CN113874040A - 双层膜结构细胞器dna靶向药 - Google Patents

双层膜结构细胞器dna靶向药 Download PDF

Info

Publication number
CN113874040A
CN113874040A CN202080038136.5A CN202080038136A CN113874040A CN 113874040 A CN113874040 A CN 113874040A CN 202080038136 A CN202080038136 A CN 202080038136A CN 113874040 A CN113874040 A CN 113874040A
Authority
CN
China
Prior art keywords
dna
complex
tpp
compound
mitochondrial
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202080038136.5A
Other languages
English (en)
Inventor
永濑浩喜
渡部隆义
越川信子
安井七海
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
School legal person Shun heaven
Original Assignee
Chiba Prefectural Government
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Chiba Prefectural Government filed Critical Chiba Prefectural Government
Publication of CN113874040A publication Critical patent/CN113874040A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5076—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving cell organelles, e.g. Golgi complex, endoplasmic reticulum
    • G01N33/5079—Mitochondria
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/41—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with two or more ring hetero atoms, at least one of which being nitrogen, e.g. tetrazole
    • A61K31/4164—1,3-Diazoles
    • A61K31/4178—1,3-Diazoles not condensed 1,3-diazoles and containing further heterocyclic rings, e.g. pilocarpine, nitrofurantoin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/74—Synthetic polymeric materials
    • A61K31/785—Polymers containing nitrogen
    • A61K31/787—Polymers containing nitrogen containing heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

本发明提供一种通过双层膜结构细胞器DNA序列识别化合物和双层膜结构细胞器定位性化合物的复合物，针对包含线粒体相关疾病的病理的药剂。使双层膜结构细胞器定位性脂溶性阳离子结合于与双层膜结构细胞器DNA序列特异性结合的直链状PI聚酰胺而成的复合物、以包含该复合物的线粒体DNA突变或者多态性为靶向的直链状PI聚酰胺‑TPP复合物及包含该复合物的医药组合物。

Description

双层膜结构细胞器DNA靶向药
技术领域
本发明涉及一种以双层膜结构细胞器DNA为靶向的低分子量化合物的复合物。
背景技术
脂溶性阳离子等作为向线粒体或叶绿体等双层膜结构细胞器递送药剂的技术而被开发(非专利文献1)，尝试将其应用于线粒体相关疾病的治疗(专利文献2～5)。另一方面，还确认到线粒体DNA的基因突变不仅在线粒体病中积累，而且在生活方式相关疾病或癌变部位中有积累。还报告了通过靶向线粒体DNA序列可以调节线粒体基因的转录(非专利文献2)，还报告了有可能通过发卡型吡咯-咪唑聚酰胺(PIP)能够以病因性线粒体DNA序列为靶向，减少具有病性基因序列的线粒体数量(专利文献1)。但是，尚未建立有效诱导具有突变线粒体DNA的细胞的生理活性的方法。
线粒体病的大部分的发病是由于线粒体DNA具有病性突变，其拷贝数量的增加。另外，还报告了线粒体DNA中具有病因性突变的细胞增加而引发生活方式相关疾病等各种疾病的发病。而且，报告了许多病例，在癌细胞中，线粒体DNA具有突变，该突变为同型异源性(全部由突变线粒体DNA替代的状态)(非专利文献3)。对于这些线粒体DNA具有病性突变的病理，尚未开发出直接以线粒体DNA突变为靶向的治疗法。
本发明人等识别到线粒体DNA的突变，对长期存留于线粒体、在线粒体DNA中具有特异性突变的细胞引起生理活性的化合物的探索研究进行深入研究，发现经由连接部分结合线粒体渗透性化合物和低分子的直链状DNA小沟结合化合物而成的复合物对具有特异性线粒体DNA序列的细胞具有高效的生理活性，从而完成了本发明。而且，虽然报告了有可能脂溶性阳离子复合物会影响植物细胞，也能渗透到叶绿体中(非专利文献4、5)，但实际上尚未明确以双层膜结构细胞器DNA为靶向的低分子量化合物的复合物能够渗透到植物的根或叶的活细胞内，但也明确了能够确认可应用于植物。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：国际公开第WO2012/133896号
专利文献2：国际公开第WO2011/150494号
专利文献3：日本特表2011-501731
专利文献4：日本特表2016-523926
专利文献5：国际公开第CN2008/801154230号
非专利文献
非专利文献1：Chem Rev.2017 117(15)10043-10120
非专利文献2：J.Am.Chem.Soc.,2017,139(25)8444-8447
非专利文献3：Sci Rep.2017 Nov 14；7(1):15535.
非专利文献4：Plant Physiol.(1983)73,169-174
非专利文献5：Mitochondrion(2019)46,164-171 Available online May 012018
发明内容
发明所要解决的技术问题
线粒体DNA突变相关病变
线粒体存在于包含植物的高等生物，人线粒体DNA具有B-DNA双螺旋结构，编码37个基因，其中13为结构基因，编码呼吸链复合物I、III、IV、V的亚单位，参与呼吸链激活、ATP生产、活性氧的产生，其DNA突变与各种病理相关。线粒体在一个细胞内存在有几千个，线粒体DNA也存在有几千拷贝，虽然大多包含具有DNA突变的DNA，但通过拷贝数达到一定以上，会诱发线粒体的功能异常，从而与线粒体病或衰老、生活方式相关疾病、癌症等疾病有关。也报告了尤其在癌症中，几乎全部会有被称为同型异源性的线粒体DNA突变的现象。
线粒体靶向化合物
为了治疗与线粒体有关的病理，尝试开发以线粒体为靶向的各种化合物，但尚未开发出以突变线粒体DNA为靶向的根本性治疗法。为了将药物递送至线粒体，开发了一种利用了原生质膜电位差和线粒体双层膜的电位的由脂溶性阳离子递送化合物的技术，并且报告了在线粒体基质中积累处理浓度的100～500倍。
DNA小沟结合化合物
已知在放线菌等产生的抗生素中存在序列特异性地识别DNA的小沟的化合物。研究了应用该序列识别机构来识别双链B-DNA的发卡型PI聚酰胺，确认到向核内和线粒体内的递送，启示了通过与核内DNA或线粒体DNA结合，对基因组结构等产生影响，有可能能将其用于疾病治疗。虽然报告了发卡型PI聚酰胺或偏端霉素等直链DNA结合化合物的一部分被递送至线粒体而不是核内，但报告出以下启示，即长期不会存留而是转移至ER或高尔基体，线粒体无法显示出长时间生物活性，发明人也进行了确认(Bioorganic&MedicinalChemistry Letters 11(2001)769-772)。
线粒体靶向化合物和发卡型吡咯-咪唑聚酰胺(PIP)复合物
报告了以线粒体为靶向的线粒体渗透性肽Mitochondria penetrating peptide(MPP)和线粒体DNA靶向发卡型吡咯-咪唑聚酰胺化合物的复合物存留于线粒体，能够调节线粒体基因的表达，本发明人也报告了使用作为脂溶性阳离子的三苯基鏻(TPP)来递送发卡型吡咯-咪唑聚酰胺(PIP)，虽然突变线粒体DNA的拷贝数在统计上不显著但减少的倾向。但是，发卡型PIP由于分子量大且合成工序复杂，未必适合于药剂开发。
用于解决问题的技术方案
在本发明中，为了开发对线粒体DNA突变更有效且更适当的候选药剂而进行了深入努力，发现使直链状序列识别DNA小沟结合化合物与脂溶性阳离子结合而成的复合物相比与发卡型PI聚酰胺的复合物，能够减少合成反应步骤数，并且能够将分子量减半，而且在具有线粒体DNA突变的细胞中能够诱导线粒体的自噬(mitophagy)，增加线粒体DNA拷贝数，减少突变线粒体DNA拷贝数，并且在突变线粒体DNA为同型异源性或者其拷贝数较多的细胞中能够诱导细胞死亡。由此可知，通过本发明可以合成更适于药剂开发的、有效地得到生物活性的化合物，从而完成了本发明。而且，还确认到存在抗细胞死亡的细胞，通过对该抗细胞死亡的细胞施用细胞死亡抑制因子抑制剂等能够诱导细胞死亡。另外，通过确认到向植物的根、叶的活细胞内的递送，也可以期待对植物等具有细胞壁的生物的效果。
即，本发明如以下所示。
[1]一种复合物，是与双层膜结构细胞器DNA的序列特异性结合的直链状DNA结合化合物和双层膜结构细胞器定位性化合物的复合物。
[2]根据[1]的复合物，复合物聚集于作为双层膜结构细胞器的线粒体，对双层膜结构细胞器DNA序列特异性地改变双层膜结构细胞器的功能。
[3]根据[1]或[2]的复合物，双层膜结构细胞器DNA序列为选自由线粒体或者叶绿体DNA序列、线粒体病病因突变DNA序列、线粒体相关疾病突变DNA序列、包含线粒体DNA多态性的病变细胞中的拷贝数比正常细胞多的序列以及基因数据库中登录的双层膜结构细胞器DNA序列组成的组的至少一个以上。
[4]根据[1]～[3]中任一项的复合物，DNA结合化合物选自由桥核酸(交联化核酸)、锁核酸(LNA)、PNA、直链状吡咯-咪唑聚酰胺(PIP)、直链状吡咯-咪唑聚酰胺(PIP)修饰物、DNA结合蛋白质以及DNA结合蛋白质复合物组成的组。
[5]根据[1]～[4]中任一项的复合物，双层膜结构细胞器定位性化合物为脂溶性阳离子。
[6]根据[5]的复合物，脂溶性阳离子为TPP(三苯基鏻)。
[7]一种识别线粒体DNA突变以及多态性的序列特异性线粒体DNA聚集性化合物，其包含[1]～[6]中任一项的复合物。
[8]根据[1]的复合物，由下式(I)所示：
[化学式1]
Figure BDA0003368516430000051
[X为-CH2-、-NH-、-CO-、-CH2CH2O-或-O-，
Y为-CH-或-N-，
R1为-CH3、-OH、标记物(荧光、放射性、生物素、点击化学标记等)或TP(作为双层膜结构细胞器定位性化合物的线粒体渗透部位)，
R2为分别独立的-CH3、-NH2、标记物或TP，
j为1至6，
K为1至2，
l为1至4，
m为0至10，
n为0至6，
o为0至6]。
[9]根据[8]所述的复合物，由下式(II)所示：
[化学式2]
Figure BDA0003368516430000061
[X为-CH2-、-NH-、-CO-、-CH2CH2O-或-O-，
Y为-CH-或-N-，
R1为-CH3、-OH、标记物或TP，
R2为分别独立的-CH3、-NH2、标记物或TP]。
[10]根据[8]或[9]的复合物，所述复合物具有由下式(III)或(IV)所示的结构：
[化学式3]
Figure BDA0003368516430000062
或者
[化学式4]
Figure BDA0003368516430000063
[Y为-CH-或-N-，
R1为-CH3、-OH、标记物或TP，
R2分别独立地为-CH3、-NH2、标记物或TP]。
[11]根据[8]或[9]的复合物，所述复合物具有由下式(XIV)所示的结构：
[化学式5]
Figure BDA0003368516430000071
[12]根据[8]或[9]的复合物，所述复合物具有由下式(XV)～(XXI)中任一项所示的结构：
[化学式6]
Figure BDA0003368516430000072
[化学式7]
Figure BDA0003368516430000073
[化学式8]
Figure BDA0003368516430000081
[化学式9]
Figure BDA0003368516430000082
[化学式10]
Figure BDA0003368516430000083
[化学式11]
Figure BDA0003368516430000084
[化学式12]
Figure BDA0003368516430000091
[13]根据[8]或[9]的复合物，所述复合物具有由下式(XXII)或(XXIII)所示的结构：
[化学式13]
Figure BDA0003368516430000092
[化学式14]
Figure BDA0003368516430000093
[14]一种与线粒体疾病相关线粒体DNA序列结合的组合物，其包含[8]～[13]中任一项的复合物。
[15]一种医药组合物，其包含[1]～[6]和[8]～[13]中任一项的复合物。
[16]根据[15]的医药组合物，医药组合物为抗癌剂。
[17]一种试剂盒，其包含[1]～[6]和[8]～[13]中任一项的复合物。
[18]一种研究试剂试剂盒，其包含[1]～[6]和[8]～[13]中任一项的复合物。
[19]一种治疗用试剂盒，其包含[1]～[6]和[8]～[13]中任一项的复合物。
[20]一种诊断用试剂盒，其包含[1]～[6]和[8]～[13]中任一项的复合物。
[21]一种试剂盒，其由[15]或[16]的医药组合物和细胞清除剂组合而成。
[22]根据[21]的试剂盒，细胞清除剂选自由Canagliflozin(卡格列净)、Canagliflozin(卡格列净)、Ipragliflozin(依格列净)、Dapagliflozin(达格列净)、Luseogliflozin(鲁格列净)、Tofogliflozin(托格列净)、Sergliflozin etabonate(舍格列净依他泊酯)、Remogliflozin etabonate(雷莫列净依他泊酯)、Ertugliflozin(艾格列净)、sotagliflozin(索格列净)、Dasatinib(达沙替尼)、Quercetin(槲皮素)、Navitoclax(那维克拉)(ABT-263)、ABT-737、A1331852、A1155463、17-(Allylamino)-17-demethoxygeldanamycin(17-(丙烯胺基)-17去甲氧基格尔德霉素)、Fisetin(漆黄素)、Panobinostat(帕比司他)、Azithromycin(阿奇霉素)、Roxithromycine(罗红霉素)、Piperlongumine(荜茇酰胺)、Hyperoside(Quercetin 3-galactoside)(金丝桃甙(槲皮素-3-半乳糖甙))、2,3,5-Trichloro-6-(2-piperidin-1-yl-1,3-thiazol-5-yl)cyclohexa-2,5-diene-1,4-dione(2,3,5-三氯-6-(2-哌啶-1-基-1,3-噻唑-5-基)环己-2,5-二烯-1,4-二酮)、2,5-Dichloro-3-(1-piperidinyl)-6-[2-(1-piperidinyl)-1,3-thiazol-5-yl]benzo-1,4-quinone(2,5-二氯-3-(1-哌啶基)-6-[2-(1-哌啶基)-1,3-噻唑-5-基]苯并-1,4-醌)、2,5-Dichloro-3-morpholin-4-yl-6-(2-piperidin-1-yl-1,3-thiazol-5-yl)cyclohexa-2,5-diene-1,4-dione(2,5-二氯-3-吗啉-4-基-6-(2-哌啶-1-基-1,3-噻唑-5-基)环己-2,5-二烯-1,4-二酮)、2,5-Dichloro-3-(phenylamino)-6-(2-piperidin-1-yl-1,3-thiazol-5-yl)cyclohexa-2,5-diene-1,4-dione(2,5-二氯-3-(苯胺基)-6-(2-哌啶-1-基-1,3-噻唑-5-基)环己-2,5-二烯-1,4-二酮)、2,5-Dichloro-3-(2-morpholin-4-yl-1,3-thiazol-5-yl)-6-piperidin-1-ylcyclohexa-2,5-diene-1,4-dione(2,5-二氯-3-(2-吗啉-4-基-1,3-噻唑-5-基)-6-哌啶-1-基-环己-2,5-二烯-1,4-二酮)、Obatoclax(奥巴克拉)、Venetoclax(维奈妥拉)、2,5-dichloro-3-(4-methyl-1-piperazinyl)-6-[2-(1-piperidinyl)-1,3-thiazol-5-yl]benzo-1,4-quinone(2,5-二氯-3-(4-甲基-1-哌嗪基-6-[2-(1-哌啶基)-1,3-噻唑-5-基]苯并-1,4-醌)以及它们的任一衍生物组成的组。
[23]根据[15]或[16]的医药组合物，其用于与细胞清除剂组合使用。
[24]根据[23]的医药组合物，细胞清除剂选自由Canagliflozin(卡格列净)、Canagliflozin(卡格列净)、Ipragliflozin(依格列净)、Dapagliflozin(达格列净)、Luseogliflozin(鲁格列净)、Tofogliflozin(托格列净)、Sergliflozin etabonate(舍格列净依他泊酯)、Remogliflozin etabonate(雷莫列净依他泊酯)、Ertugliflozin(艾格列净)、sotagliflozin(索格列净)、Dasatinib(达沙替尼)、Quercetin(槲皮素)、Navitoclax(那维克拉)(ABT-263)、ABT-737、A1331852、A1155463、17-(Allylamino)-17-demethoxygeldanamycin(17-(丙烯胺)-17去甲氧基格尔德霉素)、Fisetin(漆黄素)、Panobinostat(帕比司他)、Azithromycin(阿奇霉素)、Roxithromycine(罗红霉素)、Piperlongumine(荜茇酰胺)、Hyperoside(Quercetin 3-galactoside)(金丝桃甙(槲皮素-3-半乳糖甙))、2,3,5-Trichloro-6-(2-piperidin-1-yl-1,3-thiazol-5-yl)cyclohexa-2,5-diene-1,4-dione(2,3,5-三氯-6-(2-哌啶-1-基-1,3-噻唑-5-基)环己-2,5-二烯-1,4-二酮)、2,5-Dichloro-3-(1-piperidinyl)-6-[2-(1-piperidinyl)-1,3-thiazol-5-yl]benzo-1,4-quinone(2,5-二氯-3-(1-哌啶基)-6-[2-(1-哌啶基)-1,3-噻唑-5-基]苯并-1,4-醌)、2,5-Dichloro-3-morpholin-4-yl-6-(2-piperidin-1-yl-1,3-thiazol-5-yl)cyclohexa-2,5-diene-1,4-dione(2,5-二氯-3-吗啉-4-基-6-(2-哌啶-1-基-1,3-噻唑-5-基)环己-2,5-二烯-1,4-二酮)、2,5-Dichloro-3-(phenylamino)-6-(2-piperidin-1-yl-1,3-thiazol-5-yl)cyclohexa-2,5-diene-1,4-dione(2,5-二氯-3-(苯胺基)-6-(2-哌啶-1-基-1,3-噻唑-5-基)环己-2,5-二烯-1,4-二酮)、2,5-Dichloro-3-(2-morpholin-4-yl-1,3-thiazol-5-yl)-6-piperidin-1-ylcyclohexa-2,5-diene-1,4-dione(2,5-二氯-3-(2-吗啉-4-基-1,3-噻唑-5-基)-6-哌啶-1-基-环己-2,5-二烯-1,4-二酮)、Obatoclax(奥巴克拉)、Venetoclax(维奈妥拉)、2,5-dichloro-3-(4-methyl-1-piperazinyl)-6-[2-(1-piperidinyl)-1,3-thiazol-5-yl]benzo-1,4-quinone(2,5-二氯-3-(4-甲基-1-哌嗪基-6-[2-(1-哌啶基)-1,3-噻唑-5-基]苯并-1,4-醌)、Nutlin-3、MI-63以及它们的任一衍生物组成的组。
[25]一种存留于线粒体且与线粒体DNA序列特异性结合的复合物的制造方法，其包括：(1)以与线粒体DNA序列特异性结合的方式设计DNA结合化合物的工序；以及
(2)使所设计的所述DNA结合化合物与脂溶性阳离子结合的工序。
[26]根据[25]的制造方法，线粒体DNA序列为选自由线粒体病病因突变DNA序列、线粒体相关疾病突变DNA序列、包含线粒体多态性的病理细胞中的DNA拷贝数比正常细胞多的序列以及基因数据库中登录的线粒体相关分子组成的组的至少一个。
[27]根据[25]或[26]的制造方法，DNA结合化合物选自由桥核酸(交联化核酸)、锁核酸(LNA)、PNA、直链状吡咯-咪唑聚酰胺(PIP)、直链状吡咯-咪唑聚酰胺(PIP)修饰物、DNA结合蛋白质以及DNA结合蛋白质复合物组成的组。
[28]根据[25]～[27]中任一项的复合物的制造方法，双层膜结构细胞器定位性化合物为具有与双层膜结构细胞器DNA的特定的碱基序列结合的官能团的化合物。
[29]根据[28]的制造方法，双层膜结构细胞器定位性化合物为TPP(三苯基鏻)。
另外，本发明如以下所示。
(1)一种复合物，为直链状DNA结合化合物和脂溶性阳离子的复合物，所述直链状DNA结合化合物与线粒体等双层膜结构细胞器DNA序列特异性结合。
(2)根据(1)所述的复合物，其用于与线粒体等双层膜结构细胞器功能异常相关的DNA序列结合，给双层膜结构细胞器具有结合DNA序列的细胞带来生物活性。
(3)根据(1)或(2)所述的复合物，双层膜结构细胞器DNA序列与被识别为选自线粒体功能下降、ROS产生等线粒体病、脑神经系统疾病、循环器官系统疾病、糖尿病、肾病、肌肉疾病、听觉迟钝等耳鼻喉科疾病、视网膜病等眼科疾病、癌症以及基因数据库中登录的线粒体相关疾病组的至少一个以上的多态性或者突变结合。
(4)根据(1)～(3)中任一项所述的复合物，直链状DNA结合化合物为选自由桥核酸(交联化核酸)、锁核酸(LNA)、PNA、DNA小沟结合抗生素、吡咯-咪唑聚酰胺(PIP)、吡咯-咪唑聚酰胺(PIP)修饰物、DNA结合蛋白质以及DNA结合蛋白质复合物组成的组。
(5)根据(1)～(4)中任一项所述的复合物，脂溶性阳离子为具有利用原生质膜电位差和线粒体双层膜的电位可递送至线粒体基质内的官能团的化合物。
(6)根据(5)所述的复合物，脂溶性阳离子为TPP。
(7)一种能够与线粒体相关疾病特异性序列结合的直链状DNA结合化合物和脂溶性阳离子的复合物，其包含(1)～(6)中任一项所述的复合物。
(8)根据(1)和(2)所述的复合物，其由下式(V)或(VI)所示。
[化学式15]
Figure BDA0003368516430000141
或者
[化学式16]
Figure BDA0003368516430000142
(9)一种能够与线粒体相关疾病特异性序列结合的直链状DNA结合化合物和脂溶性阳离子的复合物，其包含(8)所述的复合物。
(10)一种能够与线粒体呼吸链基因、序列结合的直链状DNA结合化合物和脂溶性阳离子的复合物，其包含(8)所述的复合物。
(11)一种医药组合物，其包含(1)～(6)、(8)～(10)中任一项所述的复合物。
(12)根据(11)所述的医药组合物，医药组合物为抗癌剂。
(13)一种试剂盒，其包含(1)～(6)、(8)～(10)中任一项所述的复合物。
(14)一种研究试剂试剂盒，其包含(1)～(6)、(8)～(10)中任一项所述的复合物。
(15)一种治疗用试剂盒，其包含(1)～(6)、(8)～(10)中任一项所述的复合物。
(16)一种与线粒体等双层膜结构细胞器DNA序列特异性结合的复合物的制造方法，其包括：(1)设计与线粒体等双层膜结构细胞器DNA序列特异性结合的直链状DNA结合化合物的工序；
(2)使所设计的DNA结合化合物与脂溶性阳离子结合的工序。
(17)根据(16)所述的制造方法，基因序列为线粒体相关疾病病因突变序列。
(18)根据(16)或(17)所述的制造方法，DNA结合化合物选自由桥核酸(交联化核酸)、锁核酸(LNA)、PNA、吡咯-咪唑聚酰胺(PIP)、吡咯-咪唑聚酰胺(PIP)修饰物或DNA结合蛋白质、以及DNA结合蛋白质复合物组成的组。
(19)根据(16)～(18)中任一项所述的制造方法，脂溶性阳离子为具有利用原生质膜电位差和线粒体双层膜的电位可递送至线粒体基质等双层膜结构细胞器内的官能团的化合物。
(20)根据(19)所述的制造方法，脂溶性阳离子为TPP。
本说明书包含作为本申请的优先权基础的日本专利申请号2019-053528中公开的内容。
发明效果
根据本发明，提供一种与线粒体等双层膜结构细胞器DNA序列结合，且能够修饰线粒体等双层膜结构细胞器功能的复合物。根据本发明的优选方式，本发明的复合物能够用作医药组合物、抗线粒体病剂，抗生活方式相关疾病剂、抗癌剂、抗衰老剂、抗生素等。
根据本发明的复合物，可以认为通过识别线粒体DNA序列，能够诱发线粒体DNA的复制、转录、以及线粒体的自噬(mitophagy)、由自动控制线粒体自噬而实现的线粒体激活/线粒体DNA拷贝数的增减、以及突变线粒体DNA为同型异源性或者接近于同型异源性的状态下细胞死亡或者细胞衰老的诱导。通过这些现象，能够容易地想到创建出本发明的复合物能够在包含具有线粒体等双层膜结构细胞器的动植物的真核生物、生物体细胞以及实验系统中调节线粒体等的功能的各种方式。
即，本发明提供一种将与线粒体等基因组序列结合的低分子化合物递送至线粒体等的技术及其设计/合成方法，通过应用该技术，能够更简单地依次设计/合成能够特异性识别具有病态或者不良线粒体的DNA突变序列的线粒体相关疾病治疗药。相对于针对已知线粒体病的治疗药物或者显示功能性的食品、特定保健用食品停留于对症性地预防/治疗的情况，能够容易地预想到本发明的复合物能够提供一种显示出根本性预防/治疗效果的化合物。而且，可以认为能够应用于细胞治疗或正常线粒体递送技术，并且也能够应用于诊断和清除具有突变线粒体DNA的不良线粒体或不良细胞的质量控制等广泛的用途。
本发明的复合物在突变线粒体DNA拷贝数较多的细胞中诱导细胞死亡。另一方面，能够开发出一种作为理想的治疗药的全新的治疗药，在正常线粒体DNA相对于突变线粒体DNA的比率为一定数量以上的情况下，通过逐渐减少突变线粒体DNA的拷贝数以及在突变线粒体DNA减少的同时促进总线粒体数的增加/激活，从而在使对细胞或生物体造成的影响为最小限的基础上减少突变线粒体DNA。今后，期待推进本发明的复合物开始面向临床试验的开发研究(物性试验、安全性试验、药代动力学、以GMP大量合成)。另外，根据应用本发明的方法，可以想到能够开发出实现相同或者叠加/协同的效果的进一步全新的治疗药。
本发明的复合物在突变线粒体DNA拷贝数较多的细胞中诱导细胞死亡，但存在有抗细胞死亡的细胞，确认到衰老样的变化。近年来，在抗衰老研究中进行了senolyticdrugs衰老细胞清除剂的研究，尝试了对衰老细胞的细胞死亡诱导有效的BCL2、BCL-XL、BCL-W、MDM2等抑制剂的临床应用，本发明的复合物能够诱导细胞衰老样细胞，通过与衰老细胞清除剂的治疗的组合使用，实现增强衰老细胞清除剂的效果的合成致死效果，由此可以想到能够开发出一种进一步全新的另一治疗法等。
在后面说明衰老细胞清除剂。
本发明的复合物由于线粒体基因组小至16569碱基对，因此能够使复合物的DNA小沟识别部位短小化，即使为分子量小的单链型化合物也能够确认到效果，并且能够确认到皮肤渗透性。可以想到通过使本发明的方法与透皮吸收型制剂化组合能够扩大施用路径，并且能够开发出一种由局部治疗效果的增强实现的定位性病变或衰老的局部治疗药、预防药这样的全新的治疗法。
附图说明
图1-1是表示以MELAS的线粒体DNA A3243G突变为靶向的FITC标记发卡型聚酰胺(CCC0018-FITC)的化学结构的图。
图1-2是表示以MELAS的线粒体DNA A3243G突变为靶向的FITC标记发卡型聚酰胺(CCC0018-FITC)的经时性细胞内定位的图。
图2是表示吡啶鎓吲哚TPP复合物的线粒体定位的图。图2的A表示吡啶鎓吲哚TPP复合物的与线粒体的共定位，图2的B表示吡啶鎓吲哚的线粒体非共定位。
图3是表示以MELAS的线粒体DNA A3243G突变为靶向的发卡型聚酰胺与TPP复合物(CCC019-TPP)合成流程和其结构以及HPLC、质量分析结果的图。
图4是表示CCC019-TPP的与线粒体的共定位的图。
图5是表示向HeLa(3243G Low)胞质杂种施用CCC019-TPP实验中的总线粒体DNA拷贝数增加的结果的图。图5的A表示48天后的结果，图5的B表示63天后的结果。
图6是表示向HeLa(3243G Low)细胞施用CCC019-TPP实验中的正常线粒体DNA拷贝数相对于突变线粒体拷贝数的比率增加的结果的图。图6的A表示48天后的结果，图6的B表示63天后的结果。
图7是表示向HeLa(3243G High)细胞和HeEB1细胞施用CCC018-TPP实验中的显示线粒体自噬的mitophagy(LC3阳性)被诱导的结果的图。
图8是表示以MELAS的线粒体DNA A3243G突变为靶向的直链型聚酰胺与TPP复合物(CCC020-TPP)合成流程和其结构以及HPLC、质量分析结果的图。
图9表示CCC020-TPP的与线粒体的共定位的图。
图10是表示对通过WST分析来研究向HeLamtHeLa细胞(图10的A)、HeLa(3243GLow)细胞(图10的B)和HeLa(3243G High)细胞(图10的C)施用CCC020-TPP抑制细胞增殖的结果标记IC50值的图。
图11-1是用柱形图以核的凝集、片段化和裂解胱天蛋白酶3(Cleaved Caspase 3)的显示凋亡的细胞的比率表示向HeLa(3243G High)细胞施用CCC020-TPP诱导细胞死亡(凋亡)的图。
图11-2用核的凝集、片段化和Cleaved Caspase 3的染色图像表示向HeLa(3243GHigh)细胞施用CCC020-TPP诱导细胞死亡(凋亡)的图。
图12是表示通过向HeLamtHeLa细胞和HeLa(3243G High)细胞施用CCC020-TPP在HeLa(3243G High)细胞中显著确认到作为细胞周期抑制剂的p21的表达上升(图12的A)、作为促凋亡相关基因的Bax的表达上升(图12的B)、作为抑制凋亡相关基因的Mcl1的表达减少(图12的C)的图。
图13是表示以在A549细胞中确认的非同义替代A14582G多态性为靶向的直链型聚酰胺和TPP复合物(CCC021-TPP)的结构以及HPLC、质量分析结果的图。
图14是表示通过WST分析来研究向A549细胞(图14的A)和PC14细胞(图14的B)施用CCC021-TPP抑制细胞增殖的结果的图。
图15是表示研究向A549细胞(图15的A)和PC14细胞(图15的B)长期施用CCC021-TPP或者DMSO实现的细胞增殖的结果的图。在A549细胞中施用CCC021-TPP显著抑制了增殖。
图16是表示对施用CCC021-TPP24小时后的细胞内定位用抗TPP抗体和线粒体荧光针染色的线粒体定位的研究的结果的图。A表示抗TPP抗体染色的结果，B表示线粒体荧光针染色的结果。
图17是表示虽然CCC021-TPP抑制了A549细胞的增殖，但显示出未诱导细胞死亡而诱导了衰老细胞样的形态变化的MTT分析的结果的图。A表示A549的结果，B表示PC14的结果。C表示A549和PC14的IC50。
图18是表示施用CCC021-TPP5天后的PC14细胞(A)和A549细胞(B)的细胞形态的图。C为B的框内的放大图。
图19是表示施用CCC021-TPP5天后的PC14细胞和A549细胞的台盼蓝分析的结果的图。
图20是通过SA-β-Gal染色表示在对A549细胞(A)和PC14细胞(B)进行CCC021-TPP处理的情况下诱导SA-β-Gal(伴细胞衰老的β半乳糖苷酶)表达的图。
图21是表示通过SA-β-Gal染色而对所染色的细胞数进行计数并定量化的结果的图。
图22是表示在对A549细胞和PC14细胞进行CCC021-TPP处理的情况下伴细胞衰老的分泌现象的情况。A表示IL-1A的分泌，B表示IL-1B的分泌，C表示IL-6的分泌，D表示IL-8的分泌。
图23是表示在对A549细胞(A)和PC14细胞(B)进行CCC021-TPP处理的情况下诱导自噬的图。
图24是表示通过CCC021-TPP处理，在A549细胞的线粒体中引起特异性自噬的图。
图25是表示施用CCC021-TPP24小时后在A549细胞中产生的活性氧(ROS)显著增强的图。
图26是表示进行了CCC021-TPP处理的A549细胞和PC14细胞中的BCL2L1(A)、BAX(B)、BCL2(C)和BIRC5(D)的表达水平的图。
图27是表示CCC021-TPP单独处理、ABT-263单独处理以及组合使用它们的处理的情况下第2天和第4天的细胞形态的图。
图28是表示皮肤渗透性确认实验的方法的概要(A)和向小鼠施用的部位(B)的图。
图29是表示单链型PIP-TPP(CCC149-TPP)的结构式的图。
图30是表示CCC149-TPP的HPLC(A)和质量分析(B)的结果的图。
图31是表示PIP-TPP的皮肤渗透性的图。
图32是表示Dp-Py-Py-TPP的合成方法的图。
图33-1是表示库化合物、2环状结构化合物至8环状化合物的图(其一)。
图33-2是表示库化合物、2环状结构化合物至8环状化合物的图(其二)。
图33-3是表示库化合物、2环状结构化合物至8环状化合物的图(其三)。
图33-4是表示库化合物、2环状结构化合物至8环状化合物的图(其四)。
图33-5是表示库化合物、2环状结构化合物至8环状化合物的图(其五)。
图33-6是表示库化合物、2环状结构化合物至8环状化合物的图(其六)。
图34是表示所合成的2环状结构化合物CCC102-TPP的结构的图。
图35是表示CCC102-TPP的高效液相色谱(A)和质量分析(B)的结果的图。
图36是表示所合成的3环状结构化合物CCC106-TPP的结构的图。
图37是表示CCC106-TPP的高效液相色谱(A)和质量分析(B)的结果的图。
图38是表示所合成的4环状结构化合物CCC114-TPP的结构的图。
图39是表示CCC114-TPP的高效液相色谱(A)和质量分析(B)的结果的图。
图40是表示所合成的5环状结构化合物CCC175-TPP的结构的图。
图41是表示CCC175-TPP的高效液相色谱(A)和质量分析(B)的结果的图。
图42是表示所合成的6环状结构化合物CCC206-TPP的结构的图。
图43是表示CCC206-TPP的高效液相色谱(A)和质量分析(B)的结果的图。
图44是表示所合成的7环状结构化合物CCC1283-TPP的结构的图。
图45是表示CCC1283-TPP的高效液相色谱(A)和质量分析(B)的结果的图。
图46是表示所合成的8环状结构化合物CCC1394-TPP的结构的图。
图47是表示CCC1394-TPP的高效液相色谱(A)和质量分析(B)的结果的图。
图48是表示CCC1283-TPP(直链型PIP)对HeLa细胞(A)和C33A(B)抑制增殖的图。
图49是表示10环状结构化合物CCC531-TPP的结构的图。
图50是表示CCCh531-TPP的高效液相色谱分析(A)和质量分析(B)的结果的图。
图51是表示CCCh531-TPP对HeLa细胞(A)和C33A(B)抑制增殖的图。
图52是表示10环状结构化合物CCCh560-TPP的结构的图。
图53是表示CCCh560-TPP的高效液相色谱分析(A)和质量分析(B)的结果的图。
图54是表示CCCh560-TPP对C33A(A)、HeLa细胞(B)、HDF(C)、Siha(D)、Caski(E)和ME180(F)抑制增殖的图。
图55-1是表示代表性衰老细胞清除剂的图(其一)。
图55-2是表示代表性衰老细胞清除剂的图(其二)。
图55-3是表示代表性衰老细胞清除剂的图(其三)。
图55-4是表示代表性衰老细胞清除剂的图(其四)。
图55-5是表示代表性衰老细胞清除剂的图(其五)。
图55-6是表示代表性衰老细胞清除剂的图(其六)。
图55-7是表示代表性衰老细胞清除剂的图(其七)。
图55-8是表示代表性衰老细胞清除剂的图(其八)。
图55-9是表示代表性衰老细胞清除剂的图(其九)。
图55-10是表示代表性衰老细胞清除剂的图(其十)。
图55-11是表示代表性衰老细胞清除剂的图(其十一)。
图56是表示作为BCL-XL抑制剂的A1155463与CCC021-TPP组合使用处理的情况下的细胞的形态的图。
图57是表示FITC-CCC105-TPP的结构式的图。
图58是表示FITC-CCC105-TPP的高效液相色谱分析(A)和质量分析(B)的结果的图。
图59是表示植物活细胞渗透实验的结果的图，A表示位于主根的FITC荧光，B表示发芽后4天的根的荧光图像。
图60是表示对H2B(组蛋白H2B)-GFP表达拟南芥的叶进行FITC-CCC105-TPP处理的情况下的、位于叶的基于H2B的GFP荧光(A)和基于CCC105-TPP的FITC的荧光(B)的图。
具体实施方式
以下，详细地说明本发明。
本发明提供一种结合于线粒体等双层膜结构细胞器的DNA的特异性序列的DNA结合化合物和双层膜结构细胞器定位性的化合物的复合物及其设计和合成方法。通过该复合物作用于线粒体等双层膜结构细胞器的DNA，由具有对双层膜结构细胞器的功能进行改变等的特异性序列的线粒体等双层膜结构细胞器的拷贝数的减少、线粒体等双层膜结构细胞器的功能不全实现细胞死亡的诱导等，从而能够进行线粒体等双层膜结构细胞器的相关病理的预防、治疗、诊断。
双层膜结构细胞器除了线粒体以外还包含叶绿体等。
作为双层膜结构细胞器的DNA的特异性序列，可列举出线粒体DNA序列、线粒体病病因突变DNA序列、线粒体相关疾病突变DNA序列、包含线粒体DNA多态性的病变细胞中的DNA拷贝数比正常细胞多的序列、以及基因数据库中登录的双层膜结构细胞器DNA序列等。
线粒体DNA源自于母体且每1个细胞存在有几百至几千拷贝，由于定位于不存在核膜那样的防御机构的细胞质内小器官，因此由于作为内在因素的活性氧源(ROS)、作为外在因素的致癌物或放射线等，发生突变的频率较高。而且，存在几千拷贝的线粒体DNA被随机复制，按照概率法则会不等分配给子细胞，因此当产生突变型线粒体DNA时，具有与正常型线粒体DNA混合存在的、成为异序性的状态的特性。因此，即使母细胞具有正常型线粒体DNA和突变型线粒体DNA两者，有时也会产生在细胞分裂出的子细胞中仅存在其中一方的类型的同型异源性。这样，不良线粒体的拷贝数增加的体细胞成为使个体产生各种病理的因素。
线粒体病主要以特征性中枢神经症状为基准进行诊断，并以骨骼肌、心脏为代表一直到内分泌腺，会引起身体的各脏器异常(http://www.nanbyou.or.jp/entry/335)。在作为代表性线粒体病的MELAS(mitochondrial encephalomyopathy,lactic acidosis,andstroke-like episodes)(Nature,348(6302):651-3,1990)中，由线粒体DNA(mtDNA)编码的亮氨酸的tRNA(MT-TL1)基因中的第3243位的碱基从腺嘌呤残基点突变为鸟嘌呤残基的A3243G突变被特定为最多的突变型。被称为线粒体脑肌病伴高乳酸血症脑卒中样综合症的该疾病在线粒体病态中的患者数最多。另外，已知A3243G突变也为引起线粒体糖尿病的突变型，尤其有报告称在日本人的糖尿病患者约700万人中的约1％发现到A3243G突变(Natgenet.1(5):368-71,1992,N Engl J Med.330(14):962-8,1994)。A3243G突变会引起tRNA的亮氨酸突变，引起牛磺酸修饰的缺失。而且，呼吸链复合物I的功能下降，陷入线粒体功能不全(Am J Hum Genet.49(3):590-9,1991)。在MELAS中，如上所述，已知牛磺酸被认可为医药品，通过牛磺酸的大量摄取可观察到症状的改善，但在线粒体病中脏器间正常型mtDNA与突变型mtDNA的比率不同，其比率之差为疾病的重症度或症状的决定因素(Proc Natl AcadSci USA,88(23):10614-8,1991)，因此期待开发出一种作为根本性治疗法的使突变型mtDNA的比率减少的治疗法。
另外，癌症与线粒体异常的相关性至今其争论仍在继续，但报告了源自于路易斯肺癌的培养细胞株中的mtDNA的突变与癌转移有关(Science,320(5876):661-4,2008)，而且，报告了在具有mtDNA异常的小鼠中通过施用ROS抑制剂能够抑制糖尿病或肿瘤的产生(Proc Natl Acad Sci USA,109(26):10528-33,2012)。认为具有源自于高转移性的A11细胞的G13997A突变的mtDNA会使呼吸链复合物I的活性下降，ROS的产生增加以及ATP产生减少，并且激活存在于核的作为转移相关基因的Mcl-1,Hif-1α，由此会增加癌转移(Science,320(5876):661-4,2008)。另外，报告了大肠癌患者和肺癌患者中的ND基因的病因性突变与癌转移有关(Sci Rep.7(1):15535,2017)。比较在转移性原发病灶与非转移性原发病灶之间疑似引起线粒体呼吸链复合物功能下降的突变数量，结果明确了具有转移的原发病灶比非转移性原发病灶的mtDNA突变率显著增高，发现异序性较多(Sci Rep.7(1):15535,2017,Oncogene,36(31):4393-4404,2017)。另外，在癌症中发现作为其特征能够在大量的例子中还观察到同型异源性。由此可知，认为mtDNA的突变不仅在线粒体病中而且在癌症中也会左右其恶性程度，并且启示了通过以突变线粒体DNA为靶向能够治疗癌症。
与双层膜结构细胞器的DNA的特异性序列结合的DNA结合化合物包含吡咯-咪唑聚酰胺(也称为PIP、PI聚酰胺)。将与双层膜结构细胞器的DNA的特异性序列结合的DNA结合化合物称为DNA小沟结合化合物。
在本发明中使用的与双层膜结构细胞器的DNA的特异性序列结合的DNA结合化合物为直链状DNA结合化合物。
在本发明中使用的与双层膜结构细胞器的DNA的特异性序列结合的DNA结合化合物称为mtDNA序列识别直链状PIP化合物。
PIP为将由细菌产生的天然化合物偏端霉素、倍癌霉素等天然抗生素结构少量合成的由N-甲基吡咯(Py)和N-甲基咪唑(Im)构成的低聚物，经由氢键与DNA的小沟结合。碱基序列识别依赖于Py与Im的组合，由于Py/Py识别A/T或T/A，Py/Im识别C/G，Im/Py识别G/C，因此不是通过在天然化合物中多的直链状结构而是通过DNA结合更强的发卡结构而形成二聚体，以碱基序列特异性识别的方式合成任意的双链DNA使用(Bioorg Med Chem.9(9):2215-35,2001)。另外，报告了PIP通过与DNA碱基序列特异性结合，阻碍基因的转录并抑制基因表达。还报告了作为直链状聚酰胺的偏端霉素定位于线粒体、高尔基体、ER(Bioorganic&Medicinal Chemistry Letters 11(2001)769-772)，还已知能够通过发卡型PIP介入线粒体基因组。但是，尚未开发出减少突变线粒体DNA拷贝数，增加正常线粒体DNA的高效方法。而且，没有研究出能够在该过程中维持线粒体功能的方法，而且易于合成且更适于药剂开发的化合物。
基于该现状的问题点，认为通过合成向线粒体递送低分子量的DNA小沟结合化合物并使其存留的复合物能够解决问题，并进行了深入研究。由此，认为有可能能够创造出排除具有特异性mtDNA序列的线粒体且增加正常线粒体的化合物、或者对具有大量特异性mtDNA序列拷贝的细胞诱导细胞死亡的复合物化合物，而且有可能易于合成复合物，廉价的制造和更高效地进行向脏器、细胞、线粒体的递送。发现基于该全新的考量尝试设计和合成本发明的化合物，确认到在所合成的多个复合化合物中因识别突变mtDNA而被认为的突变mtDNA拷贝数减少、总mtDNA拷贝数上升和诱导细胞死亡，由此能够得到可以获得针对线粒体相关病理的根本性治疗法的药剂。
根据本发明的实施例的结果，认为若使用合成序列特异性mtDNA序列识别直链状聚酰胺化合物和脂溶性阳离子等线粒体递送物质的复合化合物的方法，则能够解决该问题，并且能够合成一种治疗剂，其在具有特异性DNA序列的线粒体中诱导自噬、诱导病态细胞的细胞死亡、有可能能够根本性治疗线粒体相关病理。
作为本发明的复合物的构成要素的mtDNA序列识别直链状聚酰胺是设计为识别包含mtDNA的多态性和体细胞突变序列的序列的聚酰胺。mtDNA序列及其多态性和突变序列能够从MITOMAP(A human mitochondrial genome database：人类线粒体基因组数据库)、GiiB-JST mtSNP(mitochondrial single nucleotide polymorphism：线粒体单核苷酸多态性)、MitoDat(Mendelian Inheritance and the Mitochondrion：孟德尔遗传和线粒体)、COSMIC(the CatalogueOf Somatic Mutations In Cancer：癌症体细胞突变目录)、GOBASE(A database of mitochondrial and chloroplast information：线粒体和叶绿体信息数据库)等数据库得到，但不限于该数据库。识别mtDNA序列是指mtDNA的碱基序列识别聚酰胺进行结合等(例如基于氢键或交联形成(交叉连接)的结合等)。作为mtDNA序列识别化合物，除了上述的吡咯-咪唑聚酰胺(PIP)以外，可列举出Peptide Nucleic Acid(PNA：肽核酸)、Bridged Nucleic Acid(BNA：桥核酸，即交联化核酸)、Locked Nucleic Acid(LNA：锁核酸)、锌指等DNA结合蛋白质或其嵌合蛋白质、向导RNA蛋白质复合物等DNA结合化合物。而且，还包含以维持或提高与DNA的结合能力的方式进行了修饰的修饰物。作为PIP修饰物，例如可列举出从PIP的N甲基吡咯或N-甲基咪唑的甲基延伸烷基链而具有胺的修饰物或者在侧链具有氨基的赖氨酸或精氨酸、在侧链具有羧基的谷氨酸、或者用FITC或生物素等分子修饰所述修饰物的修饰物、用FITC或生物素等分子修饰PIP的N末端的修饰物、用间苯二甲酸等分子修饰C末端的修饰物等。在本发明的优选方式中，包含识别双层膜结构细胞器DNA的序列、在植物中识别叶绿体DNA的序列的构成要素。
吡咯-咪唑聚酰胺(PIP)为包含N-甲基吡咯单元(Py)、N-甲基咪唑单元(Im)和直链氨基酸衍生物部分的聚酰胺，Py、Im和直链氨基酸相互通过酰胺键(-C(＝O)-NH-)连接(Trauger et al,Nature,382,559-61(1996)；White et al,Chem.Biol.,4,569-78(1997)；和Dervan,Bioorg.Med.Chem.,9,2215-35(2001))。PIP形成二聚体，通过将包含Py和Im的两条链并排排列而使两条链之间的Py和Im的对特定组合(Py/Im对、Im/Py对、Py/Py对或Im/Im对)，此时，可以与DNA中的特定的碱基对以高亲和性结合。例如，Py/Im对可以与C-G碱基对结合，Im/Py对可以与G-C碱基对结合。另外，Py/Py对可以与A-T碱基对和T-A碱基对的两方结合。为了更稳定地形成该二聚体，一般在以核内基因组等为靶向的情况下等，经由直链氨基酸衍生物合成整体折叠而成的构象的PIP，从而能够得到更强的键(White et al,Chem.Biol.,4,569-78(1997)；Dervan:Bioorg.Med.Chem.,9,2215-35(2001))。但是，为了形成该发卡上的折叠而成的构象，需要形成分子量更大的复合物，认为能够用直链状的DNA识别化合物充分地进行对于基因组尺寸小的双层膜结构细胞器的DNA的序列识别。另外，PIP中还可以包含3-羟基吡咯(Hp)或β丙氨酸。对于Hp，Hp/Py对可以与T-A碱基对结合(White at al,Nature,391,468-71(1998))。另外，PIP的N末端不仅可以由乙酰基修饰，而且可以由FITC或生物素等分子修饰。对于β丙氨酸/β丙氨酸，可以与T-A碱基对或者A-T碱基对结合。据此，可以通过根据靶向的DNA序列改变Py和Im的对的组合等，设计识别靶向基因的调节区域的PIP。PIP的设计方法和制造方法为公知技术(例如，日本特许第3045706号公报、日本特开2001-136974号公报和国际公开第WO2013/000683号)。
桥核酸(交联化核酸)或锁核酸(LNA)可以以识别靶向基因的调节区域的方式进行序列识别，并合成为将RNA的2’位氧原子与4’位碳原子间用亚甲基链交联而成的2’,4’-BNA或将RNA的2’位氧原子与4’位碳原子间用于亚乙基链交联而成的2’,4’-ENA(Ethylene-Bridged Nucleic Acids：亚乙基-桥核酸)。LNA能够从Proligo公司获得。
即，本发明的复合物的DNA结合化合物选自由桥核酸(交联化核酸)、锁核酸(LNA)、PNA、吡咯-咪唑聚酰胺(PIP)、吡咯-咪唑聚酰胺(PIP)修饰物、DNA结合蛋白质和DNA结合蛋白质复合物组成的组。
各种脂溶性阳离子等向双层膜结构细胞器定位，能够将其用作向这些小器官递送的递送化合物。即，本发明的复合物的可利用于本专利的向双层膜结构细胞器的定位性的递送物质包含脂溶性阳离子。作为脂溶性阳离子，可列举出TPP(triphenylphosphonium，三苯基鏻)、烷基三苯基鏻阳离子(alkyltriphenylphosphonium cations)、罗丹明(rhodamine)、花青素阳离子(cyanine cations)、阳离子肽(cationic peptides)、胍鎓(guanidinium)、三乙基铵、吡啶鎓、3-苯基苯磺酰呋咱(3-phenylsulfonylfuroxan)、F16,2,3-二甲基苯并噻唑鎓碘化物(F16,2,3-dimethylbenzothiazo-lium iodide)、罗丹明19、罗丹明123或DQA等。
其中，作为脂溶性阳离子，优选使用TPP(三苯基鏻)。TPP的稳定性高，包含TPP的复合物已经被应用于临床，且安全性也得到了确认(Adv Ther.2016Jan；33(1):96-115.)。证实了TPP能够通过原生质膜电位差从细胞外向细胞质内摄入处理浓度的5～10倍，通过线粒体膜电位能够向线粒体基质中进一步积累处理浓度的100～500倍。由于TPP直接通过脂质双层，因此无需特异性摄入而分布于线粒体。另外，报告了TPP将以维生素E为代表的各种物质、肽等递送至线粒体(Proc Natl Acad Sci USA,100(9):5407-12,2003)。这样，TPP为本发明的药剂开发中具有优势的线粒体内递送物质，可以称为本发明的优选方式。在以下中示出TPP的结构。
[化学式17]
Figure BDA0003368516430000291
还报告了在植物中作为脂溶性阳离子的TPP及其衍生物SkQ1被递送至叶绿体(Biochemistry(Mosc).2015Apr；80(4):417-23.doi:10.1134/S0006297915040045.)。由此，认为在作为双层膜结构细胞器的线粒体和叶绿体中，本发明的化合物能够特异性干涉DNA序列，诱导各种生物活性。
由于向双层膜结构细胞器的定位性的递送物质渗透至线粒体等双层膜结构细胞器，因此也称为双层膜结构细胞器渗透部位(线粒体渗透部位)。
通过PIP可以识别基因序列，例如，如图1和图8所示，能够进行以MELAS的A3243G突变为靶向的发卡或者直链状的设计而合成PIP化合物，而且为了实现在线粒体中的长期存留，可以设计与作为脂溶性阳离子的TPP的复合物，并且能够进行合成。报告了虽然该MELAS的A3243G突变为在线粒体病中频率最高的突变，但在糖尿病或癌症中该突变也进行了参与。另外，关于可能与病理的发病没有直接关系的mtDNA的多态性，在具有其多态性的mtDNA与成为病因的突变共存的情况下，也可以以mtDNA的多态性的序列为靶向来设计PIP，如图13所示合成针对mtDNA的A14582G多态性的复合化合物。认为在以该多态性为靶向的复合物中也可以以病态mtDNA为结果性靶向，能够设计合成为不影响具有同一多态性的不同序列的正常线粒体的治疗药。
本发明的复合物可以通过将上述聚酰胺和定位于上述双层膜结构细胞器的定位物质结合等进行合成。“结合”可以直接进行，也可以经由接头(linker)进行。作为接头，只要不妨碍烷基化剂的作用，且不妨碍双层膜结构细胞器DNA序列的识别，就没有特别限定，例如可以例示出酰胺键、膦酰二硫醚(phosphodisulfide)键、酯键、配位键、醚键等。
另外，本发明的复合物可以包含标记物。
作为本发明的复合物，可列举出下式(I)～(III)的化合物。
[化学式18]
Figure BDA0003368516430000301
[X为-CH2-、-NH-、-CO-、-CH2CH2O-或-O-，
Y为-CH-或-N-，
R1为-CH3、-OH、标记物(荧光、放射性、生物素、点击化学(click chemistry label)标记等)或TP(作为双层膜结构细胞器定位性化合物的线粒体渗透部位)，
R2为分别独立的-CH3、-NH2、标记物或TP，
J为1至6，
K为1至2，
L为1至4，
M为0至10，
n为0至6，
o为0至6]。
具有下式(II)的(I)所述的化合物
[化学式19]
Figure BDA0003368516430000311
[X为-CH2-、-NH-、-CO-、-CH2CH2O-或-O-，
Y为-CH-或-N-，
R1为-CH3、-OH、标记物或TP，
R2为分别独立的-CH3、-NH2、标记物或TP]。
所述化合物包含下式(III)或(IV)所述的结构的(I)或(II)所述的化合物
[化学式20]
Figure BDA0003368516430000312
或者
[化学式21]
Figure BDA0003368516430000321
[Y为-CH-或-N-，
R1为-CH3、-OH、标记物或TP，
R2为分别独立的-CH3、-NH2、标记物或TP]。
本发明的DNA结合化合物和定位于双层膜结构细胞器的定位物质的复合物可以修饰双层膜结构细胞器的DNA。该DNA结合化合物以线粒体等的DNA序列为靶向，识别线粒体突变和多态性，显示出对线粒体诱导自噬等生物活性。即，能够以上述的线粒体相关疾病等病理为靶向。
本发明的复合物可以根据使用目的，除了本发明的复合物以外，还包含载体或添加物。作为这种载体和添加物，可列举出水、乙酸、有机溶剂、胶原蛋白、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、羧基乙烯基聚合物、羧甲基纤维素钠、聚丙烯酸钠、海藻酸钠、水溶性葡聚糖、羧甲基淀粉钠、果胶、甲基纤维素、乙基纤维素、黄原胶、阿拉伯胶、酪蛋白、琼脂、聚乙二醇、双甘油、甘油、丙二醇、凡士林、石蜡、硬脂醇、硬脂酸、人血清白蛋白、甘露醇、山梨糖醇、乳糖、表面活性剂等。本发明的复合物的使用量可以根据使用目的适当调节。
作为本发明的复合物，可以例示出以下的复合物。该复合物为经由吡咯-咪唑聚酰胺(TPP)的末端β接头结合TPP的复合物。将由下式(V)所示的该复合物称为CCC020-TPP。结构式由C66H80N16O9P表示，分子量为1272.42。另外，将由下式(VI)所示的该复合物称为CCC021-TPP。结构式由C68H82N14O9P表示，分子量为1272.44。
[化学式22]
Figure BDA0003368516430000331
[化学式23]
Figure BDA0003368516430000332
另外，也可以使用分子量小的单链型化合物(单链型PIP-TPP)。作为单链型化合物，可例示出图29和式(XIV)中表示结构式的CCC149-TPP。由于分子量小的单链型化合物显示出皮肤渗透性，因此能够透皮吸收型制剂化。
在图33-1～图33-6中示出本发明的化合物的库。库化合物可以由图32中记载的方法合成。在图33-1～图33-6中，示出2环状结构化合物至8环状化合物。2环状结构化合物可以合成四个化合物，3环状结构化合物可以合成八个化合物，4环状结构化合物可以通过插入β丙氨酸而合成四个4环状结构化合物各16个化合物，5环状结构化合物可以通过插入β丙氨酸而合成四个5环状结构化合物各32个化合物。6环状结构化合物可以通过插入一个以上β丙氨酸而各合成64个化合物。7环状结构化合物也同样可以通过能够假设包含一个β丙氨酸的化合物合成各128个化合物。8环状结构化合物也同样可以通过能够假设包含一个以上的β丙氨酸的化合物合成各256个化合物。
9环状结构化合物以上也能够以同样的方式合成。
在这些库的化合物之中，可以例示出作为本发明的复合物的2环状结构化合物CCC102-TPP(由图34和式XV示出结构)、3环状结构化合物CCC106-TPP(由图36和式XVI示出结构)、4环状结构化合物CCC114-TPP(由图38和式XVII示出结构)、5环状结构化合物CCC175-TPP(由图40和式XVIII示出结构)、6环状结构化合物CCC206-TPP(由图42和式XIX示出结构)、7环状结构化合物CCC1283-TPP(由图44和式XX示出结构)以及8环状结构化合物CCC1394-TPP(由图46和式XXI示出结构)。
而且，作为本发明的复合物，可列举出由图49和式XXII示出结构的10环状结构化合物CCCh531-TPP以及由图52和式XXIII示出结构的10环状结构化合物CCCh560-TPP。
本发明的复合物由于可以识别线粒体DNA突变和多态性，序列特异性地聚集于线粒体，因此用作识别线粒体DNA突变和多态性的序列特异性线粒体聚集性化合物。
本发明的复合物在突变线粒体DNA拷贝数多的细胞中诱导细胞死亡。另一方面，对抗细胞死亡的细胞诱导细胞衰老。通过将本发明的复合物与衰老细胞清除剂组合使用，能够实现增强衰老细胞清除剂的效果的合成致死效果。因此，本发明也包含本发明的复合物与衰老细胞清除剂的组合医药，例如包含本发明的复合物与细胞清除剂的组合试剂盒。而且，本发明包含用于与衰老细胞清除剂组合使用的本发明的复合物。
作为衰老细胞清除剂，可列举出抗凋亡BCL家族抑制剂或MDM2抑制剂，并且可列举出由图55-1～55-11示出结构和化学式的Canagliflozin(卡格列净)、Canagliflozin(卡格列净)、Ipragliflozin(依格列净)、Dapagliflozin(达格列净)、Luseogliflozin(鲁格列净)、Tofogliflozin(托格列净)、Sergliflozin etabonate(舍格列净依他泊酯)、Remogliflozin etabonate(雷莫列净依他泊酯)、Ertugliflozin(艾格列净)、sotagliflozin(索格列净)、Dasatinib(达沙替尼)、Quercetin(槲皮素)、Navitoclax(那维克拉)(ABT-263)、ABT-737、A1331852、A1155463、17-(Allylamino)-17-demethoxygeldanamycin(17-(丙烯胺)-17去甲氧基格尔德霉素)、Fisetin(漆黄素)、Panobinostat(帕比司他)、Azithromycin(阿奇霉素)、Roxithromycine(罗红霉素)、Piperlongumine(荜茇酰胺)、Hyperoside(Quercetin 3-galactoside)(金丝桃甙(槲皮素-3-半乳糖甙))、2,3,5-Trichloro-6-(2-piperidin-1-yl-1,3-thiazol-5-yl)cyclohexa-2,5-diene-1,4-dione(2,3,5-三氯-6-(2-哌啶-1-基-1,3-噻唑-5-基)环己-2,5-二烯-1,4-二酮)、2,5-Dichloro-3-(1-piperidinyl)-6-[2-(1-piperidinyl)-1,3-thiazol-5-yl]benzo-1,4-quinone(2,5-二氯-3-(1-哌啶基)-6-[2-(1-哌啶基)-1,3-噻唑-5-基]苯并-1,4-醌)、2,5-Dichloro-3-morpholin-4-yl-6-(2-piperidin-1-yl-1,3-thiazol-5-yl)cyclohexa-2,5-diene-1,4-dione(2,5-二氯-3-吗啉-4-基-6-(2-哌啶-1-基-1,3-噻唑-5-基)环己-2,5-二烯-1,4-二酮)、2,5-Dichloro-3-(phenylamino)-6-(2-piperidin-1-yl-1,3-thiazol-5-yl)cyclohexa-2,5-diene-1,4-dione(2,5-二氯-3-(苯胺基)-6-(2-哌啶-1-基-1,3-噻唑-5-基)环己-2,5-二烯-1,4-二酮)、2,5-Dichloro-3-(2-morpholin-4-yl-1,3-thiazol-5-yl)-6-piperidin-1-ylcyclohexa-2,5-diene-1,4-dione(2,5-二氯-3-(2-吗啉-4-基-1,3-噻唑-5-基)-6-哌啶-1-基-环己-2,5-二烯-1,4-二酮)、Obatoclax(奥巴克拉)、Venetoclax(维奈妥拉)、2,5-dichloro-3-(4-methyl-1-piperazinyl)-6-[2-(1-piperidinyl)-1,3-thiazol-5-yl]benzo-1,4-quinone(2,5-二氯-3-(4-甲基-1-哌嗪基-6-[2-(1-哌啶基)-1,3-噻唑-5-基]苯并-1,4-醌)、Nutlin-3、MI-63、UBX0101、UBX1967等或它们的衍生物。除此以外，可以使用美国专利第10550378号说明书、美国专利第10517866号说明书、美国专利第10519197号说明书、美国专利第10478432号说明书、美国专利第10426788号说明书、美国专利第1041354号说明书、美国专利第10378002号说明书、美国专利第1032807号说明书以及美国专利第10195213号说明书中记载的衰老细胞清除剂。
本发明的医药组合物为包含上述复合物的组合物。该组合物与线粒体疾病相关mtDNA序列结合。通过将该医药组合物施用于生物体内，可以治疗和预防各种疾病。本发明的医药组合物可以以将双层膜结构细胞器双链DNA用于生物体控制的包含植物的任何生物，尤其哺乳动物(例如人、大鼠、兔、绵羊、猪、牛、猫、狗、猴等)的疾病为对象。本发明的医药组合物的对象疾病可列举出伴有mtDNA的突变的疾病，例如线粒体病、癌症、心脏循环器官疾病、脑神经疾病/精神性疾病、肌肉疾病、肾病、肝疾、生活方式相关疾病、睡眠障碍、皮肤科、眼科或耳鼻科区域的局部症状较强的疾病及感染症、过敏性疾病、由细胞衰老参与的疾病、衰老以及消化器官疾病等。作为对象疾病中的线粒体病，可列举出慢性进行性外眼肌麻痺综合症、肌阵挛性癫痫伴破碎红纤维综合征、线粒体脑肌病伴高乳酸血症脑卒中样综合症(MELAS)、Leigh氏脑症(Leigh氏综合征)等。作为癌症，例如可列举出皮肤癌(恶性黑色素瘤、基底细胞皮肤癌等)、脑肿瘤、头颈癌、食道癌、舌癌、肺癌、乳腺癌、胰腺症、胃癌、小肠或十二指肠癌、大肠癌(结肠癌、直肠癌)、膀胱癌、肾癌、肝癌、前列腺癌、子宫癌、卵巢癌、甲状腺癌、胆嚢癌、咽喉癌、肉瘤(例如，骨肉瘤、软骨肉瘤、卡波西氏肉瘤、肌肉瘤、血管肉瘤、纤维肉瘤等)、白血病(例如慢性骨髄性白血病(CML)、急性骨髄性白血病(AML)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)及急性淋巴性白血病(ALL)、淋巴瘤、多发性骨髄瘤(MM)等)、儿童实体肿瘤(脑肿瘤、神经胚细胞瘤、肝胚细胞瘤、肾胚细胞瘤、尤文肉瘤等)、视网膜胚细胞瘤及黑色素瘤等。作为生活方式相关疾病，没有特别限定，但例如可列举出高血压、糖尿病等。作为皮肤科、眼科或耳鼻科区域的局部症状较强的疾病和感染症，例如可列举出听觉迟钝、牛皮癣、慢性皮炎、鼻窦炎、青光眼、视网膜变性症等。作为过敏性疾病，可列举出特应性皮炎、花粉症等。作为由细胞衰老参与的疾病，例如可列举出皮肤的皱纹、松弛、色素沉淀等。作为脑神经疾病/精神性疾病，例如可列举出痉挛、肌阵挛、失调、脑卒中样症状、智力下降、偏头痛、精神症状、肌张力障碍、脊髓病、双相障碍、帕金森病、痴呆等。作为肌肉疾病，可列举出肌力下降、易疲劳性、高CK血症、肌病等。作为心脏循环器官疾病，可列举出传导障碍、预激(WPW)综合症、心肌病、肺动脉高压症等。作为肾病，可列举出范可尼综合症、肾小管功能障碍、肾小球病变、肌红蛋白尿等。作为肝病，可列举出肝功能障碍、肝功能不全等。
本发明的医药组合物的优选的对象疾病包含由双层膜结构细胞器双链DNA参与的所有病理-疾病。也包含源自线粒体相关疾病的所有的疾病。本发明的医药组合物可以更有效地作用于具有靶向序列的线粒体DNA拷贝数的比率较多的细胞，促进自噬，减少具有靶向序列的线粒体或者在特定的细胞中诱导由于线粒体功能不全引起的细胞死亡机理，由此使疾病原因细胞正常化或者灭亡，从而治疗和预防疾病。
本发明的医药组合物可以为口服施用以及非口服施用中的任一剂型。这些剂型可以按照常规方法制成制剂，也可以包含医药上允许的载体或添加物。作为这样的载体和添加物，可列举出水、乙酸、医药上允许的有机溶剂、胶原蛋白、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、羧基乙烯基聚合物、羧甲基纤维素钠、聚丙烯酸钠、海藻酸钠、水溶性葡聚糖、羧甲基淀粉钠、果胶、甲基纤维素、乙基纤维素、黄原胶、阿拉伯胶、酪蛋白、琼脂、聚乙二醇、双甘油、甘油、丙二醇、凡士林、石蜡、硬脂醇、硬脂酸、人血清白蛋白、甘露醇、山梨糖醇、乳糖、作为医药添加物被允许的表面活性剂等。
上述添加物可以根据本发明的医药组合物的剂型从上述之中单独或者适当组合地选择。作为剂型，在口服施用的情况下，能够作为片剂、胶囊剂、细颗粒剂、粉末剂、颗粒剂、液剂、糖浆剂、外用剂等，通过喷雾剂、涂布剂、滴眼剂或者适当的剂型进行施用。在非口服施用的情况下，可列举出注射剂型等。在注射剂型的情况下，例如可以通过点滴等静脉内注射、皮下注射、腹腔内注射、肿瘤内注射等全身或局部地进行施用。
例如，在用作注射用制剂的情况下，可以使用将本发明的医药组合物溶解于溶剂(例如生理盐水、缓冲液、葡萄糖溶液、0.1％乙酸、聚氧乙烯氢化蓖麻油等)，并且向其中加入适当的添加剂(人血清白蛋白、PEG、甘露糖修饰多支化聚合物、环糊精结合体等)而得到的溶液。或者，为了制成在使用前溶解的剂型，也可以冷冻干燥。作为冷冻干燥用赋形剂，例如可以使用甘露醇、葡萄糖等糖醇或糖类、葡聚糖等聚合多糖类。
例如，在用作透皮吸收型制剂的情况下，可以使用将本发明的医药组合物溶解于溶剂(例如白色凡士林、液体石蜡、肉豆蔻酸异丙酯、蜂蜡、羊毛脂、硬脂酸、硬脂醇、鲸蜡醇、甘油、丙二醇、1,3-丁二醇、乙醇、异丙醇等)，并且向其中加入适当的添加剂(单硬脂酸甘油酯、脱水山梨糖醇单硬脂酸酯、聚氧乙烯氢化蓖麻油60、聚山梨醇酯60、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、苯氧基乙醇、百里酚、亚硫酸氢钠、抗坏血酸、生育酚、二丁基羟基甲苯、乙二胺四乙酸钠水合物、苯并三唑、柠檬酸水合物、柠檬酸钠水合物、乳酸、二异丙醇胺、乙酸、乙酸钠水合物、月桂氮酮、吡咯并硫代癸烷等)而得到的溶液。
本发明的医药组合物或者本发明的化合物的施用量根据年龄、性别、症状、施用途径、施用次数、剂型而不同。对于施用量而言，例如在成人(60kg)的情况下，每一天为0.01～1000mg，优选为0.1～100mg，更优选为1～30mg。施用方法根据患者的年龄、症状进行适当选择。施用例如可以为间隔几日1次，每一天1次或分2～4次。
本发明的医药组合物可以用作抗癌剂。作为对象的癌症的种类例如为大肠癌、胰腺癌、结肠直肠癌、甲状腺癌、肺癌、颈部癌、子宫内膜癌、骨髓增生异常综合征、甲状腺和结肠的腺瘤、神经胚细胞瘤等，但不限定于此，在构成癌症及其周围微小环境的细胞中，构成具有与正常细胞不同的特异性mtDNA序列的癌症或者虽然也具有正常细胞但优先增加了具有其多态性序列的mtDNA的拷贝数的癌症及其周围微小环境的细胞为对象。与上述的医药组合物同样地，本发明的抗癌剂也可以根据使用目的包含载体或组合物。
本发明也包含试剂盒，该试剂盒除了本发明的化合物以外，还包含医药上允许的载体或添加物、试剂类、辅助剂、专用容器、其他所需的附件、说明书等。本发明的试剂盒也可以用作癌症治疗用试剂盒、细胞治疗用试剂盒、双层膜结构细胞器导入治疗试剂盒、诊断用试剂盒、研究试剂试剂盒。
实施例
以下，通过实施例进一步具体地说明本发明。但是，本发明不限定于这些实施例。
[实施例1]
双层膜结构细胞器双链DNA存在于包含动植物的真核生物的细胞小器官例如存在于线粒体或叶绿体，与呼吸或光合成等这些生物的能量产生等密切相关，并且也与活性氧等具有生理作用和病理作用的物质的产生相关。而且，由于为存在于细胞质内、核膜外的DNA，因此与核内DNA相比，具有易于受到损伤且易于积累新的突变的性质，随着年龄增长而积累突变，在成年人的体细胞中成为突变型mtDNA与正常型mtDNA混合存在的称为“异序性”的状态。另外，若突变型mtDNA的比率达到一定以上，则线粒体的功能下降，成为引发线粒体病等的原因。还已知mtDNA的突变不仅是线粒体病而且成为糖尿病、癌症等后天性的被称为所谓的生活方式相关疾病的疾病群的原因。在本实施例中，识别mtDNA碱基序列，使作为脂溶性阳离子的TPP与结合于DNA小沟的直链型吡咯咪唑聚酰胺缩合，由此合成了识别突变mtDNA序列或者mtDNA多态性序列的PIP-TPP(CCC020-TPP和CCC021-TPP)。使用该化合物和下式(VII)的发卡型PIP-TPP该复合物(称为CCC018-TPP)，研究了具有靶向mtDNA序列的细胞的生物活性。进行了线粒体持续定位确认实验、线粒体DNA拷贝数解析实验、相关基因的表达解析实验、线粒体自噬反应确认实验、突变线粒体保有细胞的细胞死亡诱导的实验、程序化的细胞死亡确认实验、合成致死诱导实验、皮肤渗透性确认实验、植物活细胞渗透性确认实验。而且，合成各种PIP，实施与TPP的复合物的合成，成功库化。对通过能够以库化合物中妇科癌细胞的线粒体突变为靶向的(CCC130-TPP和CCC531-TPP)和以线粒体DNA多态性为靶向的(CCC560-TPP)实现的、在线粒体DNA中具有的靶向序列的癌细胞进行了抑制细胞增殖的诱导实验。
为了研究线粒体突变DNA拷贝数的变化，首先制作从源自人宫颈癌的细胞株即HeLa细胞缺失mtDNA而成ρ0细胞。制成通过在其中融合包含源自MELAS患者的A3243G突变的mtDNA的血小板而以不同比率导入突变型线粒体DNA的3243G Low细胞(HeLamt3243突变mtDNA 55％含有细胞)和3243G High细胞(HeLamt3243突变mtDNA82％含有细胞)，并且制成通过融合野生株的HeLa细胞的非突变线粒体DNA得到的HeEB1(HeLamtHeLa)细胞。细胞使用10％胎牛血清(FBS:gibco、美国)、1％青霉素-链霉素混合液(gibco)、0.1mg/ml丙酮酸钠(Sigma-Aldrich、美国)、含有50mg/ml尿苷(Sigma-Aldrich)的达尔伯克改良伊格尔培养基(DMEM D5796:Sigma-Aldrich)，在37℃、5％CO2下进行培养。
化合物CCC018为以作为线粒体病态的一种的MELAS或作为线粒体糖尿病态原因突变的线粒体DNA的A3243G突变序列GGGCCCT为靶向的发卡型PIP，按照国际公开第WO2012/133896号的记载进行了合成。推测CCC019结合于线粒体DNA，能够诱导突变线粒体的拷贝数的减少。然而，在进行国际公开第WO2012/133896号记载的实验时得不到重现性。
[化学式24]
Figure BDA0003368516430000411
如该结果和(Bioorganic&Medicinal Chemistry Letters 11(2001)769-772)中所记载的那样，虽然能够预测到DNA小沟结合化合物向线粒体定位，且与mtDNA结合，但认为通过转移至高尔基体和滑面内质网，而向由分泌囊泡、分泌颗粒、溶酶体和核内体的形成等实现的向细胞外排出的排出系统转移，不能持续地维持与mtDNA的有效的结合状态。
为了确认这一点，合成对CCC018进行荧光标记的CCC018-FITC(图1-1)，在培养通过融合包含源自MELAS患者的A3243G突变的mtDNA的血小板而以不同的比率导入了突变型mtDNA而成的3243G High细胞(HeLamt3243含有82％突变mtDNA细胞)的条件下，对线粒体进行利用线粒体荧光针实现的红色荧光的荧光定位的观察实验，对CCC018-FITC用绿色荧光进行荧光定位的观察实验。
在35mm glass base dish(IWAKI、生冈)中以1×105cells/dish的方式接种3243GHigh细胞，培养24小时之后用CCC018-FITC以最终浓度1μM的方式进行处理。然后，在24小时和48小时之后去除培养液，以成为50nM的方式添加放有MitoTracker(注册商标)RedCMXRos(Life Technologies、美国)的培养液，10分钟之后更换为新的培养液，用共焦激光显微镜SP8(Leica、德国)进行观察。
如图1-2所示，与文献(Bioorganic&Medicinal Chemistry Letters 11(2001)769-772)同样地，在施用CCC018-FITC 24小时之后，发现一部分的线粒体红色荧光和绿色荧光的共定位，但在48小时之后未发现绿色荧光与线粒体的共定位，确认到被认为是转移至高尔基体或滑面内质网的荧光图像。由此，可以认为在发卡型PIP中向线粒体的定位被限定，不能高效地减少突变线粒体。
为了解决上述问题点，认为通过将报道了线粒体定位的脂溶性阳离子与发卡型PIP缩合能够改善线粒体定位，购入4-羧丁基三苯基溴化鏻(TPP、西格玛奥德里奇)，进行了线粒体定位的确认。对在吡啶鎓基上以吲哚为接头结合TPP而成的吡啶鎓-吲哚衍生物-TPP(Pyridinium-Indole derivative-TPP)(下式(VIII))和作为比较的未加成TPP的吡啶鎓-吲哚衍生物(下式(IX))的细胞内定位以上述的方式进行处理后，观察2小时和48小时。如图2所示，吡啶鎓-吲哚衍生物-TPP与线粒体共定位，经48小时也发现了共定位，但未加成TPP的吡啶鎓-吲哚衍生物未发现与线粒体的共定位。
[化学式25]
Figure BDA0003368516430000421
[化学式26]
Figure BDA0003368516430000422
基于上述内容，进一步合成了如图3所示的以mtDNA的A3243G突变序列CCTGCCA为靶向的发卡型PIP、对CCC019缩合TPP而成的PIP-TPP化合物、CCC019-TPP(下式(X))。CCC019为与CCC018同样地识别A3243G突变序列，但通过减小咪唑基的连续键而进一步提高合成效率的化合物。
[化学式27]
Figure BDA0003368516430000431
以如下所述的方式研究了CCC018-TPP的细胞内定位。在35mm玻底培养皿(IWAKI)中以2×104cells/dish的方式接种mtDNA突变细胞株3243G Low(HeLamt3243含有55％突变线粒体DNA细胞)和3243G High细胞，培养24小时之后用CCC018-TPP以最终浓度500nM的方式对3243G Low细胞进行处理，以最终浓度100nM的方式对3243G High细胞进行处理。3243GLow细胞在铺满之前重新接种至2×104cells/dish，更换为包含新鲜的CCC018-TPP的培养液，处理14天。另外，3243G High细胞不更换培养液而处理3天。在CCC018-TPP处理结束后用4％多聚甲醛(PFA)/PBS在室温下固定30分钟。固定后，通过PBS洗涤，用10％FBS/0.1％TritonX100/TBS(TBST)进行封闭10分钟。TBS为最终浓度150μM氯化钠和最终浓度20μMTris(pH7.4)的混合溶液。封闭结束后，用TBST稀释的一次抗体在4℃下使其过夜反应。使用的一次抗体由兔抗TPP抗体(由英国剑桥大学Dr.M.Murphy提供)1:500稀释、小鼠抗细胞色素C抗体(Thermo Fisher Scientific、美国)1:500稀释使用，在与一次抗体的反应结束之后，通过TBS洗涤3次，使用由TBST稀释后的二次抗体山羊抗兔俄勒冈绿488(Invitrogen、美国)1:1000稀释和山羊抗小鼠Alexa Fluor 647(Invitrogen)1:1000稀释，使其反应15分钟。在与二次抗体的反应结束之后，通过TBS洗涤3次，用DABCO/PVA封入剂(Sigma-Aldrich)封入，通过共焦激光显微镜SP8(Leica)进行观察。
由CCC018-TPP对具有3243G突变的两种细胞进行处理的结果为，在施用CCC018-TPP3天后的3243G High细胞和对突变线粒体数少的3243G Low细胞施用CCC018-TPP14天后也观察到与位于线粒体内膜内的CytC共定位的见解(图4)。由此确认到CCC018-TPP被递送至线粒体并且长时间存留。
为了解析CCC019-TPP处理后的总线粒体DNA拷贝数的变化，通过下述的PCR进行了定量实验。
在35mm培养皿(Falcon、美国)中以2×104cells/well的方式接种3243G Low细胞，培养24小时之后用CCC019-TPP以最终浓度1μM和5μM的方式进行处理。2天更换培养基一次，进行CCC019-TPP的连续施用。然后，在48、63天之后，使用Allprep DNA/RNA Mini Kit(QIAGEN、德国)，按照操作说明书提取DNA。提取之后，使用NANODROP 2000c(ThermoFisherScientific)，测定DNA的产量。制备DNA样品，进行PCR反应和解析。在以下中示出使用的引物、反应条件。
·COII
正向引物:ACA CAT TCG AAG AAC CCG TAT(序列号1)
反向引物:TTT AGT TGG GGC ATT TCA CTG(序列号2)
·β肌动蛋白(内部对照)
正向引物:TGA CGG GGT CAC CCA CAC TGT GCC CAT CTA(序列号3)
反向引物:CTA GAA GCA TTT GCG GTG GAC GAT GGA GGG(序列号4)
在以下中示出反应条件。
·COII(20次循环)
Figure BDA0003368516430000451
·β肌动蛋白(25循环)
Figure BDA0003368516430000452
PCR反应结束后，对PCR产物用2％琼脂糖凝胶进行电泳之后，用溴化乙锭进行染色，检测PCR产物的条带，用解析软件(Image J)进行条带定量。
为了推测经48、63天CCC019-TPP处理的3243G Low细胞的mtDNA的总拷贝数，对构成线粒体呼吸链复合物IV的COII基因进行PCR，结果为经48、63天处理的两个实验观察到mtDNA的总拷贝数以CCC019-TPP浓度依赖性的方式增加的倾向(图5)。
为了解析由CCC019-TPP处理实现的正常型-突变型mtDNA的比率的变化。以如下的方式进行PCR-RFLP法的解析。
在35mm培养皿(Falcon)中以2×104cells/well的方式接种3243G Low细胞，培养24小时之后用CCC019-TPP以最终浓度1μM和5μM的方式进行处理。2天更换培养基1次，进行CCC019-TPP的连续施用。然后，在48、63天之后，使用Allprep DNA/RNA Mini Kit(QIAGEN)，按照操作说明书提取DNA。提取之后，使用NANO DROP 2000(商标)(Thermo FisherScientific)，测定DNA的产量。制备DNA样品，进行PCR反应。在以下中示出使用的引物和反应条件。
·mt3243
正向引物:TTC ACA AAG CGC CTT CCC CCG T(序列号5)
反向引物:GCG ATG GTG AGA GCT AAG GTC GG(序列号6)
在以下中示出反应条件。(25次循环)
Figure BDA0003368516430000461
对于PCR产物而言，以如下所述的方式进行ApaI的限制性酶处理并进行解析。PCR产物使用QIAquick PCR Purification Kit(QIAGEN)，按照操作说明书进行纯化。纯化之后，使用NANODROP 2000c(Thermo Fisher Scientific)，测定DNA的产量。测定后，将用PCRSystem 9700(Applied Biosystems、美国)GeneAmp(注册商标)扩增的反应产物用ApaI进行限制性酶处理，在37℃下进行5小时。反应结束后，对样品15ng用2％琼脂糖凝胶进行电泳之后，用溴化乙锭进行染色，检测PCR产物的条带，用解析软件(Image J)进行条带定量。
为了研究正常型和突变型mtDNA的比率的变化，使用从经48、63天CCC019-TPP处理的3243G Low细胞中提取的DNA，进行PCR-RFLP法，结果为经48、63天处理的两个实验观察到野生型线粒体DNA的比率以CCC019-TPP浓度依赖性的方式增加而突变型线粒体DNA的比率减少的倾向(图6)。
为了研究由PIP-TPP引起的突变mtDNA的减少的原因是线粒体的自噬反应而进行以下的实验。在35mm玻底培养皿(IWAKI)中以2×104cells/dish的方式接种mtDNA突变细胞株3243G High细胞，培养24小时之后以最终浓度100nM的方式进行处理。处理52小时后用4％多聚甲醛(PFA)/PBS在室温下固定30分钟。固定后，通过PBS洗涤，用10％FBS/0.1％TritonX100/TBS(TBST)封闭10分钟。TBS为最终浓度150μM氯化钠和最终浓度20μM Tris(pH7.4)的混合溶液。封闭结束后，用TBST稀释的一次抗体在4℃下使其过夜反应。使用的一次抗体由兔抗LC3抗体(cell signaling)1:200稀释、小鼠抗细胞色素C抗体(ThermoFisher Scientific、美国)1:500稀释使用，在与一次抗体的反应结束之后，通过TBS洗涤3次，使用由TBST稀释后的二次抗体山羊抗兔俄勒冈绿488(Invitrogen)1:1000稀释和山羊抗小鼠Alexa Fluor 647(Invitrogen)1:1000稀释，使其反应15分钟。在与二次抗体的反应结束之后，通过TBS洗涤3次，用DABCO/PVA封入剂(Sigma-Aldrich)封入，通过共焦激光显微镜SP8(Leica)进行观察。
如图7所示，通过CytC，线粒体显示出红色的荧光，作为自噬作用的标记的LC3显示出绿色的荧光，但在PIP的处理中，自噬作用在细胞质内分散可见，但未发现与线粒体的荧光完全共定位的见解。但是，在由PIP-TPP处理的细胞中，清晰地发现在细胞质中由于红色和绿色共定位而显示出黄色至橙色的荧光，明确地观察到线粒体和自噬作用共定位。由此，通过PIP-TPP的处理，启示了线粒体的自噬被诱导。
发卡型的PIP的分子量为1700左右，分子量较大并且固相合成中的偶联反应的步骤多，还产生收率的问题。另一方面，线粒体基因组在包含人的哺乳类中为16.5kb左右的单一环状，与核内的人基因组相比极小。由此，是否需要合成具有用于提高DNA结合序列特异性的发卡结构的MGB即发卡型PIP存在疑问。另外，认为产生放线菌等菌类的MGB多为直链状，为以与线粒体基因组类似的菌类或菌类具有的质粒等基因组为靶向的抗生素，即使为直链状也可以得到生物活性。如果为直链状则分子量小且合成步骤少，认为能够制备出廉价且动力学优异的药物。因此，将本发明中的直链状的PIP与脂溶性阳离子的复合物的线粒体基因组的修饰方法作为技术方案，进行以下的直链状PIP-TPP的线粒体DNA序列特异性生物活性效果的判定实验。
以下式(XI)的化合物CCC020与CCC018同样，为作为线粒体病态的一种的MELAS或作为线粒体糖尿病态原因突变的线粒体DNA的A3243G突变序列GGGCCC为靶向的直链型PIP，可以预想到通过与线粒体DNA、3243G突变序列结合，形成与TPP的复合物，能够有效地诱导突变线粒体的拷贝数的减少。
[化学式28]
Figure BDA0003368516430000481
CCC020-TPP的合成：
分别在八个固相合成用Libra管中量取作为固相树脂的β-丙氨酸-Nova-PEG-王氏树脂(Merck)20mg，放置于自动肽合成机PSSM-8(岛津制作所)，每次加入NMP1ml，使其溶胀1小时。接着，将HCTU(肽研究所)2.0g和超脱水NMP(wako)16.8ml加入50ml管，充分使其溶解，制成HCTU溶液。接着，在24根2.0ml圆底艾本德管中分别量取Fmoc-Py-COOH(和光纯药)36.2mg，在8根2.0ml圆底艾本德管中分别量取Fmoc-Im-COOH(wako)36.3mg，在16根2.0ml圆底艾本德管中分别量取N-β-Fmoc-β-丙氨酸(Merck)31.4mg，分别加入HCTU溶液300μl，通过30分钟的超声波处理使其完全溶解，在PSSM-8内按照A14582G的序列(resin-Py-Py-β-ImPy-Py-β)设置各艾本德管。接着，吸引清除设置于PSSM-8的Libra管的NMP，按照PSSM-8的合成程序，重复进行脱保护、缩合反应、乙酰基封端，并执行反应。每一根管的各反应如以下这样进行。在脱保护反应中，加入30％哌啶(和光纯药)/NMP溶液1ml进行10分钟反应，之后用0.9ml的NMP重复洗涤5次。在缩合反应中，向300μl的反应溶液中加入DIEA40μl使其溶解，用N2鼓泡搅拌30分钟，反应后，用0.9ml的NMP洗涤5次。在乙酰基封端中，加入30％乙酸酐(和光纯药)/NMP0.9ml，使其反应10分钟，反应后，用0.9ml的NMP洗涤5次。按照A14582G的序列进行该重复反应，在最后的β丙氨酸的缩合结束之后，用30％哌啶/NMP溶液0.9ml进行Fmoc的脱保护，用0.9ml的NMP洗涤5次，之后，将树脂全部回收至15ml的管。接着，在50ml管中量取(4-羧丁基)三苯基溴化膦溴化物(TPP、西格玛奥德里奇)354.4mg和1-(3-二甲基氨丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl Merck)153.4mg，加入2.4mL的超脱水NMP进行溶解，将溶液全部加入装有树脂的管，之后加入N,N-二异丙基乙胺(DIEA)300μl，使其过夜振荡。反应后，通过抽滤回收树脂，用过量的NMP洗涤10次。洗涤后，将树脂转移至4根带螺旋盖的1.5ml艾本德管，分别加入N,N-二甲基-1,3-丙二胺(Dp、和光纯药)和NMP0.5ml，在带振荡机的加热块上，在65℃下搅拌2小时，进行从树脂上脱离目标化合物的脱离反应。反应后，通过抽滤回收反应液，之后用HPLC进行纯化(流速10ml/min、0.1％AcOH/H2O-CH3CN、0-100％20分钟线性梯度、波长310nm)回收目标目馏分，之后用蒸发器浓缩，用LC/MS2020(岛津制作所)进行质量分析([M+1]+＝1271.5)。最后，用冷冻干燥机制成粉末，得到作为白色粉末的最终产物，即下式(XII)的CCC033-TPP(图8)。
[化学式29]
Figure BDA0003368516430000501
为了研究CCC020-TPP的细胞内定位，进行以下的实验。在35mm玻底培养皿(IWAKI)中以2×104cells/dish的方式接种mtDNA突变细胞株3243G High细胞，培养24小时之后用CCC033-TPP以最终浓度25μM的方式进行处理，在CCC020-TPP处理24小时之后，用4％多聚甲醛(PFA)/PBS在室温下固定30分钟。固定后，通过PBS洗涤，用10％FBS/0.1％TritonX100/TBS(TBST)进行封闭10分钟。TBS为最终浓度150μM氯化钠和最终浓度20μMTris(pH7.4)的混合溶液。封闭结束后，用TBST稀释的一次抗体在4℃下使其过夜反应。使用的一次抗体由兔抗TPP抗体(由英国剑桥大学Dr.M.Murphy提供)1:500稀释、小鼠抗细胞色素C抗体(ThermoFisher Scientific、美国)1:500稀释使用，在与一次抗体的反应结束之后，通过TBS洗涤3次，使用由TBST稀释后的二次抗体山羊抗兔俄勒冈绿488(Invitrogen、美国)1:1000稀释和山羊抗小鼠Alexa Fluor 647(Invitrogen)1:1000稀释，使其反应15分钟。在与二次抗体的反应结束后，通过TBS洗涤3次，用DABCO/PVA封入剂(Sigma-Aldrich)封入，通过共焦激光显微镜SP8(Leica)进行观察。
如图9所示，线粒体显示出CytC的红色荧光，CCC020-TPP显示出绿色倾向，发现共定位的黄色倾向较强，表示出CCC020-TPP定位于线粒体。
通过WST分析评价CCC020-TPP对具有线粒体A3243G突变的细胞的增殖抑制效果。在96孔板(Thermo Fisher Scientific)中均以1×103cells/well的方式接种线粒体DNA突变细胞株、正常细胞株，在培养24小时之后，用CCC020-TPP以最终浓度0、0.1、1、10、20、50μM的方式进行处理。然后，在培养5天之后，通过光学显微镜IX71(OLYMPUS、东京)观察细胞的形态。之后，使用Cell counting kit-8(DOJINDO、熊本)，按照操作说明书计算细胞生存率。作为对照，将DMSO(Wako)以最终浓度1％添加至细胞。
另外，IC50使用以下的计算式计算得出。
IC50＝10(LOG(A/B)×(50-C)/(D-C)+LOG(B))
A:夹着细胞生存率50％的浓度高的一方
B:夹着细胞生存率50％的浓度低的一方
C:夹着细胞生存率50％的浓度低的一方的抑制率
D:夹着细胞生存率50％的浓度高的一方的抑制率
由WST分析进行CCC020-TPP对细胞增殖的影响的结果为，在不具有突变mtDNA的HeEB1细胞中，细胞增殖未得到抑制，相对于此，在具有突变mtDNA的3243G Low细胞、3243GHigh细胞中，发现细胞的增殖抑制效果显著(图10)。
为了确认由CCC020-TPP实现的细胞增殖抑制诱导细胞死亡，在35mm玻底培养皿(IWAKI)中以5×104cells/dish的方式接种3243G High细胞，在培养24小时之后用CCC020-TPP以最终浓度25μM的方式进行处理。然后，在添加CCC020-TPP后，培养5天，分别用4％PFA/PBS在室温下固定30分钟。固定后，通过PBS洗涤，用含有5％正常山羊血清的TBST封闭1小时。封闭结束后，使由TBST稀释后的一次抗、体兔抗Cleaved Caspase-3抗体(处理5天的细胞：Cell Signaling Technology)1:200反应1小时。
用CCC020-TPP处理3243G High细胞，5天后用DAPI进行核染色，结果确认到约60％的细胞发生核的片段化(图11-1)。接着，用CCC020-TPP处理3243G High细胞，在5天后用抗Cleaved Caspase-3抗体进行免疫荧光染色，结果确认到通过CCC020-TPP处理，约一半的细胞为Cleaved Caspase-3阳性，发生凋亡(图11-2)。
为了阐明通过施用CCC020-TPP实现的细胞增殖抑制效果的机理，通过实时PCR以如下的方式解析了mRNA水平的表达解析。在6cm培养皿(Falcon)中以5×105cells/dish的方式接种mtDNA突变细胞株(3243G High)，以1×105cells/dish的方式接种正常细胞株(HeEB1)，培养24小时后用CCC020-TPP以最终浓度25μM的方式进行处理。然后，在培养3天之后，使用RNeasy Plus Mini Kit(QIAGEN)，按照操作说明书提取RNA。提取后，使用NANODROP 2000(商标)(Thermo Fisher Scientific)测定RNA的产量。RNA的逆转录反应使用SuperScript VILO Master Mix(Invitrogen)，进行每一个样品500ng的RNA的逆转录反应，合成cDNA。合成的cDNA用超纯水稀释5倍。
实时PCR使用Power SYBR Green Master Mix(Applied Biosystems)，进行cDNA样品的制备、PCR反应和解析。在以下中示出使用的引物和反应条件。
·BAX
正向引物:CTG AGC AGA TCA TGA AGA CA(序列号7)
反向引物:AGT TTG CTG GCA AAG TAG AA(序列号8)
·p21
正向引物:GCA CTC AGA GGA GGC GCC ATG TCA(序列号9)
反向引物:GGA CGA GAC GAC GTC CCC TGT C(序列号10)
·MCL1
正向引物:GCT TGC TTG TTA CAC ACA CAG GTC(序列号11)
反向引物:GCA GAA CAA TCA GCA ATT TCA AGG(序列号12)
·GAPDH(内部对照)
正向引物:CGA CCA CTT TGT CAA GCT CA(序列号13)
反向引物:AGG GGT CTA CAT GGC AAC TG(序列号14)
在以下中示出PCR反应条件。
保温阶段 50℃2分钟→95℃10分钟
循环阶段 95℃15秒→60℃1分钟(40循环)
熔融曲线阶段 95℃15秒→60℃1分钟→95℃15秒→60℃15秒
关于使用CCC020-TPP处理细胞的细胞周期停止和凋亡相关基因，在HeEB1细胞和3243G High细胞中处理CCC020-TPP，使用3天后提取的RNA进行实时PCR，结果为在具有mtDNA突变的3243G High细胞中，作为细胞周期停止相关基因的P21、作为促凋亡相关基因的BAX的两基因的表达显著上升，作为抑制凋亡相关基因的MCL1的表达显著减少。相对于此，在不具有mtDNA突变的HeEB1细胞中未发现表达变化(图12)。由此，启示了CCC020-TPP诱导3243G High细胞的凋亡。
另外，用光学显微镜观察CCC020-TPP处理细胞的形态的结果为，在HeEB1细胞和3243G Low细胞中未发现细胞的形态变化，相对于此，在3243G High细胞中观察到认为产生显著凋亡的细胞。
由此，确认到CCC020-TPP共定位于线粒体，相比3243G突变少的细胞，在具有3243G突变多的细胞中更显著地诱导由凋亡引起的细胞死亡，在不具有突变的细胞中不诱导细胞死亡。
报告了正常线粒体存在多态性，其多态性有时会由于疾病而聚集。因此，我们研究了在聚集有存在于健康线粒体的多态性的细胞中，能否也与上述实施例同样地识别线粒体多态性，诱导细胞死亡。肺癌的A549细胞具有mtDNA A14582G的多态性。通过上述的“CCC020-TPP的合成”的方法，合成了下式(XIII)的CCC021-TPP(图13)。
[化学式30]
Figure BDA0003368516430000541
通过WST分析评价CCC021-TPP对具有A14582GmtDNA突变的细胞的增殖抑制效果。在96孔板(Thermo Fisher Scientific)中均以1×103cells/well的方式接种线粒体DNA突变细胞株A549和不具有突变的PC14细胞株，在培养24小时之后，用CCC021-TPP以最终浓度0、1、5、10、20、25、50、100μM的方式进行处理。然后，在培养4天之后，用光学显微镜IX71(OLYMPUS、东京)观察细胞的形态。之后，使用Cell counting kit-8(DOJINDO、熊本)，按照操作说明书计算细胞生存率。作为对照，将DMSO(Wako)以最终浓度1％添加至细胞。
另外，IC50使用以下的计算式计算得出。
IC50＝10(LOG(A/B)×(50-C)/(D-C)+LOG(B))
A:夹着细胞生存率50％的浓度高的一方
B:夹着细胞生存率50％的浓度低的一方
C:夹着细胞生存率50％的浓度低的一方的抑制率
D:夹着细胞生存率50％的浓度高的一方的抑制率
由WST分析进行CCC021-TPP对细胞增殖的影响的结果为，在不具有突变mtDNA的PC14细胞中，无法计算出基于细胞增殖被抑制的IC50，但在具有突变的A549细胞中诱导了细胞死亡，IC50为78.89μM。(图14)
用所述A549和PC14细胞进一步长时间地观察了细胞增殖抑制。在上述的培养条件(均以1×103cells/well的方式接种mtDNA突变细胞株A549和不具有突变的PC14细胞株，在培养24小时之后，用CCC021-TPP以最终浓度20μM的方式进行处理)下，观察8天，测定细胞数。
如图15所示，在A549中，通过CCC0021-TPP处理，观察到细胞数显著地减少，增殖抑制显著，但在PC14中未发现细胞数有显著差异，并未发现细胞增殖抑制效果。由此，可以认为CCC0021-TPP在具有靶向线粒体DNA序列的癌细胞株中优先诱导细胞死亡，在不具有靶向线粒体DNA序列的癌细胞株中不能显著地诱导细胞死亡，线粒体突变序列特异性地诱导癌细胞的细胞死亡。
[实施例2]
合成致死实验
在实验之前，在培养细胞株A549和PC14中，通过使用了MitoTrackerRED和抗TPP抗体的免疫染色研究了CCC021-TPP是否定位于线粒体。在35mm玻底培养皿(IWAKI、生冈)中以5×103cells/dish的方式接种A549细胞，以1×104cells/dish的方式接种PC14细胞，在培养24小时之后用CCC021-TPP以最终浓度20μM的方式进行处理。然后，在24小时之后去除培养液，以成为100nM的方式添加放有MitoTracker(注册商标)Red CMXRos(LifeTechnologies、美国)的DMEM培养液，在30分钟之后用PBS洗涤2次，之后用4％PFA固定30分钟，然后，替代为PBS在4℃下保存，用实施例1记载的方法进行免疫抗体染色，通过共焦激光显微镜SP8(Leica、德国)进行观察。其结果，TPP与MitoTrackerRED共定位，判明了CCC021-TPP存留于线粒体内(图16)。将A549和PC14分别在96孔板中各接种5×102cells个16孔，在培养24小时之后，将0、1、2、5、10、25、50μM的CCC021-TPP分别各处理2孔，在5天之后，使用CytoSelectTM MTT Cell Proliferation分析(Cosmo Bio)，在室温下反应2小时，之后，用SPECTRAFLUOR Plus(TECAN)测定590nm的吸光度，进行细胞增殖的再挑战实验。其结果，如图17所示的MTT分析的结果可知，A549的IC50为7.97μM、PC14无法计算得出(图17)。然后，在A549细胞中，在施用CCC021-TPP之后显示出的细胞形态被认为是衰老形态，作为其特性形态，细胞巨大化，形状也歪曲且在细胞内产生无数空泡(图18)。然后，在7天之后，对A549细胞、PC14细胞的活细胞数的变化进行实验，通过台盼蓝染色测定活细胞数，研究细胞生存率。在台盼蓝分析中，判明A549细胞、PC14细胞均不对存活率产生影响(图19)，CCC021-TPP未显示出细胞杀伤能力，启示了对A549细胞中的细胞增殖产生影响。即，CCC021-TPP抑制了A549的细胞增殖，未发现活细胞的数量变化，未发现诱导细胞死亡，但启示了有可能显示细胞衰老。
为了研究细胞衰老是否被诱导，在施用CCC021-TPP后，用A549细胞和PC14细胞判定由SPiDER-β-Gal(DOINDO)实现的衰老标记β-半乳糖苷酶的活性。在35mm玻底培养皿中接种1000个细胞，然后培养24小时，之后，以最终浓度20μM的方式施用CCC021-TPP，培养5天，用Hanks‘平衡盐溶液(HBSS)(pH 7.3)洗涤2次之后，用4％多聚甲醛500μL在室温下处理3分钟，之后，再次用HBSS洗涤2次，然后，用SPiDER-β-Gal工作溶液500μl在37℃下处理30分钟，之后，用HBSS洗涤一次，通过SP8共焦显微镜进行观察。
其结果，在施用了CCC021-TPP的A549细胞中，用SA-β-Gal染色确认显示β-半乳糖苷酶的活性上升的蓝色染色(图20)。在图21中示出对通过该SA-β-Gal染色而被染色的细胞数进行计数并定量化而成的柱形图。
在衰老的细胞中，炎症性细胞因子等炎症相关基因的表达上升。由此，已知被称为SASP(Senescence-associated secretory phenotype：伴细胞衰老分泌现象)的现象被诱导。为了研究该现象是否被A549细胞诱导，用RT-qPCR以与实施例1同样的方式，由CCC021-TPP处理5天后，回收细胞，以与实施例1同样的方式进行RNA提取、RNA逆转录、cDNA合成、RT-qPCR，用A549细胞和PC14细胞研究炎症性细胞因子(IL-1A、IL-1B、IL-6、IL-8)的表达。在下述中示出用于扩增各个基因的引物。qPCR使用Applied Biosystems(注册商标)7500实时PCR系统，在50℃2min→95℃10min的保温阶段之后，在循环阶段95℃15秒→60℃1min且40cycles的条件下进行扩增，在熔融曲线阶段95℃15sec→60℃1min→95℃15sec→60℃15sec下进行扩增后的解离曲线解析，通过在PCR产物中不包含引物二聚体副产物等来确认反应特异性。
IL-1A
正向5’CATTGGCGTTTGAGTCAGCA 3’(序列号15)
反向5’CATGGAGTGGGCCATAGCTT 3’(序列号16)
IL-1B
正向5’CAGAAGTACCTGAGCTCGCC 3’(序列号17)
反向5’AGATTCGTAGCTGGATGCCG 3’(序列号18)
IL-6
正向5’GTTGTGCAAGGGTCTGGTTT 3’(序列号19)
反向5’GGATGGTGTCTCTTGCAGGA 3’(序列号20)
IL-8
正向5’ATGACTTCCAAGCTGGCCGT 3’(序列号21)
反向5’TCCTTGGCAAAACTGCACCT 3’(序列号22)
在A549细胞中，确认到IL-1A、IL-8的表达显著上升，IL-6也发现增加倾向。根据这些qPCR的结果，认为通过CCC021-TPP，SASP被诱导(图22)。
认为作为引起细胞衰老的原因，突变线粒体通过施用CCC021-TPP诱导了线粒体特异性自噬(mitophagy)。认为伴随于此引起的活性氧的过量产生会参与细胞衰老的诱导。因此，以与实施例1同样的方式通过由抗LC3抗体和细胞色素C抗体实现的免疫荧光染色，用CCC021-TPP20μM处理4天之后，确认A549细胞中的自噬。
通过施用CCC021-TPP，与PC14细胞相比，在A549细胞中发现由抗LC3抗体产生的显著荧光，可以确认抗LC3抗体的荧光与细胞色素C抗体的荧光的细胞内定位一致，通过观察到自噬标记和线粒体标记的共定位，认为在A549细胞中诱导了自噬。(图23)
为了进一步确认通过自噬LC3定位于线粒体，将荧光蛋白GFP和LC3的复合蛋白GFP-LC3使用pCMX-SAH/Y145F-LC3B-GFP表达载体转染至A549细胞，研究外源性的LC3蛋白是否聚集于自噬区域。接种5x104细胞，在培养24小时之后，在OptiMEM500μL中加入载体DNA10μg(P3000reagent7.5μL)20μL Lipofectamine(注册商标)3000(ThermoFisher)，放置于室温5分钟转染，在培养24小时之后，接种传代1000细胞，用20μM的CCC021-TPP培养4天之后，通过MitoTracker Red的荧光观察进行确认。
确认到与荧光蛋白的复合蛋白GFP-LC3的绿色荧光在CCC021-TPP处理细胞中与MitoTracker Red的红色荧光共定位，外源性的LC3聚集于线粒体，认为在线粒体中发生特异性自噬(图24)。
为了确认由自噬引起的诱导活性氧种(ROS)的产生，荧光观察由MitoSOX Red(invitrogen)实现的活性氧的产生。在接种A549、PC14细胞104细胞并培养10小时之后，用CCC021-TPP10μM处理24小时，然后用PBS洗涤，用PBS以最终浓度5μM的方式稀释溶解于13μL的DMSO的MitoSOX Red，在37℃下处理10分钟，在用PBS洗涤之后，通过SP8共焦显微镜进行观察。
通过施用CCC021-TPP，在PC14细胞中几乎未观察到促进ROS产生，但在A549细胞中观察到诱导在细胞质内过量的ROS产生(图25)。
通过施用CCC021-TPP在A549细胞中确认到细胞衰老，从而认为引起衰老细胞中的作为细胞死亡(凋亡)的抑制机构的BCL2、BCL-XL、BCL-W、MDM2等的激活。因此，针对由作为抗凋亡因子的BCL-XL、BCL2、Survivin和作为凋亡促进因子的BAX的CCC021-TPP处理来变化通过避免凋亡来维持衰老细胞的表达，用RT-qPCR以如上所述的方式由CCC021-TPP处理5天，之后回收细胞，以与实施例1同样的方式进行RNA提取、RNA逆转录、cDNA合成、RT-qPCR，用A549细胞和PC14细胞研究凋亡相关因子(BCL-XL、BCL2、Survivin、BAX)的表达。在下述中示出用于扩增各个基因的引物。qPCR使用Applied Biosystems(注册商标)7500实时PCR系统，在50℃2min→95℃10min的保温阶段之后，在循环阶段95℃15sec→60℃1min且40cycles的条件下进行扩增，在熔融曲线阶段95℃15sec→60℃1min→95℃15sec→60℃15sec下进行扩增后的解离曲线解析，通过在PCR产物中不包含引物二聚体副产物等来确认反应特异性。
BCL-XL
正向5‘CGGTACCGGCGGGCATTCAG 3’(序列号23)
反向5‘CGGCTCTCGGCTGCTGCATT 3’(序列号24)
BAX
正向5‘CTGAGCAGATCATGAAGACA 3’(序列号25)
反向5‘AGTTTGCTGGCAAAGTAGAA 3’(序列号26)
BCL2
正向5‘CTTTGAGTTCGGTGGGGTCA 3’(序列号27)
反向5‘GGGCCGTACAGTTCCACAAA 3’(序列号28)
Survivin
正向5‘GGACCACCGCATCTCTACAT 3’(序列号29)
反向5‘GTTCCTCTATGGGGTCGTCA 3’(序列号30)
在凋亡阻碍途径中，在上游中BCL-2、BCL-XL发挥作用，在下游中Survivin(凋亡抑制基因)发挥作用。在经过CCC021-TPP处理的A549细胞中，判明了作为上游的抗凋亡因子的BCL-XL的表达上升(图26)。由此启示了妨碍向凋亡的转移。然而，同时也确认到作为凋亡促进因子的BAX的上升和下游的Survivin的减少，启示了有可能为细胞死亡的诱导和阻碍拮抗的状态。
认为A549细胞的细胞衰老中的细胞死亡的抑制是由BCL途径引起的，因此认为可以通过组合使用作为衰老细胞清除剂的senolytic drugs(摧毁衰老药)和作为BCL途径抑制剂的ABT-263(Cayman Chemical)将通过CCC021-TPP引诱细胞衰老的细胞诱导凋亡，通过光学显微镜观察通过组合使用CCC021-TPP处理和作为BCL2、BCL-XL抑制剂的ABT-263是否诱导衰老细胞的细胞死亡，并观察细胞形态的变化。在96孔板中接种A549细胞500细胞并培养24小时，之后，通过光学显微镜经时性观察非施用以及分别单独施用和组合使用施用20μM的CCC021-TPP和10μM的ABT-263，之后，拍摄第2天和第4天的细胞形态。
在DMSO对照、仅ABT-263处理、仅CCC021-TPP处理的细胞中未检测到引起凋亡的细胞，但在组合使用CCC021-TPP和ABT-263二剂的处理的A549细胞中，在施用2天后已经发现显著引起凋亡的细胞，在4天后观察到进一步显著(图27)。
通过BCL2和BCL-XL特异性抑制剂确认认为的A549细胞的细胞衰老中的细胞死亡的抑制是由BCL途径引起的，研究通过组合使用哪个BCL途径阻碍可以在A549细胞中诱导衰老细胞的细胞死亡凋亡。在96孔板中接种A549细胞500细胞并培养24小时，之后，非施用DMSO处理以及CCC021-TPP20μM和作为BCL2抑制剂的ABT-199(图55-10的第33号的化合物维奈妥拉)10μM、作为BCL-XL抑制剂的A1155463(图55-6的第16号的化合物)10μM单独处理以及在同浓度的CCC021-TPP中组合使用同浓度的ABT-199或者A1155463处理4天后，通过光学显微镜拍摄细胞形态的变化。
在DMSO对照、CCC021-TPP、ABT-199、A1155463、ABT-199和CCC021-TPP组合使用施用4天之后，未发现显示细胞死亡的见解，但在A1155463和CCC021-TPP组合使用处理中观察到由箭头示出的引起凋亡的细胞以及显示出平坦且较大的形态的衰老样的形态的细胞显著增加(图56)。
[实施例3]皮肤渗透性确认实验
从东方酵母购入非近交系小鼠ICR，使用分子量1274.7的单链型PIP-TPP(CCC149-TPP)进行向小鼠背部施用的实验。将5周龄的ICR小鼠的背部皮肤剃毛，在确认未达到毛发周期之后，在第6周龄，如图28所示在背部四个部位上分别涂布不包含PIP-TPP的DMSO、以成为30mg/cm2的方式调整的(溶解DMSO、溶解95％DMSO/5％月桂氮酮(透皮吸收促进剂)和清除角质层后经24小时溶解95％DMSO/5％月桂氮酮)PIP-TPP，在18小时后将小鼠安乐死，取得皮肤组织，在4％多聚甲醛固定后制成石蜡块，进行抗TPP抗体的免疫组织染色和DAPI染色的核同时染色，对皮肤和细胞的皮下组织内的药剂皮肤渗透性进行验证。
图29中示出单链型PIP-TPP(CCC149-TPP)的结构式。图30中示出CCC149-TPP的HPLC和质量分析的结果。如图31所示，单独DMSO未发现被抗TPP抗体染色，但CCC149-TPP存在于皮肤基底膜细胞，当使用透皮吸收促进剂时在皮下组织的细胞核周围发现TPP的染色，通过清除角质层和使用透皮吸收促进剂进一步更鲜明地发现直至皮下组织、肌肉层的染色。由此，能够确认PIP-TPP显示出皮肤渗透性，可以想起能够开发制成透皮吸收型制剂的治疗方法。
[化学式31]
Figure BDA0003368516430000621
[实施例4]库化和其合成
在图32中示出作为库化合物的合成的一例的Dp-Py-Py-TPP的合成方法。
以与实施例1同样的方式通过固相合成由固相树脂合成经由β丙氨酸伸长的两个以上的杂环化合物的N末端加成被Boc保护的β丙氨酸的图32的化合物1，然后进行处理使C末端成为羧酸，合成图32的化合物2。分离2之后，使用作为缩合剂的N,N-二甲基-1,3-丙二胺并使其反应，合成图32的化合物3。然后，在去除N末端的保护基得到图32的化合物4之后，使用作为缩合剂的(3-羧基丙基)三苯基鏻(TPP)并使其反应，得到目标的图32的化合物5，使用HPLC进行纯化。
在图33中示出库化合物、2环状结构化合物至8环状化合物。2环状结构化合物可以合成4个化合物，3环状结构化合物可以合成八个化合物，4环状结构化合物可以通过插入β丙氨酸而合成四个4环状结构化合物各16个化合物，5环状结构化合物可以通过插入β丙氨酸而合成四个5环状结构化合物各32个化合物。6环状结构化合物可以通过插入一个以上β丙氨酸而各合成64个化合物。7环状结构化合物也同样可以通过能够假设包含一个β丙氨酸的化合物合成各128个化合物。8环状结构化合物也同样可以通过能够假设包含一个以上的β丙氨酸的化合物合成各256个化合物。
9环状结构化合物以上也能够以同样的方式合成。
在下述中示出化合物的合成和分析例。
在图34中示出合成的2环状结构化合物CCC102-TPP的结构。
在图35中示出CCC102-TPP的高效液相色谱和质量分析的结果。
在图36中示出合成的3环状结构化合物CCC106-TPP的结构。
在图37中示出CCC106-TPP的高效液相色谱和质量分析的结果。
在图38中示出合成的4环状结构化合物CCC114-TPP的结构。
在图39中示出CCC114-TPP的高效液相色谱和质量分析的结果。
在图40中示出合成的5环状结构化合物CCC175-TPP的结构。
在图41中示出CCC175-TPP的高效液相色谱和质量分析的结果。
在图42中示出合成的6环状结构化合物CCC206-TPP的结构。
在图43中示出CCC206-TPP的高效液相色谱和质量分析的结果。
在图44中示出合成的7环状结构化合物CCC1283-TPP的结构。
在图45中示出CCC1283-TPP的高效液相色谱和质量分析的结果。
在图46中示出合成的8环状结构化合物CCC1394-TPP的结构。
在图47中示出CCC1394-TPP的高效液相色谱和质量分析的结果。
[化学式32]
Figure BDA0003368516430000631
[化学式33]
Figure BDA0003368516430000632
[化学式34]
Figure BDA0003368516430000641
[化学式35]
Figure BDA0003368516430000642
[化学式36]
Figure BDA0003368516430000643
[化学式37]
Figure BDA0003368516430000644
[化学式38]
Figure BDA0003368516430000651
[实施例5]由库化化合物实现的肿瘤细胞增殖抑制
示出图44和图45所示的直链状7环状化合物CCC1283-TPP的实施例。
为可以识别线粒体ND1基因的T4216C突变的化合物，宫颈癌细胞株C33A具有该突变。以与实施例1同样的方式，用相同的宫颈癌细胞株进行与野生型的HeLa细胞的细胞增殖分析。在96孔板中接种1000个细胞，施用CCC1283-TPP0.5、1、5、10、20μM5天后进行WST分析。
如图48所示，CCC1283-TPP(直链型PIP)未抑制HeLa细胞的增殖，但在C33A中观察到抑制增殖的倾向。
示出10环状结构化合物CCCh531-TPP的实施例。
为可以识别线粒体ND1基因的T4216C突变的化合物，宫颈癌细胞株C33A具有该突变。以与实施例1记载的同样的方式，用相同的宫颈癌细胞株进行与野生型的HeLa细胞的细胞增殖分析。在96孔板中接种1000个细胞，施用CCCh531-TPP0.5、1、5、10、20μM5天后进行WST分析。
在图49中示出10环状结构化合物CCC531-TPP的结构。
在图50中示出CCCh531-TPP的高效液相色谱分析和质量分析的结果。
如图51所示，CCCh531-TPP(发卡型)在HeLa细胞中IC50＝11.82μM，在C33A中IC50＝3.34μM和在C33A中发现较强的增殖抑制。
[化学式39]
Figure BDA0003368516430000661
对于并非针对体细胞中的后天性的线粒体突变、而是针对人群中发现的线粒体基因ATP6的A8860G多态性的10环状结构化合物CCCh560-TPP，对同型异源性细胞中具有该多态性的癌细胞株C33A、HeLa、Siha、Caski、ME180和源自人非肿瘤皮肤的成纤维细胞HDF细胞针对线粒体DNA多态性进行化合物处理5天时是否也发现细胞增殖抑制，对此以与实施例1记载同样的方式进行细胞增殖分析而进行了研究。在96孔板中接种1000个细胞，施用CCCh560-TPP0.5、1、5、10、20μM5天后进行WST分析。
在图52中示出10环状结构化合物CCCh560-TPP的结构。
在图53中示出CCCh560-TPP的高效液相色谱分析和质量分析的结果。
如图54所示，发现CCCh560-TPP在人非肿瘤细胞HDF(人皮肤成纤维细胞)中抑制增殖的倾向，但不能计算出IC50。但是，在肿瘤细胞株C33A、Hela、Siha、Caski、ME180中分别为IC50＝1.65、7.75、12.6、5.5、3.24μM，在肿瘤细胞中显著地发现较强的增殖抑制。
[化学式40]
Figure BDA0003368516430000662
[实施例6]植物活细胞渗透实验
报告了作为脂溶性阳离子的TPP及其复合物渗透叶绿体、酵母，对植物产生影响(非专利文献4、5)，但尚未明确DNA识别化合物和TPP的复合物被递送至植物活细胞内的情况。使用被FITC荧光色素标记的CCC105-TPP研究利用拟南芥的根及叶向植物活细胞内的渗透性。
在图57中示出FITC-CCC105-TPP的结构式。
在图58中示出FITC-CCC105-TPP的高效液相色谱分析和质量分析的结果。
切断拟南芥Col-0的主根，在1/2MS培养基0.05％MES(pH5.7)中加入700nM的FITC-CCC105-TPP(DMSO最终浓度0.1％)培养3小时，之后用MiliQ水洗涤2次，通过荧光显微镜进行观察。在1/2MS培养基中加入700nM的FITC-CCC105-TPP(DMSO最终浓度0.1％)培养3小时，之后用MiliQ水洗涤2次，通过荧光显微镜对发芽后4天日的根进行同样的观察。
图59的A示出位于主根的FITC荧光。在主根细胞内显示出较强的荧光强度的球状的核(虚线箭头)以及在细胞质内也观察到荧光(实线箭头)，在B中示出发芽后4天的根的荧光图像。在细胞内核(虚线箭头)和细胞质观察到显示荧光(实线箭头)的区域。
切断2周龄的H2B(组蛋白H2B)-GFP表达拟南芥的叶，在1/2MS培养基中加入700nM的FITC-CCC105-TPP(DMSO最终浓度0.1％)处理16小时，之后用MiliQ水洗涤2次，通过荧光显微镜进行观察。
在图60的A中观察到，由位于叶的H2B实现的GFP荧光在叶的核上被发现。在B中观察到，由CCC105-TPP实现的FITC的荧光在叶的核上被发现。
通过确认到FITC-CCC105-TPP在具有细胞壁的植物中渗透至细胞内的核和细胞质内，也可以期待对植物等具有细胞壁的生物产生的效果。
产业上的可利用性
本发明的复合物识别双层膜结构细胞器DNA的序列，促进线粒体自噬反应，减少突变线粒体拷贝数以及诱导具有突变线粒体的细胞的细胞死亡，可以用作线粒体相关疾病等医药组合物的有效成分。
序列表文本
序列号1～30引物
本说明书引用的所有刊物、专利和专利申请直径通过引用而并入本说明书中。
序列表
<110> 千叶县
<120> 双层膜结构细胞器DNA靶向药
<130> PH-8332-PCT
<150> JP 2019-053528
<151> 2019-03-20
<160> 30
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成
<220>
<223> 引物
<400> 1
acacattcga agaacccgta t 21
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成
<220>
<223> 引物
<400> 2
tttagttggg gcatttcact g 21
<210> 3
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成
<220>
<223> 引物
<400> 3
tgacggggtc acccacactg tgcccatcta 30
<210> 4
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成
<220>
<223> 引物
<400> 4
ctagaagcat ttgcggtgga cgatggaggg 30
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工合成
<220>
<223> 引物
<400> 5
ttcacaaagc gccttccccc gt 22
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工合成
<220>
<223> 引物
<400> 6
gcgatggtga gagctaaggt cgg 23
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<220>
<223> 引物
<400> 7
ctgacgagat catgaagaca 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<220>
<223> 引物
<400> 8
agtttgctgg caaagtagaa 20
<210> 9
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工合成
<220>
<223> 引物
<400> 9
gcactcagag gaggcgccat gtca 24
<210> 10
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工合成
<220>
<223> 引物
<400> 10
ggacgagacg acgtcccctg tc 22
<210> 11
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工合成
<220>
<223> 引物
<400> 11
gcttgcttgt tacacacaca ggtc 24
<210> 12
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工合成
<220>
<223> 引物
<400> 12
gcagaacaat cagcaatttc aagg 24
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<220>
<223> 引物
<400> 13
cgaccacttt gtcaagctca 20
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<220>
<223> 引物
<400> 14
aggggtctac atggcaagtg 20
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<220>
<223> 引物
<400> 15
cattggcgtt tgagtcagca 20
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<220>
<223> 引物
<400> 16
catggagtgg gccatagctt 20
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<220>
<223> 引物
<400> 17
cagaagtacc tgagctcgcc 20
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<220>
<223> 引物
<400> 18
agattcgtag ctggatgccg 20
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<220>
<223> 引物
<400> 19
gttgtgcaag ggtctggttt 20
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<220>
<223> 引物
<400> 20
ggatggtgtc tcttgcagga 20
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<220>
<223> 引物
<400> 21
atgacttcca agctggccgt 20
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<220>
<223> 引物
<400> 22
tccttggcaa aactgcacct 20
<210> 23
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<220>
<223> 引物
<400> 23
cggtaccggc gggcattcag 20
<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<220>
<223> 引物
<400> 24
cggctctcgg ctgctgcatt 20
<210> 25
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<220>
<223> 引物
<400> 25
ctgagcagat catgaagaca 20
<210> 26
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<220>
<223> 引物
<400> 26
agtttgctgg caaagtagaa 20
<210> 27
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<220>
<223> 引物
<400> 27
ctttgagttc ggtggggtca 20
<210> 28
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<220>
<223> 引物
<400> 28
gggccgtaca gttccacaaa 20
<210> 29
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<220>
<223> 引物
<400> 29
ggaccaccgc atctctacat 20
<210> 30
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<220>
<223> 引物
<400> 30
gttcctctat ggggtcgtca 20

Claims (29)

1.一种复合物，为直链状DNA结合化合物和双层膜结构细胞器定位性化合物的复合物，所述直链状DNA结合化合物与双层膜结构细胞器DNA的序列特异性结合。
2.根据权利要求1所述的复合物，其中，
复合物聚集于作为双层膜结构细胞器的线粒体，双层膜结构细胞器DNA序列特异性地改变双层膜结构细胞器的功能。
3.根据权利要求1或2所述的复合物，其中，
双层膜结构细胞器DNA序列为选自由mtDNA序列、线粒体病病因突变序列、线粒体相关疾病突变序列、包含线粒体多态性的病变细胞中的拷贝数比正常细胞多的序列以及基因数据库中登录的双层膜结构细胞器DNA序列组成的组的至少一个以上。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的复合物，其中，
DNA结合化合物选自由桥核酸即交联化核酸、锁核酸LNA、PNA、直链状吡咯-咪唑聚酰胺PIP、直链状吡咯-咪唑聚酰胺PIP修饰物、DNA结合蛋白质以及DNA结合蛋白质复合物组成的组。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的复合物，其中，
双层膜结构细胞器定位性化合物为脂溶性阳离子。
6.根据权利要求5所述的复合物，其中，
脂溶性阳离子为TPP即三苯基鏻。
7.一种识别线粒体突变和多态性的序列特异性线粒体聚集性化合物，
包含权利要求1～6中任一项所述的复合物。
8.根据权利要求1所述的复合物，
由下式(I)所示：
Figure FDA0003368516420000021
X为-CH2-、-NH-、-CO-、-CH2CH2O-或-O-，
Y为-CH-或-N-，
R1为-CH3、-OH、标记物或TP，所述标记物为荧光、放射性、生物素、点击化学标记等，所述TP是作为双层膜结构细胞器定位性化合物的线粒体渗透部位，
R2为-CH3、-NH2、标记物或TP，
j为1至6，
k为1至2，
l为1至4，
m为0至10，
n为0至6，
o为0至6。
9.根据权利要求8所述的复合物，
由下式(II)所示：
Figure FDA0003368516420000031
X为-CH2-、-NH-、-CO-、-CH2CH2O-或-O-，
Y为-CH-或-N-，
R1为-CH3、-OH、标记物或TP，
R2为分别独立的-CH3、-NH2、标记物或TP。
10.根据权利要求8或9所述的复合物，其中，
所述复合物具有由下式(III)或(IV)所示的结构：
Figure FDA0003368516420000032
Y为-CH-或-N-，
R1为-CH3、-OH、标记物或TP，
R2为分别独立的-CH3、-NH2、标记物或TP。
11.根据权利要求8或9所述的复合物，其中，
所述复合物具有由下式(XIV)所示的结构：
Figure FDA0003368516420000041
12.根据权利要求8或9所述的复合物，其中，
所述复合物具有由下式(XV)～(XXI)中任一项所示的结构：
Figure FDA0003368516420000042
Figure FDA0003368516420000051
13.根据权利要求8或9所述的复合物，其中，
所述复合物具有由下式(XXII)或(XXIII)所示的结构：
Figure FDA0003368516420000061
14.一种与线粒体疾病相关线粒体DNA序列结合的组合物，
包含权利要求8～13中任一项所述的复合物。
15.一种医药组合物，
包含权利要求1～6和8～13中任一项所述的复合物。
16.根据权利要求15所述的医药组合物，
医药组合物为抗癌剂。
17.一种试剂盒，
包含权利要求1～6和8～13中任一项所述的复合物。
18.一种研究试剂试剂盒，
包含权利要求1～6和8～13中任一项所述的复合物。
19.一种治疗用试剂盒，
包含权利要求1～6和8～13中任一项所述的复合物。
20.一种诊断用试剂盒，
包含权利要求1～6和8～13中任一项所述的复合物。
21.一种试剂盒，
包含权利要求15或16所述的医药组合物和细胞清除剂的组合。
22.根据权利要求21所述的试剂盒，其中，
细胞清除剂选自由卡格列净、卡格列净、依格列净、达格列净、鲁格列净、托格列净、舍格列净依他泊酯、雷莫列净依他泊酯、艾格列净、索格列净、达沙替尼、槲皮素、那维克拉即ABT-263、ABT-737、A1331852、A1155463、17-(丙烯胺基)-17去甲氧基格尔德霉素)、漆黄素、帕比司他、阿奇霉素、罗红霉素、荜茇酰胺、金丝桃甙即槲皮素-3-半乳糖甙、2,3,5-三氯-6-(2-哌啶-1-基-1,3-噻唑-5-基)环己-2,5-二烯-1,4-二酮、2,5-二氯-3-(1-哌啶基)-6-[2-(1-哌啶基)-1,3-噻唑-5-基]苯并-1,4-醌、2,5-二氯-3-吗啉-4-基-6-(2-哌啶-1-基-1,3-噻唑-5-基)环己-2,5-二烯-1,4-二酮、2,5-二氯-3-(苯胺基)-6-(2-哌啶-1-基-1,3-噻唑-5-基)环己-2,5-二烯-1,4-二酮、2,5-二氯-3-(2-吗啉-4-基-1,3-噻唑-5-基)-6-哌啶-1-基-环己-2,5-二烯-1,4-二酮、奥巴克拉、维奈妥拉、2,5-二氯-3-(4-甲基-1-哌嗪基-6-[2-(1-哌啶基)-1,3-噻唑-5-基]苯并-1,4-醌以及它们的任一衍生物组成的组。
23.根据权利要求15或16所述的医药组合物，
用于与细胞清除剂组合使用。
24.根据权利要求23所述的医药组合物，其中，
细胞清除剂选自由卡格列净、卡格列净、依格列净、达格列净、鲁格列净、托格列净、舍格列净依他泊酯、雷莫列净依他泊酯、艾格列净、索格列净、达沙替尼、槲皮素、那维克拉即ABT-263、ABT-737、A1331852、A1155463、17-(丙烯胺基)-17去甲氧基格尔德霉素)、漆黄素、帕比司他、阿奇霉素、罗红霉素、荜茇酰胺、金丝桃甙即槲皮素-3-半乳糖甙、2,3,5-三氯-6-(2-哌啶-1-基-1,3-噻唑-5-基)环己-2,5-二烯-1,4-二酮、2,5-二氯-3-(1-哌啶基)-6-[2-(1-哌啶基)-1,3-噻唑-5-基]苯并-1,4-醌、2,5-二氯-3-吗啉-4-基-6-(2-哌啶-1-基-1,3-噻唑-5-基)环己-2,5-二烯-1,4-二酮、2,5-二氯-3-(苯胺基)-6-(2-哌啶-1-基-1,3-噻唑-5-基)环己-2,5-二烯-1,4-二酮、2,5-二氯-3-(2-吗啉-4-基-1,3-噻唑-5-基)-6-哌啶-1-基-环己-2,5-二烯-1,4-二酮、奥巴克拉、维奈妥拉、2,5-二氯-3-(4-甲基-1-哌嗪基-6-[2-(1-哌啶基)-1,3-噻唑-5-基]苯并-1,4-醌、Nutlin-3、MI-63以及它们的任一衍生物组成的组。
25.一种存留于线粒体且与mtDNA序列特异性结合的复合物的制造方法，包括：
(1)以与线粒体DNA序列特异性结合的方式设计DNA结合化合物的工序；以及
(2)使所设计的所述DNA结合化合物与脂溶性阳离子结合的工序。
26.根据权利要求25所述的制造方法，其中，
mtDNA序列为选自由线粒体病病因突变序列、线粒体相关疾病突变序列、包含线粒体多态性的病理细胞中的拷贝数比正常细胞多的序列以及基因数据库中登录的免疫相关分子组成的组的至少一个。
27.根据权利要求25或26所述的制造方法，其中，
DNA结合化合物选自由桥核酸即交联化核酸、锁核酸LNA、PNA、直链状吡咯-咪唑聚酰胺PIP、直链状吡咯-咪唑聚酰胺PIP修饰物、DNA结合蛋白质以及DNA结合蛋白质复合物组成的组。
28.根据权利要求25～27中任一项所述的复合物的制造方法，其中，
双层膜结构细胞器定位性化合物为具有与双层膜结构细胞器DNA的特定碱基序列结合的官能团的化合物。
29.根据权利要求28所述的制造方法，其中，
双层膜结构细胞器定位性化合物为TPP即三苯基鏻。
CN202080038136.5A 2019-03-20 2020-03-19 双层膜结构细胞器dna靶向药 Pending CN113874040A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2019-053528 2019-03-20
JP2019053528 2019-03-20
PCT/JP2020/012498 WO2020189779A1 (ja) 2019-03-20 2020-03-19 二重膜構造細胞内小器官ｄｎａ標的薬

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN113874040A true CN113874040A (zh) 2021-12-31

Family

ID=72519406

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202080038136.5A Pending CN113874040A (zh) 2019-03-20 2020-03-19 双层膜结构细胞器dna靶向药

Country Status (5)

Country Link
US (1) US20220193241A1 (zh)
EP (2) EP4365590A2 (zh)
JP (1) JPWO2020189779A1 (zh)
CN (1) CN113874040A (zh)
WO (1) WO2020189779A1 (zh)

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2012133896A1 (ja) * 2011-03-31 2012-10-04 YANO Takamitsu ポリアミド化合物及びミトコンドリア遺伝子疾患治療用医薬組成物
CN105008515A (zh) * 2012-12-28 2015-10-28 小利兰·斯坦福大学托管委员会 用于治疗线粒体疾病和用于使细胞分化成神经元的组合物和方法
CN106536729A (zh) * 2013-12-12 2017-03-22 布罗德研究所有限公司 使用粒子递送组分靶向障碍和疾病的crispr‑cas系统和组合物的递送、用途和治疗应用

Family Cites Families (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US1032807A (en) 1910-03-25 1912-07-16 Carter Crume Company Ltd Numbering apparatus.
US1041354A (en) 1910-08-18 1912-10-15 Sandwich Electric Company Selective signaling.
JP3045706B1 (ja) 1998-09-14 2000-05-29 科学技術振興事業団 Ｄｎａの特定塩基配列をアルキル化する化合物及びその合成法
JP2001136974A (ja) 1999-11-16 2001-05-22 Japan Science & Technology Corp 生理活性ピロールイミダゾール誘導体のスクリーニング方法
KR20100074177A (ko) 2007-09-10 2010-07-01 유니버시티 오브 매사추세츠 미토콘드리아-표적화된 항-종양 물질
JPWO2010103683A1 (ja) * 2009-03-13 2012-09-10 学校法人日本大学 Ｄｎａ配列特異的結合化合物を含む局所用眼科疾患治療薬
WO2011150493A1 (en) 2010-05-30 2011-12-08 The Governing Council Of The University Of Toronto Mitochondrial penetrating peptides as carriers for antimicrobials
FR2976823B1 (fr) 2011-06-27 2015-03-27 Air Liquide Dispositif d'epuration des gaz d'echappement d'un moteur thermique comprenant un support ceramique et une phase active ancree mecaniquement dans le support
WO2013158664A2 (en) 2012-04-17 2013-10-24 Kythera Biopharmaceuticals, Inc. Use of engineered viruses to specifically kill senescent cells
EP3016715A4 (en) 2013-07-01 2017-02-08 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Precise delivery of therapeutic agents to cell mitochondria for anti-cancer therapy
CA3100140C (en) 2014-01-28 2023-10-24 Buck Institute For Research On Aging Methods and compositions for killing senescent cells and for treating senescence-associated diseases and disorders
US10195213B2 (en) 2015-03-13 2019-02-05 Unity Biotechnology, Inc. Chemical entities that kill senescent cells for use in treating age-related disease
JP6710354B2 (ja) * 2015-03-23 2020-06-17 国立大学法人 宮崎大学 化合物またはその塩および医薬組成物
JP6891746B2 (ja) 2017-09-15 2021-06-18 セイコーエプソン株式会社 処理装置、処理方法および処理プログラム
US10689416B2 (en) 2017-12-30 2020-06-23 Unity Biotechnology, Inc. Peptide-based proteasome inhibitors for treating conditions mediated by senescent cells and for treating cancer

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2012133896A1 (ja) * 2011-03-31 2012-10-04 YANO Takamitsu ポリアミド化合物及びミトコンドリア遺伝子疾患治療用医薬組成物
CN105008515A (zh) * 2012-12-28 2015-10-28 小利兰·斯坦福大学托管委员会 用于治疗线粒体疾病和用于使细胞分化成神经元的组合物和方法
CN106536729A (zh) * 2013-12-12 2017-03-22 布罗德研究所有限公司 使用粒子递送组分靶向障碍和疾病的crispr‑cas系统和组合物的递送、用途和治疗应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
越川信子等: ""Treatment of pathogenic mtDNA mutation-related diseases with PI polyamide"", 《日本分子生物学会大会講演要旨集》 *

Also Published As

Publication number Publication date
EP3943158A4 (en) 2023-05-17
JPWO2020189779A1 (zh) 2020-09-24
US20220193241A1 (en) 2022-06-23
EP4365590A2 (en) 2024-05-08
EP3943158A1 (en) 2022-01-26
WO2020189779A1 (ja) 2020-09-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US9758481B2 (en) Targeting of EWS-FLI1 as anti-tumor therapy
CN102762586B (zh) 治疗肽
Fernandes et al. Amino acid conjugated chitosan nanoparticles for the brain targeting of a model dipeptidyl peptidase-4 inhibitor
WO2009026163A1 (en) Compositions and methods for inhibiting growth and metastasis of melanoma
US20220098260A1 (en) BH4 Stabilized Peptides And Uses Thereof
Wei et al. Lenvatinib-zinc phthalocyanine conjugates as potential agents for enhancing synergistic therapy of multidrug-resistant cancer by glutathione depletion
RU2753517C2 (ru) Антисмысловые олигонуклеотиды к hif-1-альфа
JP2020506230A (ja) がん、糖尿病および神経障害の処置のための新規スピロおよび環式ビス−ベンジリジンプロテアソーム阻害剤
JP6726678B2 (ja) 癌治療のための高分子遷移金属錯体およびそれらの調製のためのプロセス
WO2021098715A1 (zh) 一种吩噻嗪类铁死亡抑制剂及其制备方法和用途
CN113874040A (zh) 双层膜结构细胞器dna靶向药
US20130338116A1 (en) Compounds and methods for the treatment of pain and other diseases
WO2022216588A1 (en) Keap1/nrf2 protein-like polymers
KR20190046260A (ko) Ncoa1/stat6 단백질-단백질 상호작용을 저해하는 신규 스테이플 펩타이드 및 이의 용도
WO2021261592A1 (ja) リピート結合剤
JP6736462B2 (ja) 生体内のアシル化機能と置き換えられる人工触媒システム
US20110237499A1 (en) Hybrid tripyrrole-octaarginine compounds and their use as medicament in the treatment of cancer and microbial illnesses
US20240189385A1 (en) Keap1/nrf2 protein-like polymers
US20230218768A1 (en) Chemically Coupled Transporter for Low-Hydrophobicity Bioactive Drugs into the Central Nervous System
Wang et al. Parthanatos Involves in the Damage of Hippocampal Neurons Following Epileptic Seizure: in Vivo and Vitro Study
WO2024015930A1 (en) Regulation of tau using protein-like polymers and uses thereof
US20190262457A1 (en) Novel alkylating agent
WO2023212621A1 (en) Development of nano-encapsulated fatty-acyl conjugated colchicine
WO2020160221A2 (en) Macrocyclic peptides for targeted inhibition of autophagy
JP2023008599A (ja) Ｒｕｎｘ結合配列を標的とする抗脳腫瘍剤

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
TA01 Transfer of patent application right
TA01 Transfer of patent application right

Effective date of registration: 20220627

Address after: Tokyo

Applicant after: School legal person Shun heaven

Address before: Chiba County, Japan

Applicant before: CHIBA PREFECTURE