CN113881639A - 一种狂犬病疫苗毒株的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种狂犬病疫苗毒株的制备方法，狂犬病毒的培养和收液；取BHK‑21细胞加生长液置二氧化碳培养箱37℃培养，待细胞长成单层后,将20瓶(20cm2细胞瓶)细胞,按随机方式分为2组,分别加rRC‑HL和rRC‑HLΔN毒种过夜，换维持液后2组均在接种1周后收液，用于生产2种不同毒株的狂犬病疫苗并加以比较；本发明所研制出的重组病毒，分别采用103和106FFU进行成年昆明小鼠脑内接种，均不能致死，免疫后产生的抗体水平高。
Description
技术领域
本发明涉及狂犬疫苗，尤其涉及一种狂犬病疫苗毒株的制备方法。
背景技术
狂犬病是一种古老的人兽共患传染病，一旦发病，死亡率100％。狂犬病病毒由5个基因组成，分别编码N、P、M、G和L蛋白。研究表明，G蛋白是致病性的主要蛋白。西原株(Nishigahara,Ni)为狂犬病病毒强毒株，通过用兔脑传代，再经过鸡胚传294代，CEF传8代，Vero细胞上传5代，仓鼠肺细胞(Hmlu)传代23代后得到了固定毒RC-HL株。RC-HL株弱毒株是目前日本广泛应用的一种作为免疫动物用的疫苗毒株，其安全性和免疫原性在研究和临床应用中都得到了验证。目前，市场上的狂犬病疫苗有灭活疫苗和弱毒疫苗，人用狂犬病疫苗均为灭活疫苗，兽用疫苗有的地方使用弱毒疫苗。传统的狂犬病疫苗均为分离狂犬病街毒通过动物或细胞传代使病毒致弱，作为疫苗毒株使用，然而这些方法获得的毒株和街毒比发生了某些碱基的突变，并且代表的是局部地域的毒株特性。本研究在现有疫苗毒株的基础上，通过基因工程改变病毒特性，制作疫苗免疫后产生的抗体对当地流行狂犬病进行有针对性保护，免疫保护效果比传统疫苗更有优越性。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明的目的之一在于提供一种狂犬病疫苗毒株的制备方法。
本发明的目的之一采用如下技术方案实现：
一种狂犬病疫苗毒株的制备方法，包括以下方法：
S1：孢毒种的种子社建立：将rRC-HLΔN株毒种P9,传代扩增并冻存为原始种子批；
S2：细胞毒种的检定；
S3：狂犬病毒的培养和收液；取BHK-21细胞加生长液置二氧化碳培养箱37℃培养,按随机方式分为2组,分别加rRC-HL和rRC-HLΔN毒种过夜，换维持液后2组均在接种1周后收液，用于生产2种不同毒株的狂犬病疫苗并加以比较；
S4：细胞毒种的病毒繁殖曲线测定；取已制备的单层BHK-21细胞30瓶，分为3组并分别加人10-3，10-4,10-5三个不同稀释度的细胞适应株每种，于2、4、6、8、10、12d取样并进行小白鼠毒力滴定；
S5：病毒原液的Elisa测定；
S6：狂犬病毒的纯化；2种不同毒种培养得到的病毒原液分别经醋酸锌沉淀、凝胶过滤层析等纯化方法制备成半成品。
S7：2种狂犬病毒株的电镜检测；将2种不同狂犬病毒株分别进行电镜观察。
S8：连续3批疫苗的试验质量评估。
进一步的，所述S2步骤中包括无菌试验、病毒滴定及外源因子检测和鉴别试验和不同狂犬病毒株免疫原性比较。
进一步的，所述S5步骤中需要通过改良Elisa间接法，并使用抗狂犬病毒糖蛋白单元克隆抗体代替多克隆抗体。
进一步的，所述S8步骤中疫苗的安全和效力试验按照中国生物制品规程进行，采用放免法检测半成品种小牛血清残余余量。
相比现有技术，本发明的有益效果在于：
1、本发明所研制出的重组病毒，分别采用103和106FFU进行成年昆明小鼠脑内接种，均不能致死，免疫后产生的抗体水平高。
2、在现有疫苗毒株的基础上，通过基因工程改变病毒特性，制作疫苗免疫后产生的抗体对当地流行狂犬病进行有针对性保护，免疫保护效果比传统疫苗更有优越性。
上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，而可依照说明书的内容予以实施，并且为了让本发明的上述和其他目的、特征和优点能够更明显易懂，以下特举较佳实施例，并配合附图，详细说明如下。
附图说明
图1为本发明框图；
图2 pRC-HLΔN突变体cDNA克隆的构建示意图；
图3 GX074和pRC-HLΔN突变体的基因比较图。
具体实施方式
下面，结合附图以及具体实施方式，对本发明做进一步描述，需要说明的是，在不相冲突的前提下，以下描述的各实施例之间或各技术特征之间可以任意组合形成新的实施例。
需要说明的是，当组件被称为“固定于”另一个组件，它可以直接在另一个组件上或者也可以存在居中的组件。当一个组件被认为是“连接”另一个组件，它可以是直接连接到另一个组件或者可能同时存在居中组件。当一个组件被认为是“设置于”另一个组件，它可以是直接设置在另一个组件上或者可能同时存在居中组件。本文所使用的术语“垂直的”、“水平的”、“左”、“右”以及类似的表述只是为了说明的目的。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“及/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
请参阅图1-3，一种狂犬病疫苗毒株的制备方法，包括以下方法：
S1：孢毒种的种子社建立：将rRC-HLΔN株毒种P9,传代扩增并冻存为原始种子批；
S2：细胞毒种的检定；无菌试验、病毒滴定及外源因子检测和鉴别试验和不同狂犬病毒株免疫原性比较；
S3：狂犬病毒的培养和收液；取BHK-21细胞加生长液置二氧化碳培养箱37℃培养,按随机方式分为2组,分别加rRC-HL和rRC-HLΔN毒种过夜，换维持液后2组均在接种1周后收液，用于生产2种不同毒株的狂犬病疫苗并加以比较；
S4：细胞毒种的病毒繁殖曲线测定；取已制备的单层BHK-21细胞30瓶，分为3组并分别加人10-3，10-4,10-5三个不同稀释度的细胞适应株每种，于2、4、6、8、10、12d取样并进行小白鼠毒力滴定；
S5：病毒原液的Elisa测定；需要通过改良Elisa间接法，并使用抗狂犬病毒糖蛋白单元克隆抗体代替多克隆抗体；
S6：狂犬病毒的纯化；2种不同毒种培养得到的病毒原液分别经醋酸锌沉淀、凝胶过滤层析等纯化方法制备成半成品。
S7：2种狂犬病毒株的电镜检测；将2种不同狂犬病毒株分别进行电镜观察。
S8：连续3批疫苗的试验质量评估；疫苗的安全和效力试验按照中国生物制品规程进行，采用放免法检测半成品种小牛血清残余余量。
上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。
Claims (4)
1.一种狂犬病疫苗毒株的制备方法，其特征在于：包括以下方法：
S1：孢毒种的种子社建立：将rRC-HLΔN株毒种P9,传代扩增并冻存为原始种子批；
S2：细胞毒种的检定；
S3：狂犬病毒的培养和收液；取BHK-21细胞加生长液置二氧化碳培养箱37℃培养,按随机方式分为2组,分别加rRC-HL和rRC-HLΔN毒种过夜，换维持液后2组均在接种1周后收液，用于生产2种不同毒株的狂犬病疫苗并加以比较；
S4：细胞毒种的病毒繁殖曲线测定；取已制备的单层BHK-21细胞30瓶，分为3组并分别加人10-3，10-4,10-5三个不同稀释度的每种细胞适应株，于2、4、6、8、10、12d取样并进行小白鼠毒力滴定；
S5：病毒原液的Elisa测定；
S6：狂犬病毒的纯化；2种不同毒种培养得到的病毒原液分别经醋酸锌沉淀、凝胶过滤层析等纯化方法制备成半成品。
S7：2种狂犬病毒株的电镜检测；将2种不同狂犬病毒株分别进行电镜观察。
S8：连续3批疫苗的试验质量评估。
2.如权利要求1所述的一种狂犬病疫苗毒株的制备方法，其特征在于：所述S2步骤中包括无菌试验、病毒滴定及外源因子检测和鉴别试验和不同狂犬病毒株免疫原性比较。
3.如权利要求1所述的一种狂犬病疫苗毒株的制备方法，其特征在于：所述S5步骤中需要通过改良Elisa间接法，并使用抗狂犬病毒糖蛋白单元克隆抗体代替多克隆抗体。
4.如权利要求1所述的一种狂犬病疫苗毒株的制备方法，其特征在于：所述S8步骤中疫苗的安全和效力试验按照中国生物制品规程进行，采用放免法检测半成品种小牛血清残余余量。
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