CN113848261A - 一种基于脂质组学的真菌的鉴别方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种基于脂质组学的真菌的鉴别方法，包括：提取真菌脂质；制备供试样品液，通过超高效液相色谱‑高分辨质谱联用分析鉴定脂质分子结构，并通过不同脂质种类的标准品构建标准曲线，对真菌中的脂质分子实现定量分析；综合脂质分析的定性定量结果，通过最小偏二乘法分析筛选出真菌的标志性脂质分子，根据真菌的标志性脂质分子或标志性脂质分子和标志性脂质分子的含量实现对不同真菌种类的鉴别。本发明只需要取少量真菌粉末提取脂质，采用UPLC‑HRMS技术，实现脂质分子结构鉴定及精准定量，结合化学计量学的分析手段，可筛选出差异脂质用于野生真菌种类的判别。

Description

一种基于脂质组学的真菌的鉴别方法
技术领域
本发明属于真菌的鉴别领域，涉及一种基于脂质组学的真菌的鉴别方法，具体涉及通过脂质组学的分析方法获得野生真菌的脂质图谱，找到不同菌种的差异脂质分子，鉴别不同的野生真菌。
背景技术
野生真菌作为一种天然的食物和药物的来源，在营养和医药方面起着重要作用。真菌群落的代谢产物包括氨基酸，多糖，生物碱，萜烯，甾体等因其多样性，愈发受到人们的关注。而且，某些高等真菌的次生代谢产物具有显著的生物活性，例如抑制癌细胞生长，降低血压，对细菌的抑制活性等。因此，高等真菌已逐渐成为食品科学、天然产物化学等领域的重要研究对象。根据普华有策信息咨询有限公司《2020-2026年食用菌行业市场前瞻与前景预测咨询报告》的数据显示：我国食用菌总体产量增长迅速。2000年全国总产量664万吨，到2018年食用菌总产量已经达到3842万吨，产量年均增速超过10％；2018年全国食用菌年产值为2937.37亿元，同比增长7.92％。进出口方面，中国食(药)用菌进出囗贸易以出口为主，2018年中国共出口各类食(药)用菌产品70.31万吨，产品出口金额达到44.54亿美元，同比增长15.87％。食(药)用菌产品出口金额随出口数量的增长稳步提升。食(药)用菌产业的发展与研究人员的努力密不可分，食(药)用菌基础科学的研究，不仅只限于产量的增加，同时，对于产品质量的把控也至关重要。
目前，关于野生菌的鉴别主要通过观察性状、光学显微镜和电子显微镜拍照，并结合参考书籍描述进行区分，很少有通过具体成分对不同种类进行分析鉴别。依靠外观性状鉴别野生真菌的方法，往往容易出现误判的现象。遇到形态相似的真菌品种时，往往很难辨别。每年都有关于误食有毒野生真菌导致的死亡事件，这些都是因为野生真菌不科学，不准确的鉴定导致的悲剧。
关于可食用真菌的组成成分，之前的研究多集中在包括氨基酸、矿物质、多糖和核苷酸在内的营养物质研究和具有生物活性的天然产物方面的研究。尽管有学者研究过可食用真菌的脂质，但都是使用气相色谱(GC)和气相色谱-质谱联用(GC-MS)分析其脂肪酸组成。GC-MS需要脂质的水解和衍生化，这会导致有关整个脂质分子轮廓的化学结构信息的丢失。
发明内容
本发明的目的是针对外观形状鉴别野生真菌的不可靠性，提供一种基于脂质组学的真菌的鉴别方法，通过使用少量的样本进行脂质的提取和分析，综合超高液相(UPLC)的快速分离优点以及高分辨率质谱(HRMS)的高精度和强大的数据采集能力，实现真菌品种的鉴别。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
一种基于脂质组学的真菌的鉴别方法，包括：提取真菌脂质；制备供试样品液，通过超高效液相色谱-高分辨质谱联用(UPLC-HRMS)分析鉴定脂质分子结构，并通过不同脂质种类的标准品构建标准曲线，对真菌中的脂质分子实现定量分析；综合脂质分析的定性定量结果，通过最小偏二乘法分析(Partial Least-Squares Discrimination Analysis，PLS-DA)筛选出真菌的标志性脂质分子，根据真菌的标志性脂质分子或标志性脂质分子和标志性脂质分子的含量实现对不同真菌种类的鉴别。
本发明所述的真菌为野生真菌或人工栽培真菌。
所述的提取真菌脂质的方法为Folch法，包括：将新鲜真菌烘干、粉碎；取真菌粉末，按照真菌粉末和提取试剂的用量比为1:30g/mL将真菌菌粉与提取试剂混合，超声辅助提取20～30分钟，在温度4℃下离心，取上清液；共提取三次，合并上清液，去除溶剂，氮气吹干，得到真菌脂质提取物。
优选的，所述的提取试剂为氯仿和甲醇体积比为2:1的混合溶剂。
优选的，提取时间为30分钟。
优选的，所述的离心的转速为4000rpm，离心的时间为15min。
供试样品液的制备方法为：称取10.0mg真菌脂质提取物，溶于1.0ml异丙醇中，超声助溶，0.22μm尼龙疏水过滤器过滤，得到供试样品液。
所述的超高效液相色谱(UPLC)条件：色谱柱ACQUITY UPLCR HILIC(1.0×100mm,1.7μm Sigma–Aldrich/Supelco,Bellefonte,PA)；柱温：40℃；A相：乙腈，B相：5mmol/L甲酸铵水溶液；流速：0.1mL/min；进样量：1μL；梯度洗脱条件如下：
Figure BDA0003227056720000021
所述的高分辨质谱(HRMS)条件：ESI源条件设置：喷雾电压3.2kV、鞘气流速8.4L/min、鞘气为N2(纯度＞95％；35a.u)，辅助气体为N2(纯度＞95％；10a.u)，毛细管温度：325℃，辅助气体加热温度：350℃，辅助气体流速：24.2L/min，碰撞能：25/30/35eV，一级质谱扫描范围：m/z介于200～1000之间，扫描模式：采用正负离子分开扫描。
标准曲线的制作过程为：选取8种非内源性脂质分子作为标准品，标准品为Ceramide(d18:1/12:0)、PC(17:0/17:0)、PE(17:0/17:0)、PI(8:0/8:0)、PS(17:0/17:0)、DGTS(16:0/16:0)、DAG(18:1/18:1)、TAG(18:2/18:2/18:2)；将标准品溶于异丙醇配制成标准品混合母液，并将其稀释至一系列浓度的溶液(10～5000ng/mL)，进行超高效液相色谱-高分辨质谱联用(UPLC-HRMS)分析，以脂质分子的浓度为横坐标、各类脂质标准品的峰面积为纵坐标，制作标准曲线。
Figure BDA0003227056720000031
脂质分子定量分析的方法为：基于单个脂质分子(m/z误差值为±5ppm)的提取离子色谱图的积分峰面，根据每种脂质标准品的标准曲线计算出每种脂质分子的浓度。
真菌的标志性脂质分子的筛选方法为：以脂质分子的类型和各脂质分子的含量或其相对应的lg值为变量，进行偏最小二乘法数据分析，得到各脂质分子的VIP值，以VIP值最大的脂质分子作为真菌的标志性脂质分子。
考虑到不同的脂质分子含量差异较大，有可能达到1000数量级，因此通过取对数以缩小对应的数值，降低数量级，通过取对数变化，避免当变量程指数增长的时候，出现含量较低的脂质分子大量堆积在零附近，以便更好分析。优选的，计算脂质分子含量相对应的lg值，以脂质分子的类型和各脂质分子相对应的lg值为变量进行偏最小二乘法数据分析，得到各脂质分子的VIP(Variable Importance in Projection)值，以VIP值最大的脂质分子作为真菌的标志性脂质分子。
红腊菇的标志性脂质成分为LDGTS(16:2)、LDGTS(16:0)和LPE(17:1)；鸡枞的标志性脂质成分为LDGTS(16:0)和LDGTS(17:1)；鸡油菌的标志性脂质成分为LDGTS(16:0)和LPE(17:1)；松茸的标志性脂质成分为LDGTS(16:0)；虎掌菌的标志性脂质成分为LDGTS(16:0)和LPE(17:1)，但其LDGTS(16:0)的含量远远低于鸡油菌中LDGTS(16:0)的含量，两者相差2个数量级，其LPE(17:1)的含量同样低于鸡油菌中LPE(17:1)的含量，两者相差2个数量级；干巴菌的标志性脂质成分为Cer-AP(t18:0/15:1+O)、Cer-NDS(d23:0/10:0)、LDGTS(16:0)和LPE(17:1)；见手青和美味牛肝菌的标志性脂质成分均为Cer-AP(t18:0/15:1+O)、Cer-NDS(d23:0/10:0)、LDGTS(16:2)、LDGTS(16:0)、LDGTS(17:1)和LPE(17:1)，但见手青中Cer-AP(t18:0/15:1+O)的含量为22.3±0.60μg/g，约为美味牛肝菌中Cer-AP(t18:0/15:1+O)的含量的2倍，见手青中LPE(17:1)的含量为989±23μg/g，约为美味牛肝菌中LPE(17:1)的含量的3.5倍，手青中LDGTS(16:0)的含量小于美味牛肝菌中LDGTS(16:0)的含量。
本发明的有益效果：
1、本发明只需要取少量(约2g)野生真菌粉末提取脂质，采用UPLC-HRMS技术，实现高通量、高覆盖、高准度的脂质分子结构鉴定及精准定量。
2、本发明在UPLC分析中使用HILIC(亲水作用液相色谱)对可食用真菌脂质进行分离，改善了常规C18柱对极性脂的保留不足情况，能够分析鉴定得到更多的脂质分子。同时，通过分析样品中含有的不同脂质类别，分别选取样品不含的非内源性脂质分子作为标准品，实现对不同类别的脂质实现定量分析。
3、根据野生真菌脂质的质谱分析结果，结合化学计量学的分析手段，可筛选出差异脂质用于野生真菌种类的判别，避免仅通过外观性状等感官辨别产生的误判，为珍贵野生真菌尤其是针对某些烘干后性状相似且价格昂贵的野生真菌如牛肝菌等的品质控制、掺假辨别提供保障，提高了品种鉴定效率，避免了掺假行为。
4、本发明方法可广泛应用于其它野生真菌或人工真菌的鉴别。
附图说明
图1：8种野生真菌脂质分子的PCA图；图中，每一个点代表一个实验样本，每一种图形代表一种野生真菌。
图2：8种野生真菌脂质分子的VIP值图。
具体实施方式
下面通过具体实施方案对本发明的技术方案作进一步说明。
实施例1
8种野生食药用真菌：红腊菇(Laccaria laccata)、鸡枞(Termitomyceseurrhizus)、松茸(Tricholoma matsutake)、见手青(Boletus speciosus Frost)、美味牛肝菌(Boletus bainiugan、鸡油菌(Canthar-ellus cibarius Fr.)、干巴菌(Thelephoraganbajun Zang)、虎掌菌(Sarcodon aspratum)，均采收于云南。
1、脂质提取
通过Folch法提取8种野生食药用真菌的脂质组分，方法如下：
新鲜的野生真菌在40℃烘干，粉碎，-20℃保存。
取2.0g野生真菌粉末，将野生真菌粉末与60ml氯仿/甲醇(2:1V/V)混合，超声辅助提取30分钟，在温度4℃下、以转速4000rpm离心15min，取上清液，将上清液转移至锥形瓶；沉淀按上述步骤提取，共提取三次；合并三次伤情液，在40℃下用旋转蒸发仪去除溶剂，氮气吹干，得到野生真菌脂质提取物，称重，在-20℃冰箱保存，待测分析。
每种野生真菌三个平行，取平均值，算得每种真菌的脂质提取率。红腊菇、鸡枞、松茸、见手青、美味牛肝菌、鸡油菌、干巴菌、虎掌菌的的脂质提取率分别为5.24％、13.95％、10.17％、10.59％、16.56％、11.85％、10.56％、9.73％。
2、UPLC-HRMS分析和脂质分子结构鉴定及定量分析
称取10.0mg野生真菌脂质提取物，溶于1.0mL异丙醇中，超声助溶，经过0.22μm尼龙疏水过滤器过滤至1.5mL进样瓶中，进行UPLC-HRMS检测。
超高效液(UPLC)条件：色谱柱ACQUITY UPLCR HILIC(1.0×100mm,1.7μm Sigma–Aldrich/Supelco,Bellefonte,PA)；柱温：40℃；A相：乙腈，B相：5mmol/L甲酸铵(HCOONH4)水溶液；流速：0.1mL/min；进样量：1μL；梯度洗脱条件见表1。
表1：液相色谱梯度洗脱条件
Figure BDA0003227056720000051
质谱分析(HRMS)条件：ESI源条件设置：喷雾电压(3.2kV)、鞘气流速(8.4L/min)、鞘气为N2(纯度＞95％；35a.u)，辅助气体为N2(纯度＞95％；10a.u)，毛细管温度：325℃，辅助气体加热温度：350℃，辅助气体流速(24.2L/min)，碰撞能：25/30/35eV，一级质谱扫描范围：m/z介于200～1000之间，扫描模式：采用正负离子分开扫描。在高分辨质谱中，离子化的脂质分子通过四极杆质量分析器到达碰撞池，在碰撞诱导裂解条件下，分子结构中键能较低的化学键发生断裂，形成二级离子碎片，通过二级离子碎片相应的前体离子，推导出脂质分子的具体结构。
结果显示，8种野生真菌共检测到18类脂质，172种脂质分子。松茸中的脂质分子类型最多，为70种，其次是见手青和美味牛肝菌中的脂质分子种类，分别为67种和62种，干巴菌、鸡油菌、鸡枞和红腊菇中的脂质分子种类分别为53、52、52、46种，虎掌菌中的脂质分子类型最少，为44种。其中，仅存在于松茸的脂质分子类型最多，仅存在于鸡枞中脂质分子类型最少。
标准曲线的制作：选择8种非内源性脂质分子作为脂质标准品。为了得到准确的分析结果，每测定八个样品后测定一次质量控制(QC)样品(每个脂质样品的混合物)。
将8种脂质标准品溶于异丙醇作为已知浓度的标准品混合母液，并将其稀释至一系列浓度的溶液(10～5000ng/ml)，进行超高效液相色谱-高分辨质谱联用(UPLC-HRMS)分析，以脂质分子的浓度为横坐标、各类脂质标准品的峰面积为纵坐标，制作标准曲线(表2所示)。基于测定出单个脂质分子(m/z误差值为±5ppm)的提取离子色谱图的积分峰面，根据每种脂质标准品的标准曲线计算出每种脂质分子的浓度。
表2：脂质标准品的标准曲线
Figure BDA0003227056720000061
注：x表示脂质分子的浓度，y表示峰面积。
数据处理：应用MSDIAL ver.4.36、Xcalibur 4.0、Simca-P、SPSS 16.0、ChemDraw14.0、Origin 2018和Metaboanalyst 4.0等软件完成原始数据的分析。
3、化学计量学分析
结合MSDIAL ver.4.36、Xcalibur 4.0对脂质定性定量结果，使用SIMCA-P对检测结果进行数学模型分析。
对8种野生真菌的脂质分子的类型及含量进行主成分分析(Principal ComponentAnalysis,PCA)，以说明脂质组分在各种真菌之间的区别。通过PCA分析，得到如图1所示的主成分分析图。由图可知，在主成分1(PC1)和主成分2(PC2)水平上，同一图形的样品点聚集在一起，说明平行实验结果良好；同时，不同图形所代表的不同真菌种类之间分散度较高(除见手青和美味牛肝菌外)，说明不同真菌的脂质存在差异，但是见手青和美味牛肝菌的脂质组成相似。结果表明：通过PCA分析，能得到较好的分析结果，即组内样本聚集、组间样本分散，实验数据满足PCA分析的条件。
计算脂质分子的含量相对应的lg值，以脂质分子的类型和各脂质分子相对应的lg值为变量，进行偏最小二乘法数据分析(Partial Least Squares DiscriminationAnalysis,PLS-DA)，得到各脂质分子的VIP值，以VIP值最大的脂质分子作为真菌的标志性脂质分子。
图2是基于PLS-DA分析得到的各脂质组分的VIP(Variable Importance inProjection)值图，它综合衡量了脂质分子的类型和各种类脂质分子的含量这两个变量，得到对样本脂质分布特征影响最大的脂质分子，即VIP值最大的分子。变量的VIP值越大，反应了变量对样本脂质组成的影响越大，说明该脂质分子在不同样本中的分布差异越大，VIP值大的脂质分子可以作为鉴别不同野生真菌的生物标志物。由图2可知，LPE(16:1)，Cer-NDS(d23:0/10:0)，LDGTS(17:1)，Cer-AP(t18:0/15:1+O)，LDGTS(16:2)，LDGTS(16:1)，LDGTS(16:0)的VIP值较大。所以，上述脂质分子可以作为区别不同野生真菌种类的潜在生物标志物。
表3：8种野生真菌的差异脂质及其含量
Figure BDA0003227056720000071
注：nd表示not detected；LDGTS为溶血性甜菜碱脂。
从表3可以看出，从8种野生真菌的脂质中筛选出7种差异脂质，以差异脂质作为野生真菌的标志性脂质成分，结合其含量可区分不同的野生真菌的品种。
红腊菇的标志性脂质成分为LDGTS(16:2)、LDGTS(16:0)和LPE(17:1)；鸡枞的标志性脂质成分为LDGTS(16:0)和LDGTS(17:1)；鸡油菌的标志性脂质成分为LDGTS(16:0)和LPE(17:1)；松茸的标志性脂质成分为LDGTS(16:0)；虎掌菌的标志性脂质成分为LDGTS(16:0)和LPE(17:1)，但其LDGTS(16:0)的含量远远低于鸡油菌中LDGTS(16:0)的含量，两者相差2个数量级，其LPE(17:1)的含量同样低于鸡油菌中LPE(17:1)的含量，两者相差2个数量级；干巴菌的标志性脂质成分为Cer-AP(t18:0/15:1+O)、Cer-NDS(d23:0/10:0)、LDGTS(16:0)和LPE(17:1)；见手青和美味牛肝菌的标志性脂质成分均为Cer-AP(t18:0/15:1+O)、Cer-NDS(d23:0/10:0)、LDGTS(16:2)、LDGTS(16:0)、LDGTS(17:1)和LPE(17:1)，但见手青中Cer-AP(t18:0/15:1+O)的含量为22.3±0.60μg/g，约为美味牛肝菌中Cer-AP(t18:0/15:1+O)的含量的2倍，见手青中LPE(17:1)的含量为989±23μg/g，约为美味牛肝菌中LPE(17:1)的含量的3.5倍，而手青中LDGTS(16:0)的含量小于美味牛肝菌中LDGTS(16:0)的含量。因此，可以根据野生真菌的标志性脂质分子或结合标志性脂质分子和标志性脂质分子的含量实现对不同野生真菌种类的鉴别。

Claims (9)

1.一种基于脂质组学的真菌的鉴别方法，其特征在于：包括：提取真菌脂质；制备供试样品液，通过超高效液相色谱-高分辨质谱联用分析鉴定脂质分子结构，并通过不同脂质种类的标准品构建标准曲线，对真菌中的脂质分子实现定量分析；综合脂质分析的定性定量结果，通过最小偏二乘法分析筛选出真菌的标志性脂质分子，根据真菌的标志性脂质分子或标志性脂质分子和标志性脂质分子的含量实现对不同真菌种类的鉴别。
2.根据权利要求1所述的基于脂质组学的真菌的鉴别方法，其特征在于：所述的提取真菌脂质的方法为：将新鲜真菌烘干、粉碎；取真菌粉末，按照真菌粉末和提取试剂的用量比为1:30g/mL将真菌菌粉与提取试剂混合，超声辅助提取20～30分钟，在温度4℃下离心，取上清液；共提取三次，合并上清液，去除溶剂，氮气吹干，得到真菌脂质提取物。
3.根据权利要求2所述的基于脂质组学的真菌的鉴别方法，其特征在于：所述的提取试剂为氯仿和甲醇体积比为2:1的混合溶剂。
4.根据权利要求2所述的基于脂质组学的真菌的鉴别方法，其特征在于：所述的离心的转速为4000rpm，离心的时间为15min。
5.根据权利要求1所述的基于脂质组学的真菌的鉴别方法，其特征在于：供试样品液的制备方法为：称取10.0mg真菌脂质提取物，溶于1.0mL异丙醇中，超声助溶，0.22μm尼龙疏水过滤器过滤，得到供试样品液。
6.根据权利要求1所述的基于脂质组学的真菌的鉴别方法，其特征在于：所述的超高效液相色谱条件：色谱柱ACQUITY UPLCR HILIC(1.0×100mm,1.7μm Sigma–Aldrich/Supelco,Bellefonte,PA)；柱温：40℃；A相：乙腈，B相：5mmol/L甲酸铵水溶液；流速：0.1mL/min；进样量：1μL；梯度洗脱条件如下：
Figure FDA0003227056710000011
7.根据权利要求1所述的基于脂质组学的真菌的鉴别方法，其特征在于：所述的高分辨质谱条件：ESI源条件设置：喷雾电压3.2kV、鞘气流速8.4L/min、鞘气为N2，辅助气体为N2，毛细管温度：325℃，辅助气体加热温度：350℃，辅助气体流速：24.2L/min，碰撞能：25/30/35eV，一级质谱扫描范围：m/z介于200～1000之间，扫描模式：采用正负离子分开扫描。
8.根据权利要求1所述的基于脂质组学的真菌的鉴别方法，其特征在于：标准品为Ceramide(d18:1/12:0)、PC(17:0/17:0)、PE(17:0/17:0)、PI(8:0/8:0)、PS(17:0/17:0)、DGTS(16:0/16:0)、DAG(18:1/18:1)、TAG(18:2/18:2/18:2)。
9.根据权利要求1所述的基于脂质组学的真菌的鉴别方法，其特征在于：真菌的标志性脂质分子的筛选方法为：以脂质分子的类型和各脂质分子的含量相对应的lg值为变量，进行偏最小二乘法数据分析，得到各脂质分子的VIP值，以VIP值最大的脂质分子作为真菌的标志性脂质分子。
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