×PBST溶液洗板；
（6）向酶标板中加入TMB显色液，避光孵育后加入显色终止液，在450 nm的波长下测定吸光度。
优选地，步骤（1）中所述的含有单链DNA的互补链的PBS溶液中互补链的浓度为2-50 nM。
优选地，步骤（1）中所述的EDC的用量为互补链的2-50倍当量。
优选地，步骤（1）中所述的孵育的温度为25℃，孵育时间为10-60 min。
优选地，步骤（1）和（2）中所述的PBS溶液的pH值为4-6。
优选地，步骤（2）中所述的包被BSA的酶标板，通过如下制备方法得到：
使用pH 9.4的50 mM碳酸盐缓冲液配制质量分数为1%的BSA溶液，向酶标板中加入质量分数为1%的BSA溶液，4℃静置包被过夜后，用PBST溶液洗板2-4次。
优选地，步骤（2）中所述的孵育的温度为37℃，孵育的时间为1-3h。
优选地，步骤（2）中所述的孵育后的混合溶液的加入量为100μL；质量分数为1%的脱脂奶粉溶液或质量分数为2%的PEG-4000溶液的加入量为200 μL。
优选地，步骤（2）中所述的1%脱脂奶粉溶液或2% PEG-4000溶液用PBS溶液配制。
优选地，步骤（2）中所述的封闭的温度为37℃，封闭的时间为1-3h。
优选地，步骤（3）中所述的脱氨缓冲液的组成为：25 mM HEPES，100mM NaCl，pH7.4。
优选地，步骤（3）中所述的孵育的温度为37℃，孵育的时间为1-3h。
优选地，步骤（4）中所述的孵育的温度为37℃，孵育的时间为10-60 min。
优选地，步骤（4）中所述的孵育后的混合溶液的加入量优选为300μL。
优选地，步骤（5）中所述的SA-HRP的加入量优选为100μL。
优选地，步骤（5）中所述的孵育的温度为25℃，孵育的时间为10-60 min。
优选地，步骤（6）中所述的孵育的温度为25℃，孵育的时间为10-60 min。
优选地，步骤（6）中所述的显色终止液为2M H2SO4。
优选地，步骤（6）中所述的测定吸光度优选在加入显色终止液后的15 min内测定吸光度。
优选地，步骤（4）和（5）中所述的0.1×PBST溶液的pH值为pH 8.5。
优选地，步骤（2）、（4）和（5）中所述的用PBST溶液洗板或用0.1×PBST溶液洗板的次数优选为3-6次。
一种筛选核酸胞嘧啶脱氨酶APOBEC3B抑制剂的化学发光试剂盒，包含上述单链DNA、上述单链DNA的互补链、TMB显色液、显色终止液、脱氨缓冲液、洗脱液以及核酸胞嘧啶脱氨酶APOBEC3B。
一种基于化学发光法筛选核酸胞嘧啶脱氨酶APOBEC3B抑制剂的方法，包含如下步骤：
S1）将待测化合物与核酸胞嘧啶脱氨酶APOBEC3B在脱氨缓冲液中预孵育；
S2）加入上述单链DNA，充分混匀后孵育；
S3）将步骤S2）孵育后的混合溶液加入到偶联有互补链的酶标板中进行孵育，孵育结束后用0.1×PBST溶液洗板；
S4）向酶标板中加入SA-HRP或辣根过氧化物酶标记地高辛抗体进行孵育，孵育结束后用0.1×PBST溶液洗板；
S5）在酶标板中加入TMB显色液，避光孵育后加入显色终止液，在450 nm的波长下测定吸光度。
优选地，步骤S1）中所述的预孵育的温度为37℃，预孵育的时间为1-3h。
优选地，步骤S2）中所述的孵育的温度为37℃，孵育的时间为1-3h。
优选地，步骤S3）中所述的偶联有互补链的酶标板，通过如下方法制备：
①在含有上述单链DNA的互补链的PBS溶液中加入EDC，充分混匀后孵育。
②将步骤①孵育后的混合溶液加入到包被BSA的酶标板中进行孵育，孵育结束后用PBS溶液洗板，再加入质量分数为1%的脱脂奶粉溶液或质量分数为2%的PEG-4000溶液进行封闭，封闭结束后用PBST溶液洗板，得到偶联有互补链的酶标板。
所述的单链DNA、试剂盒在制备检测核酸胞嘧啶脱氨酶APOBEC3B活性或筛选核酸胞嘧啶脱氨酶APOBEC3B抑制剂的产品中的应用。
本发明的原理：
本发明通过设计一条含有核酸胞嘧啶脱氨酶APOBEC3B识别位点的单链DNA，且其5，端连接有生物素，APOBEC3B识别位点5’-TCA的胞嘧啶C会在APOBEC3B酶活性的作用下突变成尿嘧啶U，这时将该单链DNA加入到固定有互补链的酶标板中孵育，再用洗脱液清洗酶标板，由于胞嘧啶C突变成尿嘧啶U，与互补链形成错配，利用单链DNA与互补链之间的错配数量不同导致的结合能力差异，将连接有生物素的单链DNA洗脱下来，此时再加入SA-HRP孵育和TMB显色液显色，则检测不到明显的吸光度。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
本发明的试剂盒能够灵敏且稳定地检测出不同浓度APOBEC3B的活性，更重要的是应用在筛选抑制剂上，利用化学发光进行显色，可以有效避免化合物对传统生物发光的淬灭干扰，防止检出假阳性抑制剂，且检测方法方便快捷，成本较低，可以适用于高通量筛选APOBEC3B抑制剂。
附图说明
图1是本实施例1所述1号单链DNA底物检测APOBEC3B酶活性的方案示意图。
图2是本实施例2所述2号单链DNA底物检测APOBEC3B酶活性的方案示意图。
图3是本实施例3所述3号单链DNA底物检测APOBEC3B酶活性的方案示意图。
图4是本实施例4所述4号单链DNA底物检测APOBEC3B酶活性的方案示意图。
图5是本实施例5所述5号单链DNA底物检测APOBEC3B酶活性的方案示意图。
图6是本实施例6所述6号单链DNA底物检测APOBEC3B酶活性的方案示意图。
图7是本实施例7所述7号单链DNA底物检测APOBEC3B酶活性的方案示意图。
图8是本实施例1所述检测方案的吸光度结果图。
图9是本实施例2所述检测方案的吸光度结果图。
图10是本实施例3所述检测方案的吸光度结果图。
图11是本实施例4所述检测方案的吸光度结果图。
图12是本实施例5所述检测方案的吸光度结果图。
图13是本实施例6所述检测方案的吸光度结果图。
图14是本实施例7所述检测方案的吸光度结果图。
图15是本实施例8所述APOBEC3B抑制剂验证本发明试剂盒可行性的吸光度结果图。
图16是本实施例8所述APOBEC3B抑制剂的化学结构式展示图。
图17是本实施例9所述基于FRET效应与UDG酶参与的APOBEC3B生物传感器检测自发荧光化合物作为APOBEC3B抑制剂的方案示意图。
图18是本实施例9所述化合物YB、BYB和BYBN的化学结构式展示图。
图19是本实施例9所述检测方案的荧光光谱图。
图20是本实施例10所述检测方案的吸光度结果图。
图21是本实施例11所述APOBEC3B最低检测限计算结果图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
本发明以下实施例中所使用的化学药品及试剂均为现有或市售产品。
实施例中，脱氨缓冲液的组成为：25 mM HEPES，100mM NaCl，pH 7.4。
实施例中，PBS溶液（pH5）和PBST溶液（pH8.5）均为常用的市售试剂，其中，0.1×PBST溶液（pH 8.5）由PBST溶液稀释十倍得到。
实施例1：1号单链DNA底物用于检测APOBEC3B酶活性的可行性试验
一、单链DNA的设计、合成
设计合成七条单链DNA及互补链，其核苷酸序列如表1所示（此时序列未进行生物素标记），然后对七条单链DNA序列5’端进行生物素（Biotin）标记，引物的合成及生物素标记均由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。
表1 单链DNA核苷酸序列
| 单链DNA序号 | 核苷酸序列 |
| 1号单链DNA | 5’-TTTTTTTTTTGTTGAAGATATGTCATTTTT-3’ |
| 2号单链DNA | 5’-TTTTTTTTTTGTTGAAGATATATCATTTTT-3’ |
| 3号单链DNA | 5’-TTTTTTTTTTGTTGAAGATAAATCATTTTT-3’ |
| 4号单链DNA | 5’-TTTTTTTTTTGTTGAAGAAAAATCATTTTT-3’ |
| 5号单链DNA | 5’-TTTTTTTTTTGTTGAATAAAAATCATTTTT-3’ |
| 6号单链DNA | 5’-TTTTTTTTTTGTTGAGTAAAAATCATTTTT-3’ |
| 7号单链DNA | 5’-TTTTTTTTTTGTTAAGTAAAAATCATTTTT-3’ |
| 互补链 | 5’-CCCCCCTTTGACATATCTTCAAC-3’ |
二、1号单链DNA底物用于检测APOBEC3B酶活性的可行性试验
（1）将上述互补链用PBS溶液配制成含有终浓度为5nM互补链的溶液，然后在该溶液中加入EDC，其中，EDC的用量为互补链的50倍当量；充分混匀后室温25℃孵育20 min；
（2）使用50 mM碳酸盐缓冲液（pH 9.4）配制质量分数为1%的BSA溶液，向酶标板96个孔中每孔加入200μL质量分数为1%的BSA溶液，4℃静置包被过夜后，用PBST溶液洗板3次，得到包被BSA的酶标板待用；分别取100 μL步骤（1）孵育后的混合溶液加入到包被BSA的酶标板的每个孔中，37℃孵育2h，后用PBS溶液洗板1次；然后每孔再加入200 μL质量分数为1%的脱脂奶粉（用PBS溶液配制），37℃封闭1h，封闭结束后用PBST洗板3次；
（3）在EP管中加入脱氨缓冲液、不同终浓度的APOBEC3B和终浓度为2.5 nM的1号单链DNA（5，端连接生物素），反应体系总体积为300 μL，充分混合均匀后37℃孵育1h；本实施例中，共设置了6个APOBEC3B浓度组，分别是终浓度为0 nM、200 nM、400 nM、600 nM、800 nM和1000 nM，每个浓度组设置了3次重复实验。
（4）将步骤（3）孵育后的混合溶液加入到步骤（2）中偶联有互补链的酶标板中，37℃孵育60 min；孵育结束后用0.1×PBST溶液（pH 8.5）洗板6次，每次300μL；
（5）向酶标板中每孔加入100μL 12000×SA-HRP，25℃孵育20 min，孵育结束后用0.1×PBST溶液（pH 8.5）洗板6次，每次300μL；
（6）向酶标板中每孔加入100μL TMB显色液，25℃避光孵育60 min；最后每孔加入100μL显色终止液（2M H2SO4），15 min内在450 nm处测定吸光值。
本实施例的APOBEC3B酶活性检测方案示意图如图1所示。如果APOBEC3B的酶活性起作用，将1号单链DNA的胞嘧啶突变成尿嘧啶，该链的第11-25位碱基中将有1个碱基与互补链产生错配，按照设计预期，该链会被洗脱下来，此时用TMB显色液显色则没有信号；如果APOBEC3B失活，该链的第11-25个碱基中将有0个碱基与互补链产生错配，按照设计预期，该链不会被洗脱下来，此时用TMB显色液显色能够检测到该单链DNA 5，末端的生物素，在450nm处能够检测到吸光度。实验结果如图8所示，不同浓度组的之间的吸光度没有显示出浓度梯度，说明不同浓度APOBEC3B的活性对该单链DNA的突变影响不能以稳定的、有规律的结果展示出来，因此1号单链DNA不适合作为该试剂盒的单链DNA。
实施例2：2号单链DNA底物用于检测APOBEC3B酶活性的可行性试验
（1）同实施例1；
（2）同实施例1；
（3）在EP管中加入脱氨缓冲液、不同终浓度的APOBEC3B和终浓度为2.5 nM的2号单链DNA（5，端连接生物素），反应体系总体积为300 μM，充分混合均匀后37℃孵育1h；本实施例中，共设置了6个APOBEC3B浓度组，分别是终浓度为0 nM、200 nM、400 nM、600 nM、800 nM和1000 nM，每个浓度组设置了3次重复实验。
（4）同实施例1；
（5）同实施例1；
（6）同实施例1；
本实施例的APOBEC3B酶活性检测方案示意图如图2所示。如果APOBEC3B的酶活性起作用，将2号单链DNA的胞嘧啶突变成尿嘧啶，该链的第11-25位碱基中将有2个碱基与互补链产生错配，按照设计预期，该链会被洗脱下来，此时用TMB显色液显色则没有信号；如果APOBEC3B失活，该链的第11-25个碱基中将有1个碱基与互补链产生错配，按照设计预期，该链不会被洗脱下来，此时用TMB显色液显色能够检测到该单链DNA 5，末端的生物素，在450nm处能够检测到吸光度。实验结果如图9所示，不同浓度组的之间的吸光度没有显示出浓度梯度，说明不同浓度APOBEC3B的活性对该单链DNA的突变影响不能以稳定的、有规律的结果展示出来，因此2号单链DNA不适合作为该试剂盒的单链DNA。
实施例3：3号单链DNA底物用于检测APOBEC3B酶活性的可行性试验
（1）同实施例1；
（2）同实施例1；
（3）在EP管中加入脱氨缓冲液、不同终浓度的APOBEC3B和终浓度为2.5 nM的3号单链DNA（5，端连接生物素），反应体系总体积为300 μM，充分混合均匀后37℃孵育1h；本实施例中，共设置了6个APOBEC3B浓度组，分别是终浓度为0 nM、200 nM、400 nM、600 nM、800 nM和1000 nM，每个浓度组设置了3次重复实验。
（4）同实施例1；
（5）同实施例1；
（6）同实施例1；
本实施例的APOBEC3B酶活性检测方案示意图如图3所示。如果APOBEC3B的酶活性起作用，将3号单链DNA的胞嘧啶突变成尿嘧啶，该链的第11-25位碱基中将有3个碱基与互补链产生错配，按照设计预期，该链会被洗脱下来，此时用TMB显色液显色则没有信号；如果APOBEC3B失活，该链的第11-25个碱基中将有2个碱基与互补链产生错配，按照设计预期，该链不会被洗脱下来，此时用TMB显色液显色能够检测到该单链DNA 5，末端的生物素，在450nm处能够检测到吸光度。实验结果如图10所示，可以看到随着APOBEC3B浓度的增加，核酸底物在450 nm处的吸光度逐渐降低，实验数据展示了该试剂盒具有良好的APOBEC3B酶活性检测能力和较好的稳定性。
实施例4：4号单链DNA底物用于检测APOBEC3B酶活性的可行性试验
（1）同实施例1；
（2）同实施例1；
（3）在EP管中加入脱氨缓冲液、不同终浓度的APOBEC3B和终浓度为2.5 nM的4号单链DNA（5，端连接生物素），反应体系总体积为300 μM，充分混合均匀后37℃孵育1h；本实施例中，共设置了6个APOBEC3B浓度组，分别是终浓度为0 nM、200 nM、400 nM、600 nM、800 nM和1000 nM，每个浓度组设置了3次重复实验。
（4）同实施例1；
（5）同实施例1；
（6）同实施例1；
如果APOBEC3B的酶活性起作用，将4号单链DNA的胞嘧啶突变成尿嘧啶，该链的第11-25位碱基中将有4个碱基与互补链产生错配，按照设计预期，该链会被洗脱下来，此时用TMB显色液显色则没有信号；如果APOBEC3B失活，该链的第11-25个碱基中将有3个碱基与互补链产生错配，按照设计预期，该链不会被洗脱下来，此时用TMB显色液显色能够检测到该单链DNA 5，末端的生物素，在450nm处能够检测到吸光度。实验结果如图11所示，在浓度为200-800nM之间，随着APOBEC3B浓度的增加，核酸底物在450 nm处的吸光度逐渐降低，实验数据展示了该试剂盒具有较好的APOBEC3B酶活性检测能力和较好的稳定性。
实施例5：5号单链DNA底物用于检测APOBEC3B酶活性的可行性试验
（1）同实施例1；
（2）同实施例1；
（3）在EP管中加入脱氨缓冲液、不同终浓度的APOBEC3B和终浓度为2.5 nM的5号单链DNA（5，端连接生物素），反应体系总体积为300 μM，充分混合均匀后37℃孵育1h；本实施例中，共设置了6个APOBEC3B浓度组，分别是终浓度为0 nM、200 nM、400 nM、600 nM、800 nM和1000 nM，每个浓度组设置了3次重复实验。
（4）同实施例1；
（5）同实施例1；
（6）同实施例1；
本实施例的APOBEC3B酶活性检测方案示意图如图5所示。如果APOBEC3B的酶活性起作用，将5号单链DNA的胞嘧啶突变成尿嘧啶，该链的第11-25位碱基中将有5个碱基与互补链产生错配，按照设计预期，该链会被洗脱下来，此时用TMB显色液显色则没有信号；如果APOBEC3B失活，该链的第11-25个碱基中将有4个碱基与互补链产生错配，按照设计预期，该链不会被洗脱下来，此时用TMB显色液显色能够检测到该单链DNA 5，末端的生物素，在450nm处能够检测到吸光度。实验结果如图12所示，不同浓度组的之间的吸光度没有显示出浓度梯度，说明不同浓度APOBEC3B的活性对该单链DNA的突变影响不能以稳定的、有规律的结果展示出来，因此5号单链DNA不适合作为该试剂盒的单链DNA。
实施例6：6号单链DNA底物用于检测APOBEC3B酶活性的可行性试验
（1）同实施例1；
（2）同实施例1；
（3）在EP管中加入脱氨缓冲液、不同终浓度的APOBEC3B和终浓度为2.5 nM的6号单链DNA（5，端连接生物素），反应体系总体积为300 μM，充分混合均匀后37℃孵育1h；本实施例中，共设置了6个APOBEC3B浓度组，分别是终浓度为0 nM、200 nM、400 nM、600 nM、800 nM和1000 nM，每个浓度组设置了3次重复实验。
（4）同实施例1；
（5）同实施例1；
（6）同实施例1；
本实施例的APOBEC3B酶活性检测方案示意图如图6所示。如果APOBEC3B的酶活性起作用，将6号单链DNA的胞嘧啶突变成尿嘧啶，该链的第11-25位碱基中将有6个碱基与互补链产生错配，按照设计预期，该链会被洗脱下来，此时用TMB显色液显色则没有信号；如果APOBEC3B失活，该链的第11-25个碱基中将有5个碱基与互补链产生错配，按照设计预期，该链不会被洗脱下来，此时用TMB显色液显色能够检测到该单链DNA 5，末端的生物素，在450nm处能够检测到吸光度。实验结果如图13所示，不同浓度组的之间的吸光度没有显示出浓度梯度，说明不同浓度APOBEC3B的活性对该单链DNA的突变影响不能以稳定的、有规律的结果展示出来，因此6号单链DNA不适合作为该试剂盒的单链DNA。
实施例7：7号单链DNA底物用于检测APOBEC3B酶活性的可行性试验
（1）同实施例1；
（2）同实施例1；
（3）在EP管中加入脱氨缓冲液、不同终浓度的APOBEC3B和终浓度为2.5 nM的7号单链DNA（5，端连接生物素），反应体系总体积为300 μM，充分混合均匀后37℃孵育1h；本实施例中，共设置了6个APOBEC3B浓度组，分别是终浓度为0 nM、200 nM、400 nM、600 nM、800 nM和1000 nM，每个浓度组设置了3次重复实验。
（4）同实施例1；
（5）同实施例1；
（6）同实施例1；
本实施例的APOBEC3B酶活性检测方案示意图如图7所示。如果APOBEC3B的酶活性起作用，将7号单链DNA的胞嘧啶突变成尿嘧啶，该链的第11-25位碱基中将有7个碱基与互补链产生错配，按照设计预期，该链会被洗脱下来，此时用TMB显色液显色则没有信号；如果APOBEC3B失活，该链的第11-25个碱基中将有6个碱基与互补链产生错配，按照设计预期，该链不会被洗脱下来，此时用TMB显色液显色能够检测到该单链DNA 5，末端的生物素，在450nm处能够检测到吸光度。实验结果如图14所示，不同浓度组的之间的吸光度没有显示出浓度梯度，说明不同浓度APOBEC3B的活性对该单链DNA的突变影响不能以稳定的、有规律的结果展示出来，因此7号单链DNA不适合作为该试剂盒的单链DNA。
实施例8：APOBEC3B抑制剂验证本发明试剂盒的可行性
金精三羧酸（ATA）和依布硒啉（ebselen）（其结构式见图16）是被证明具有抑制APOBEC3B酶活性的化合物，本实施例使用这两种抑制剂来验证本发明试剂盒的可行性以及其用于筛选APOBEC3B抑制剂的可行性。
（1）同实施例1；
（2）同实施例1；
（3）在EP管中加入脱氨缓冲液、不同浓度的抑制剂和1000 nM的APOBEC3B充分混合均匀，反应体系总体积为300 μL，充分混合均匀后37℃孵育1h，再加入终浓度为2.5 nM的3号单链DNA，37℃孵育1h；本实施例中，两种抑制剂各设置了4个浓度组，分别是0 μM、1μM、2μM和5 μM，每个浓度组设置了3次重复实验。
（4）同实施例1；
（5）同实施例1；
（6）同实施例1；
实验结果如图15所示，可以看到随着抑制剂浓度的增加，核酸底物在450 nm处的吸光度也随之增加，表明APOBEC3B的酶活性随之减弱，因此也证明了本发明试剂盒的可行性以及其具有用于筛选APOBEC3B抑制剂的可行性。
实施例9：基于FRET效应与UDG酶参与的APOBEC3B生物传感器验证筛选自发荧光化合物作为APOBEC3B抑制剂的可行性
基于FRET效应与UDG酶参与的APOBEC3B生物传感器的方案示意图如图17所示，如果APOBEC3B有活性，引物探针（核苷酸序列为：5’-TATAAGTTATCATGATATATA-3’，5’端具有6-FAM基团，3’端具有TAMRA基团）中的胞嘧啶将会被突变成尿嘧啶，那么在UDG酶的作用下引物探针会断开，此时在荧光分光光度计中用492 nm的激发波长照射样品，引物探针5’端的6-FAM基团将会发出绿光；如果APOBEC3B失活，引物探针在UDG酶的作用下引物探针不会断开，此时用492 nm的激发波长照射样品，由于荧光能量共振转移，5’端的6-FAM会被3’端的TAMRA所淬灭而发出TAMRA的黄色荧光。化合物BY、BYB和BYBN具有自发荧光，本实施例使用这三种化合物来验证基于FRET效应与UDG酶参与的APOBEC3B生物传感器验证筛选自发荧光化合物作为APOBEC3B抑制剂的可行性。
为了验证自发荧光的化合物是否会干扰引物探针的正常发光，本实施例设置了三个化合物组和一个空白对照组。在EP管中加入25 nM的引物探针和25 μM的化合物，充分混合均匀后进行荧光测定。实验结果如图19所示，YB组和BYBN组引物探针的荧光均被完全淬灭，而BYB组引物探针TAMRA的黄光也被淬灭并在667nm处发出红光。可以看到，该方法不适合用于筛选具有自发荧光的化合物作为APOBEC3B抑制剂。
实施例10：本发明试剂盒验证筛选自发荧光化合物作为APOBEC3B抑制剂的可行性
化合物BY、BYB和BYBN具有自发荧光，本实施例使用这三种化合物来验证本发明试剂盒筛选自发荧光化合物作为APOBEC3B抑制剂的可行性。
（1）同实施例1；
（2）同实施例1；
（3）在EP管中加入脱氨缓冲液、不同浓度的化合物和终浓度为1000 nM的APOBEC3B充分混合均匀，反应体系总体积为300 μL，充分混合均匀后在37℃孵育1h，再加入终浓度为2.5 nM的3号单链DNA，37℃孵育1h；本实施例中，三种化合物各设置了4个浓度组，分别是终浓度为0 μM、1μM、2 μM和5 μM，每个浓度组设置了3次重复实验。
（4）同实施例1；
（5）同实施例1；
（6）同实施例1；
实验结果如图20所示，可以看到随着化合物浓度的增加，BY和BYBN组的吸光度基本不变，BYB组的吸光度有小幅上升，说明了化合物BY和BYBN对APOBEC3B的活性几乎没有抑制作用，化合物BYB对APOBEC3B的活性有略微的抑制效果，同时了也证明了本发明试剂盒具有筛选自发荧光化合物作为APOBEC3B抑制剂的可行性。
实施例11：最低检测限计算
将实施例3中所得实验数据以APOBEC3B浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标进行线性拟合，如图21，当APOBEC3B的浓度为0-1000 nM时，拟合曲线呈现出较好的线性关系，拟合度R2=0 .992，因此该范围为APOBEC3B的线性检测范围。接着利用公式计算本发明检测方法的检测限，公式为LOD=K×Sb/m，其中m是APOBEC3B浓度（C）与吸光度值拟合出的直线的斜率，Sb为仪器的标准偏差，测得为0.0146，K值参考国际纯粹和应用化学联合会建议一般情况下取3。因此，根据上述公式代入计算，求得本发明检测方法的检测限为36.5 nM。该结果展现出了本发明检测方法对APOBEC3B良好的检测能力。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1. 一种单链DNA，其特征在于所述单链DNA具有核酸胞嘧啶脱氨酶APOBEC3B识别位点，所述的单链DNA为核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示和核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示中的至少一种；
所述的单链DNA的5，端连接化学连接类基团。
2.根据权利要求1所述的单链DNA，其特征在于：
所述的化学连接类基团为生物素或地高辛。
3. 权利要求1或2所述的单链DNA的互补链，其特征在于其核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示。
4.一种检测核酸胞嘧啶脱氨酶APOBEC3B活性的化学发光试剂盒，其特征在于包含权利要求1或2所述的单链DNA、权利要求3所述的单链DNA的互补链、TMB显色液、显色终止液、脱氨缓冲液和洗脱液。
5.一种基于化学发光法检测核酸胞嘧啶脱氨酶APOBEC3B活性的方法，其特征在于包含如下步骤：
（1）在含有权利要求3所述的单链DNA的互补链的PBS溶液中加入EDC，充分混匀后孵育；
（2）将步骤（1）孵育后的混合溶液加入到包被BSA的酶标板中进行孵育，孵育结束后用PBS溶液洗板，再加入质量分数为1%的脱脂奶粉溶液或质量分数为2%的PEG-4000溶液进行封闭，封闭结束后用PBST溶液洗板，得到偶联有互补链的酶标板；
（3）将脱氨缓冲液、核酸胞嘧啶脱氨酶APOBEC3B和权利要求1或2所述的单链DNA混合均匀后孵育；
（4）将步骤（3）孵育后的混合溶液加入到步骤（2）中的酶标板中进行孵育，孵育结束后用0.1×PBST溶液洗板；
（5）向酶标板中加入辣根过氧化物酶标记链霉亲和素或辣根过氧化物酶标记地高辛抗体进行孵育，孵育结束后用0.1×PBST溶液洗板；
（6）向酶标板中加入TMB显色液，避光孵育后加入显色终止液，在450 nm的波长下测定吸光度。
6.根据权利要求5所述的基于化学发光法检测核酸胞嘧啶脱氨酶APOBEC3B活性的方法，其特征在于：
步骤（1）中所述的EDC的用量为互补链的2-50倍当量。
7.一种筛选核酸胞嘧啶脱氨酶APOBEC3B抑制剂的化学发光试剂盒，其特征在于包含权利要求1或2所述的单链DNA、权利要求3所述的单链DNA的互补链、TMB显色液、显色终止液、脱氨缓冲液、洗脱液以及核酸胞嘧啶脱氨酶APOBEC3B。
8.一种基于化学发光法筛选核酸胞嘧啶脱氨酶APOBEC3B抑制剂的方法，其特征在于包含如下步骤：
S1）将待测化合物与核酸胞嘧啶脱氨酶APOBEC3B在脱氨缓冲液中预孵育；
S2）加入权利要求1或2所述的单链DNA，充分混匀后孵育；
S3）将步骤S2）孵育后的混合溶液加入到偶联有互补链的酶标板中进行孵育，孵育结束后用0.1×PBST溶液洗板；
S4）向酶标板中加入SA-HRP或辣根过氧化物酶标记地高辛抗体进行孵育，孵育结束后用0.1×PBST溶液洗板；
S5）在酶标板中加入TMB显色液，避光孵育后加入显色终止液，在450 nm的波长下测定吸光度。
9.根据权利要求8所述的基于化学发光法筛选核酸胞嘧啶脱氨酶APOBEC3B抑制剂的方法，其特征在于：
步骤S3）中所述的偶联有互补链的酶标板，通过如下方法制备：
①在含有权利要求3所述的单链DNA的互补链的PBS溶液中加入EDC，充分混匀后孵育；
②将步骤①孵育后的混合溶液加入到包被BSA的酶标板中进行孵育，孵育结束后用PBS溶液洗板，再加入质量分数为1%的脱脂奶粉溶液或质量分数为2%的PEG-4000溶液进行封闭，封闭结束后用PBST溶液洗板，得到偶联有互补链的酶标板。
10.权利要求1或2所述的单链DNA、权利要求3所述的单链DNA的互补链、权利要求4或7所述的试剂盒在制备检测核酸胞嘧啶脱氨酶APOBEC3B活性或筛选核酸胞嘧啶脱氨酶APOBEC3B抑制剂的产品中的应用。
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