CN113880943A - 一种鳕鱼骨胶原蛋白活性肽的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种鳕鱼骨胶原蛋白活性肽的制备方法，包括以下步骤：S1原料预处理、S2辐射处理、S3酸处理、S4酶解、S5超声粉碎，本发明酶解提取的活性肽含量高，85.3～88.6mg/100g，其中分子量小于0.5kDa占比达到78.9％，在此分子量阶段的分子肽，能很好的被人体吸收保证肽功能性和活性。
Description
技术领域
本发明涉及生物制品制备技术领域，特别涉及一种鳕鱼骨胶原蛋白活性肽的制备方法。
背景技术
鳕鱼属脊椎动物门(Vertebrata)、脊椎动物亚门(Subphylum Vertebrata)、真骨鱼纲(Division Teleostei)、鳕形目(Gadiformes)。鳕鱼多是生活在海洋底层和深海中下层的冷水性鱼类，广泛分布于世界的各大洋。其中鳕科和无须鳕科中有许多经济价值极高的世界级重要经济鱼类。
胶原是结缔组织中及其重要的一种结构蛋白，广泛存在于动物的骨、腱、肌鞘、韧带、肌膜、软骨和皮肤中，在提取胶原蛋白肽的加工过程中，酶水解是肽制备过程中的十分关键的环节，通过酶水解将大分子的胶原蛋白分解成分子量较小的胶原蛋白肽。但是目前公开的胶原蛋白肽制备方法中大都是只采用了一次水解，在水解过程中存在水解度不高、蛋白质利用率较低等缺陷，造成很多原料的浪费，而且水解度不高便会出现水解后的蛋白肽分子量较大，从而进行二次酶解，从而获取分子量较小的分子肽，经过多次酶解后使得蛋白肽含量损失，获得的活性肽含量较低。
发明内容
鉴于此，本发明提出一种鳕鱼骨胶原蛋白活性肽的制备方法，解决上述问题。
本发明的技术方案是这样实现的：一种鳕鱼骨胶原蛋白活性肽的制备方法：包括以下步骤：
S1、原料预处理：将鳕鱼骨洗干净后，60～80℃水煮10～30min，过滤，取鱼骨浸泡于促渗剂中，浸泡时间12～24h，取出，粉碎，过120～180目，得到鱼骨粉；经过促渗剂浸泡能起到软化鱼骨的作用，有助于后续对可溶性胶原的提取，同时克服鱼骨胶原多肽的腥味、苦味、不良异味的缺点；
S2、辐射处理：将上述鱼骨粉经60Co-γ射线辐射处理，辐射剂量为30～40Gy，辐射剂量率为0.5～0.9Gy/min，辐射处理40～50min；经辐射处理后的鱼骨粉中的分子结构产生共振被活化，增强其分子间的结合力，活化骨粉中1-3kDa分子量的活性肽分子；
S3、酸处理：将S2辐射得到的骨粉与复合酸按质量体积比g/mL为2～6：0.3～0.9混合，在40～80℃下，摇床振荡60～100min，收集下层沉淀，上层为脱钙骨基质液；经过复合酸将鱼骨中的钙质脱离，
S4、酶解：将S3得到的脱钙骨基质液与复合酶在50～60℃、pH5～8下进行酶解1～3h，灭酶，收集水解液；
S5、超声粉碎：S4得到的水解液进行超声粉碎8～12min，进行超滤，得到胶原蛋白活性肽。
进一步的，所述S1的促渗剂为质量体积比g/mL为(0.3～0.8):(1.2～2.0):10的黑蒜多酚、薄荷醇、稀盐酸。
进一步的，所述S3复合酸为质量比为(0.1～0.3):(0.03～0.1):1的芳香酸、水杨酸和酒石酸。
进一步的，所述S4复合酶为质量比为(0.3～0.5):(1～4):(0.8～1.6)的碱性蛋白酶葡糖化酶和β-葡萄糖苷酶。
进一步的，所述S4脱钙骨基质液与复合酶的体积比为10～35:2～8。
进一步的，所述S5超声粉碎的频率为14～100KHz、功率为10～30w。
进一步的，所述S4的超滤为将超声后的水解液调至pH 6-7，在0.03～0.05MPa和23～30℃下超滤处理。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明鳕鱼骨胶原蛋白活性肽的制备方法，仅经一次酶解提取的活性肽含量高，达到85.3～88.6mg/100g，其中分子量小于0.5kDa占比达到88.9％；本发明制备方法中经促渗剂浸泡能起到软化鱼骨的作用，有助于后续对可溶性胶原的提取，同时克服鱼骨胶原多肽的腥味、苦味、不良异味的缺点，经60Co-γ辐射处理后的鱼骨粉中的分子结构产生共振被活化，增强其分子间的结合力，活化骨粉中1-3kDa分子量的活性肽分子，有助于后续酶解过程能够分解生产目标分子肽；通过复合酸处理将鱼骨中的钙质脱离，减少钙离子，提高目标分子量活性肽含量和透皮量，具有较好的生物相容性，为制备化妆品、药品领域奠定基础。
具体实施方式
为了更好理解本发明技术内容，下面提供具体实施例，对本发明做进一步的说明。
本发明实施例所用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
本发明实施例所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1
一种鳕鱼骨胶原蛋白活性肽的制备方法：包括以下步骤：
S1、原料预处理：将鳕鱼骨洗干净后，60℃水煮10min，过滤，取鱼骨浸泡于促渗剂中，促渗剂为质量体积比g/mL为0.3:1.2:10的黑蒜多酚、薄荷醇、稀盐酸，浸泡时间12h，取出，粉碎，过120目，得到鱼骨粉；
S2、辐射处理：将上述鱼骨粉经60Co-γ射线辐射处理，辐射剂量为30Gy，辐射剂量率为0.5Gy/min，辐射处理40min；
S3、酸处理：将S2得到的骨粉与复合酸按质量体积比g/mL为2：0.3混合，复合酸为质量比为0.1:0.03:1的芳香酸、水杨酸和酒石酸，在40℃下，摇床振荡60～100min，收集下层沉淀，上层为脱钙骨基质液；
S4、酶解：按照体积比为10:2将S3得到的脱钙骨基质液与复合酶在50℃、pH5下进行酶解1h，灭酶，收集水解液，复合酶为质量比为0.3:1:0.8的碱性蛋白酶葡糖化酶和β-葡萄糖苷酶；
S5、超声粉碎：S4得到的水解液进行超声粉碎8min，频率为14KHz、功率为10w，将水解液调至pH 6，在0.03MPa和23℃下超滤处理，得到胶原蛋白活性肽。
实施例2
一种鳕鱼骨胶原蛋白活性肽的制备方法：包括以下步骤：
S1、原料预处理：将鳕鱼骨洗干净后，80℃水煮30min，过滤，取鱼骨浸泡于促渗剂中，促渗剂为质量体积比g/mL为0.8:2.0:10的黑蒜多酚、薄荷醇、稀盐酸，浸泡时间24h，取出，粉碎，过180目，得到鱼骨粉；
S2、辐射处理：将上述鱼骨粉经60Co-γ射线辐射处理，辐射剂量为40Gy，辐射剂量率为0.9Gy/min，辐射处理50min；
S3、酸处理：将S2得到的骨粉与复合酸按质量体积比g/mL为6：0.9混合，复合酸为质量比为0.3:0.1:1的芳香酸、水杨酸和酒石酸，在80℃下，摇床振荡100min，收集下层沉淀，上层为脱钙骨基质液；
S4、酶解：按照体积比为35:8将S3得到的脱钙骨基质液与复合酶在60℃、pH8下进行酶解3h，灭酶，收集水解液，复合酶为质量比为0.5:4:1.6的碱性蛋白酶葡糖化酶和β-葡萄糖苷酶；
S5、超声粉碎：S4得到的水解液进行超声粉碎12min，频率为100KHz、功率为30w，将水解液调至pH 7，在0.05MPa和30℃下超滤处理，得到胶原蛋白活性肽。
实施例3
一种鳕鱼骨胶原蛋白活性肽的制备方法：包括以下步骤：
S1、原料预处理：将鳕鱼骨洗干净后，70℃水煮20min，过滤，取鱼骨浸泡于促渗剂中，促渗剂为质量体积比g/mL为0.5:1.6:10的黑蒜多酚、薄荷醇、稀盐酸，浸泡时间20h，取出，粉碎，过150目，得到鱼骨粉；
S2、辐射处理：将上述鱼骨粉经60Co-γ射线辐射处理，辐射剂量为35Gy，辐射剂量率为0.7Gy/min，辐射处理45min；
S3、酸处理：将S2得到的骨粉与复合酸按质量体积比g/mL为4：0.6混合，复合酸为质量比为0.2:0.07:1的芳香酸、水杨酸和酒石酸，在60℃下，摇床振荡80min，收集下层沉淀，上层为脱钙骨基质液；
S4、酶解：按照体积比为22:6将S3得到的脱钙骨基质液与复合酶在55℃、pH6下进行酶解2h，灭酶，收集水解液，复合酶为质量比为0.4:2:1.2的碱性蛋白酶葡糖化酶和β-葡萄糖苷酶；
S5、超声粉碎：S4得到的水解液进行超声粉碎10min，频率为100KHz、功率为20w，将水解液调至pH 6，在0.04MPa和27℃下超滤处理，得到胶原蛋白活性肽。
对比例1
本对比例与实施例3区别在于，在S1步骤中未加入促渗剂进行浸泡；
具体为鳕鱼骨胶原蛋白活性肽的制备方法，包括以下步骤：
S1、原料预处理：将鳕鱼骨洗干净后，70℃水煮20min，过滤，粉碎，过150目，得到鱼骨粉；
S2、辐射处理：将上述鱼骨粉经60Co-γ射线辐射处理，辐射剂量为35Gy，辐射剂量率为0.7Gy/min，辐射处理45min；
S3、酸处理：将S2得到的骨粉与复合酸按质量体积比g/mL为4：0.6混合，复合酸为质量比为0.2:0.07:1的芳香酸、水杨酸和酒石酸，在60℃下，摇床振荡80min，收集下层沉淀，上层为脱钙骨基质液；
S4、酶解：按照体积比为22:6将S3得到的脱钙骨基质液与复合酶在55℃、pH6下进行酶解2h，灭酶，收集水解液，复合酶为质量比为0.4:2:1.2的碱性蛋白酶葡糖化酶和β-葡萄糖苷酶；
S5、超声粉碎：S4得到的水解液进行超声粉碎10min，频率为100KHz、功率为20w，将水解液调至pH 6，在0.04MPa和27℃下超滤处理，得到胶原蛋白活性肽。
对比例2
本对比例与实施例3的区别在于，鱼骨粉未经60Co-γ射线辐射处理；
具体为鳕鱼骨胶原蛋白活性肽的制备方法，包括以下步骤：
S1、原料预处理：将鳕鱼骨洗干净后，70℃水煮20min，过滤，取鱼骨浸泡于促渗剂中，促渗剂为质量体积比g/mL为0.5:1.6:10的黑蒜多酚、薄荷醇、稀盐酸，浸泡时间20h，取出，粉碎，过150目，得到鱼骨粉；
S2、酸处理：将S1得到的鱼骨粉与复合酸按质量体积比g/mL为4：0.6混合，复合酸为质量比为0.2:0.07:1的芳香酸、水杨酸和酒石酸，在60℃下，摇床振荡80min，收集下层沉淀，上层为脱钙骨基质液；
S3、酶解：按照体积比为22:6将S2得到的脱钙骨基质液与复合酶在55℃、pH6下进行酶解2h，灭酶，收集水解液，复合酶为质量比为0.4:2:1.2的碱性蛋白酶葡糖化酶和β-葡萄糖苷酶；
S4、超声粉碎：S3得到的水解液进行超声粉碎10min，频率为100KHz、功率为20w，将水解液调至pH 6，在0.04MPa和27℃下超滤处理，得到胶原蛋白活性肽。
对比例3
本对比例与实施例3的区别在于，辐射得到的鱼骨粉未经酸处理；
具体为鳕鱼骨胶原蛋白活性肽的制备方法：包括以下步骤：
S1、原料预处理：将鳕鱼骨洗干净后，70℃水煮20min，过滤，取鱼骨浸泡于促渗剂中，促渗剂为质量体积比g/mL为0.5:1.6:10的黑蒜多酚、薄荷醇、稀盐酸，浸泡时间20h，取出，粉碎，过150目，得到鱼骨粉；
S2、辐射处理：将上述鱼骨粉经60Co-γ射线辐射处理，辐射剂量为35Gy，辐射剂量率为0.7Gy/min，辐射处理45min；
S3、酶解：按照体积比为22:6将S2得到的骨粉与复合酶在55℃、pH6下进行酶解2h，灭酶，收集水解液，复合酶为质量比为0.4:2:1.2的碱性蛋白酶葡糖化酶和β-葡萄糖苷酶；
S4、超声粉碎：S3得到的水解液进行超声粉碎10min，频率为100KHz、功率为20w，将水解液调至pH 6，在0.04MPa和27℃下超滤处理，得到胶原蛋白活性肽。
对比例4
本对比例与实施例3的区别在于，复合酶为质量比为0.1:5:0.5的碱性蛋白酶葡糖化酶和β-葡萄糖苷酶。
一、胶原蛋白含量测定
将实施例1～3和对比例1～4制得的鳕鱼骨胶原蛋白活性肽采用凯氏定氮法测定其胶原蛋白含量，将骨胶原蛋白活性肽通过体积排阻色谱测定其分子量分布，结果如下：
以上述结果可知，活性肽含量最高的为实施例3，达到88.6mg/100g，分子量小于0.5kDa的实施例组占比85.9％以上，对比例组在72.7～78.5％，分子量0.5-1.0kDa之间的实施例组占比10.6～12.3％，对比例组10.6～12.3％，分子量1.0kDa以上的实施例组占比1.6～2.6％，对比例组1.7～2.9％，说明本发明所得胶原蛋白活性肽主要在0.5kDa以下，在此分子量阶段的分子肽，能很好的被人体吸收保证肽功能性和活性。
二、骨胶原蛋白活性肽透皮性能
(1)离体小鼠皮肤制备：将小鼠脱颈椎致死后脱去背部的毛，将皮肤用生理盐水反复冲洗，去除皮下脂肪等组织，制备成直径3cm的成品保藏，
(2)用含有0.5％叠氮化钠的生理盐水将实施例1～3和对比例1～4制得的骨胶原蛋白活性肽配置成10mg/mL的溶液，在12h和24h分别取样品1mL测定其中的骨胶原蛋白活性肽累计含量，测定结果如下表：
由上表可知，本发明的骨胶原蛋白肽具有良好的透皮吸收性能，在12h和24h的累计透皮量7324.9μg和8293.8μg，具有较好的生物相容性，为制备化妆品、药品领域奠定基础。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种鳕鱼骨胶原蛋白活性肽的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
S1、原料预处理：将鳕鱼骨洗干净后，60～80℃水煮10～30min，过滤，取鱼骨浸泡于促渗剂中，浸泡时间12～24h，取出，粉碎，过120～180目，得到鱼骨粉；
S2、辐射处理：将上述鱼骨粉经60Co-γ射线辐射处理，辐射剂量为30～40Gy，辐射剂量率为0.5～0.9Gy/min，辐射处理40～50min；
S3、酸处理：将S2辐射得到的鱼骨粉与复合酸按质量体积比g/mL为2～6：0.3～0.9混合，在40～80℃下，摇床振荡60～100min，得到脱钙骨基质液；
S4、酶解：将S3得到的脱钙骨基质液与复合酶在50～60℃、pH5～8下进行酶解1～3h，灭酶，收集水解液；
S5、超声粉碎：S4得到的水解液进行超声粉碎8～12min，得到胶原蛋白活性肽。
2.如权利要求1所述的一种鳕鱼骨胶原蛋白活性肽的制备方法，其特征在于：所述S1的促渗剂为质量体积比g/mL为(0.3～0.8):(1.2～2.0):10的黑蒜多酚、薄荷醇、甘油。
3.如权利要求1所述的一种鳕鱼骨胶原蛋白活性肽的制备方法，其特征在于：所述S3复合酸为质量比为(0.1～0.3):(0.03～0.1):1的芳香酸、水杨酸和酒石酸。
4.如权利要求1所述的一种鳕鱼骨胶原蛋白活性肽的制备方法，其特征在于：所述S4复合酶为质量比为(0.3～0.5):(1～4):(0.8～1.6)的碱性蛋白酶葡糖化酶和β-葡萄糖苷酶。
5.如权利要求1所述的一种鳕鱼骨胶原蛋白活性肽的制备方法，其特征在于：所述S4脱钙骨基质液与复合酶的体积比为10～35:2～8。
6.如权利要求1所述的一种鳕鱼骨胶原蛋白活性肽的制备方法，其特征在于：所述S5超声粉碎的频率为14～100KHz、功率为10～30w。
7.如权利要求1所述的一种鳕鱼骨胶原蛋白活性肽的制备方法，其特征在于：所述S4的超滤为将超声后的水解液调至pH 6-7，在0.03～0.05MPa和23～30℃下超滤处理。
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