CN113845582A

CN113845582A - 内源性多肽在制备预防或治疗子宫内膜癌靶向药物中的应用

Info

Publication number: CN113845582A
Application number: CN202111206972.2A
Authority: CN
Inventors: 阮红杰; 寸云花; 王露瑶; 付子毅; 布沙来木·木哈买; 胡爽
Original assignee: Nanjing Maternity and Child Healthcare Hospital
Current assignee: Nanjing Maternity and Child Healthcare Hospital
Priority date: 2021-10-15
Filing date: 2021-10-15
Publication date: 2021-12-28
Anticipated expiration: 2041-10-15
Also published as: CN113845582B

Abstract

本发明公开了内源性多肽ECDP2在制备子宫内膜癌新型治疗药物中的应用，内源性多肽ECDP2的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。本发明还公开了一种治疗子宫内膜癌的新型药物组合物。多肽ECDP2在子宫内膜癌的侵袭转移的恶性行为机理中发挥着重要作用，它可能成为治疗子宫内膜癌的特异性标志物，这一发现可能为临床疾病的新药研制提供依据。

Description

内源性多肽在制备预防或治疗子宫内膜癌靶向药物中的应用

技术方案

本发明涉及医药领域，涉及内源性多肽在制备子宫内膜癌新型治疗药物中的应用。

背景技术

子宫内膜癌是女性生殖道三大恶性肿瘤之一，根据全球癌症统计数据显示，在美国，子宫内膜癌发病率跃居女性恶性肿瘤第一，每38个妇女中就有一个被诊断为子宫内膜癌。在中国，子宫内膜癌患者每年新发病例为63400例，死亡为21800例。而且近年来随着人口老龄化、肥胖以及激素替代的广泛推广，子宫内膜癌发病率逐年上升并呈现年轻化趋势，严重威胁女性生命健康。

子宫内膜癌发病机制复杂，已有研究表明其机制涉及到多因素、多途径。子宫内膜随着月经周期雌孕激素水平的波动而发生结构变化，导致子宫内膜功能层发生崩解、脱落、修复和再生，并交替进行。雌激素促进子宫内膜细胞的增殖，而孕激素则拮抗雌激素驱动的促增殖作用。因此长期暴露于雌激素相对过剩而孕激素缺乏的环境将诱导内膜细胞持续增殖，抑制细胞凋亡，增加子宫内膜非典型增生进而发生子宫内膜癌。已知的高危因素包括雌激素及其受体(ER)、孕激素受体(PR)、生理因素(肥胖、多囊卵巢综合症等)、行为因素(激素替代、饮食习惯等)等；此外，一些癌基因(c-myc、Kras)或抑癌基因(PTEN、p53)突变也是子宫内膜癌发生发展的重要原因。尽管针对上述发生发展的机制已取得阶段性进展并获得一些效果，但距离攻克子宫内膜癌尚远，因此继续挖掘子宫内膜癌发生发展的新机制，进而寻找治疗子宫内膜癌有效的药物，无疑可为临床治疗子宫内膜癌提供新的线索。

多肽是一类大小介于小分子化合物和生物大分子之间、具有生物活性的物质，既具有小分子药物的高效低毒又具有大分子药物的精确性等优点，逐渐受到药物研发者的青睐。多项研究表明：多肽不仅参与肿瘤病变、免疫调节以及神经激素递质调节等多种生理病理过程，而且因其具有靶向性、低毒性、易透过血脑屏障及不易产生耐药性等优点，成为药物开发中非常有应用前景的方向之一。虽然多肽研究尚处于起步阶段，但已在多种疾病中展现出优良的治疗潜能：如PGPIPN抑制卵巢癌细胞侵袭转移，治疗前列腺癌中已开始使用多肽药物亮丙瑞林和戈舍瑞林等，但是内源性多肽在子宫内膜癌中的作用却鲜有报道，考虑到内源性多肽的种类和数量远多于大分子蛋白质，因此从内源性多肽的角度，对于阐明子宫内膜癌癌微环境中内源性多肽分子对子宫内膜癌的调控作用，无疑具有重要的潜在科研价值。

子宫内膜癌综合治疗方案(手术切除、放化疗、内分泌治疗及靶向治疗等)及个体化治疗方案的广泛应用，显著延长了患者的生存期，改善患者的生存质量，但是晚期患者仍有较高的转移率，预后极不乐观。而ECDP2作为治疗子宫内膜癌潜在的药物机制目前尚未公开。

发明内容

发明目的：本发明所要解决的技术问题是提供内源性多肽ECDP2在制备预防或治疗子宫内膜癌潜在治疗药物上的应用，为临床治疗转移性子宫内膜癌提供参考。

技术方案：为了解决上述技术问题，本发明提供了一种内源性多肽，所述内源性多肽为ECDP2，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

本发明内容还包括所述的细胞内源性多肽在制备预防或治疗子宫内膜癌药物中的应用。

本发明内容还包括所述的细胞内源性多肽在制备抑制MAPK/ERK靶点的药物中的应用。

本发明内容还包括一种治疗子宫内膜癌的靶向药物，所述靶向药物包括所述的ECDP2抑制MAPK/ERK靶点的化合物。

具体的，该内源性多肽能够抗子宫内膜癌和抑制子宫内膜癌的转移。

具体的，该内源性多肽能够在制备靶向MAPK/ERK治疗转移性子宫内膜癌新型药物的化合物。

本发明的多肽ECDP2来源于人子宫内膜癌组织，通过ECDP2的过表达，即可显著地观察到多肽对子宫内膜癌的影响。通过transwell实验和划痕实验，可以判断出内源性多肽作为子宫内膜癌治疗靶点药物的可靠性和重要性。通过动物实验，可以观察到多肽ECDP2显著抑制子宫内膜肿瘤的远处脏器转移，提高小鼠的生存率，由此可以为多肽ECDP2作为治疗子宫内膜癌的潜在药物提供有力的依据。

本发明通过分离子宫内膜癌组织和正常子宫内膜上皮组织，采用蛋白超滤技术分离子宫内膜癌组织及正常子宫内膜上皮组织中的多肽；再通过高效液相串联质谱，检测内源性组织多肽的表达谱。质谱结果显示，来源于647条前体蛋白的873种多肽在子宫内膜癌组织和正常子宫内膜上皮组织中差异性表达(P＜0.05)。通过多肽组学筛选获得内源性多肽，并采用生物信息学，分析内源性多肽的理化性质，筛选出差异明显且理化性质稳定的多肽ECDP2。因此，本发明提供了内源性多肽ECDP2，所述多肽的氨基酸序列SEQ ID NO：2所示。

本发明通过Transwell和划痕实验检测ECDP2对子宫内膜癌细胞HEC-1-A、Ishikawa和RL95-2侵袭转移能力的影响，发现ECDP2能显著抑制子宫内膜癌细胞HEC-1-A、Ishikawa和RL95-2的侵袭转移，通过CCK8实验检测ECDP2对子宫内膜癌细胞HEC-1-A、Ishikawa和RL95-2增殖能力的影响，发现ECDP2对子宫内膜癌细胞HEC-1-A、Ishikawa和RL95-2增殖能力均无显著影响。

有益效果：相对于现有技术，本发明的优越性在于，本发明通过实验研究发现ECDP2在子宫内膜癌的侵袭转移的恶性行为机理中发挥着重要作用，可能成为治疗子宫内膜癌的特异性药物，这一发现可能为临床疾病的新药研制提供依据。

附图说明

图1是不同浓度多肽对子宫内膜癌细胞增殖的影响。

图2是不同浓度多肽对子宫内膜癌细胞划痕的影响(图2A是HEC-1-A细胞划痕实验，图2B是Ishikawa细胞划痕实验)。

图3是不同浓度多肽对子宫内膜癌细胞迁移的影响(图3A是HEC-1-A细胞未铺基质胶的小室实验，图3B是Ishikawa细胞未铺基质胶的小室实验)。

图4是不同浓度多肽对对子宫内膜癌细胞侵袭的影响(图4A是HEC-1-A细胞有基质胶的小室实验，图4B是Ishikawa细胞有基质胶的小室实验)。

图5是固定浓度的多肽对裸鼠皮下子宫内膜癌模型的影响(图5A是小鼠的体重变化曲线，图5B裸鼠脏器远处转移的HE染色，图5C是裸鼠的生存曲线)。

具体实施方式

实施例1

收集的临床样本主要来源于接受手术治疗的女性患者(表1)。分别收集子宫内膜癌患者的癌组织和年龄匹配的子宫良性病变患者的子宫组织样本各6例。

表1：临床样本基本信息

	子宫内膜癌(n＝6)	良性病变(n＝6)
				年龄	54.5±5.5	53.5±8.5	p＞0.05
BMI	23.4±1.2	23.1±4.1	p＞0.05

表1中，两组患者的年龄和BMI指数均无统计学差异(p＞0.05)。

提取出子宫内膜癌组织及正常子宫内膜上皮组织来源的多肽并运用i-TRAQ标记的LC-MS/MS方法检测子宫内膜癌组织及正常子宫内膜上皮组织来源的多肽表达谱。质谱结果显示两组样本中873条差异性多肽(变化倍数＞2，p＜0.05，FDR＜0.05)。与正常子宫内膜上皮组织相比，子宫内膜癌组织中共有113条肽显著高表达，760条肽显著低表达。此外，与正常子宫内膜上皮组织相比，166条肽在子宫内膜癌组织中显著差异表达(变化倍数＞5，p＜0.05，FDR＜0.05)。其中31条肽在子宫内膜癌组织中高表达，135条肽在子宫内膜癌组织中低表达。以上结果表明，来源于子宫内膜癌组织的多肽与来源于正常子宫内膜上皮组织的多肽存在显著的差异性和特异性。

实施例2

为筛选合适的目的研究多肽，我们综合考虑：①表达丰度较高；②组内差异较小；③亲脂性好；④物种间保守；⑤生物信息学分析结果显示与肿较小等筛选原则，首先筛选出2条多肽以进行初步研究(表2)。这2条多肽分别来自前体蛋白LMNA、和NOVA2。为了方便表述与研究，我们将其分别命名为ECDP1/2(Endometrial Cancer Derived Peptide1/2，ECDP1/2)。氨基酸序列如SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.2所示。其中，ECDP1在子宫内膜癌组织中高表达；ECDP2在子宫内膜癌组织中低表达。

表2：目的多肽理化性质及物种保守性分析

实施例3

1、细胞活力检测实验(CCK-8实验)

本实验所用的Ishikawa细胞购自江苏凯基生物技术有限公司，HEC-1-A细胞购自中国科学院上海生物细胞学研究所。CCK8试剂购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司，RPMI-1640培养基购自江苏凯基生物技术有限公司。

取对数生长期HEC-1-A和Ishikawa细胞，胰酶消化后计数，按5000个细胞/孔接种到96孔板，每个浓度设置6个副孔。4-6小时细胞贴壁后每孔加入CCK8检测溶液(10μLCCK8+90μL RPMI-1640无血清培养基)，孵育2小时后酶标仪检测吸光值，记为0小时。同时使用不同浓度多肽ECDP2工作液(0ng/L，1ng/L，10ng/L，100ng/L)处理细胞，BSA为对照，培养基换成不含血清的不完全培养基，分别在24小时，48小时，72小时加入CCK8检测溶液(由于多肽半衰期较短，每24小时重复加肽一次)，2小时后酶标仪检测吸光值并计算细胞的相对增殖活力，条件同前。结果如图1所示：2条内源性多肽对子宫内膜癌细胞增殖活力均无影响。

2、细胞迁移侵袭实验

2.1划痕实验

取对数生长期HEC-1-A和Ishikawa细胞，胰酶消化后计数，按5×10^5细胞/孔接种至六孔板。待细胞融合度达到90％以上，用10μL枪头划痕，培养基换成不含血清的不完全培养基，同时使用不同浓度的多肽ECDP2工作液(0ng/L、10ng/L，100ng/L)处理细胞，BSA为对照。此时记为0小时，倒置显微镜下(100×)观察拍照，记录。通过Image J软件计算空白区域的面积，比较处理组与对照组之间的相对倍数(处理组：对照组)。在24h、48、72h各拍照记录，由于上述多肽半衰期较短，每隔24小时重复加肽处理。结果如图2所示：ECDP2显著抑制子宫内膜癌细胞迁移。通过Image J软件计算空白区域的面积，结果表明：ECDP2能显著抑制HEC-1-A、Ishikawa的迁移能力约65％、55％。

2.2 transwell迁移实验

取对数生长期HEC-1-A和Ishikawa细胞，胰酶消化后计数，按3×10⁴细胞/70μL培养基接种于transwell小室中，下室中加入600μL含20％血清培养基；细胞贴壁后，小室中培养基更换为含多肽的无血清培养基(0ng/L，10ng/L，100ng/L)。24小时后将小室置于多聚甲醛中4度固定30min，随后结晶紫室温避光染色15min，用棉签轻轻拭去transwell小室上室中的细胞，去离子水清洗，晾干，倒置显微镜拍照(100×)，计数。结果如图3所示：ECDP2能显著抑制子宫内膜癌细胞迁移。

2.3、transwell侵袭实验

实验前晚在transwell小室中铺胶，将matrigel(BD Matrigel^TM BasementMembrane Matirx，USA)与无血清培养基按1∶6比例混合，按70ul/孔铺于transwell小室内，置于37℃培养箱中过夜。取对数生长期HEC-1-A和Ishikawa细胞，胰酶消化后计数，按5×10^4细胞/200μL培养基接种于transwell小室中，下室中加入600μL含20％血清的培养基；细胞贴壁后，小室中培养基更换为含多肽的无血清培养基(0ng/L，1ng/L，10ng/L，100ng/L)。48小时后将小室置于多聚甲醛中4度固定30min，随后结晶紫室温避光染色15min，用棉签轻轻拭去transwell小室上室中的细胞，去离子水清洗，晾干，倒置显微镜拍照(100×)，计数。结果如图4所示：ECDP2能显著抑制子宫内膜癌细胞侵袭。

3、动物实验

本次动物实验遵循南京医科大学实验动物伦理要求，实验所用的雌性BALB/c免疫缺陷鼠购于南京医科大学动物实验中心，饲养环境为南京医科大学SPF屏障动物房。实验所用的Babl/c免疫缺陷雌鼠在接种肿瘤细胞前尾静脉注射多肽ECDP2(1μg/g体重)一周，BSA为对照，模拟内源性多肽分泌的体内环境。注射多肽ECDP2一周后，每只裸鼠在右侧肩胛皮下注射5×10⁶个子宫内膜癌Ishikawa细胞。此后每周量尾静脉注射多肽ECDP2(1μg/g体重)两次，每周记录肿瘤的体积和裸鼠的体重。待肿瘤细胞成瘤6周后，取裸鼠的脏器组织做HE染色。结果如图5所示：ECDP2能显著抑制子宫内膜肿瘤的脏器转移、提高小鼠生活质量、延长小鼠存活时间。

结论：内源性多肽ECDP2对子宫内膜癌细胞的侵袭转移有显著抑制作用，有望成为治疗子宫内膜癌的新型药物。

序列表

<110> 南京市妇幼保健院

<120> 内源性多肽在制备预防或治疗子宫内膜癌靶向药物中的应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 29

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Asp Arg Gly Ser Ala Ser Gly Ser Gly Ala Gln Val Gly Gly Pro Ile

1 5 10 15

Ser Ser Gly Ser Ser Ala Ser Ser Val Thr Val Thr Lys

20 25

<210> 2

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Arg Leu Lys Met Leu Glu Arg Ile Pro Glu Ala Ser Pro

1 5 10

Claims

1.一种内源性多肽，其特征在于：所述内源性多肽为ECDP2，其氨基酸序列如SEQ IDNO：2所示。

2.权利要求1所述的细胞内源性多肽在制备预防或治疗子宫内膜癌药物中的应用。

3.权利要求1所述的细胞内源性多肽在制备预防或治疗子宫内膜癌转移药物中的应用。

4.权利要求1所述的细胞内源性多肽在制备抑制MAPK/ERK靶点的药物中的应用。

5.一种治疗子宫内膜癌的靶向药物，其特征在于，所述靶向药物包括权利要求1所述的ECDP2抑制MAPK/ERK靶点的化合物。