CN113841637A - 一种杂交鳢无弹状病毒苗种繁育方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种杂交鳢无弹状病毒苗种繁育方法，涉及水产养殖领域。其繁育方法包括：选取不携带病毒的苗种，通过疫苗免疫和定期病毒检测，培育出不携带病毒的后备亲本；筛选出不携带病毒且性成熟的后备亲本，进行产前营养强化；对亲本进行人工催产和人工受精，取得受精卵；将所述受精卵置于病毒灭活剂中进行净化处理，经清水漂洗后进行苗种孵化，孵化期间进行病毒监测；对不携带病毒的苗种进行培育，培育期间进行病毒监测，即得杂交鳢无病毒苗种。本申请利用先进的病原检测技术无创筛选亲本，并采用病毒净化手段进行杂交鳢无特定病毒苗种的培育，以提高杂交鳢苗种的存活率和产量，有助于杂交鳢繁育技术的推广。
Description
技术领域
本发明涉及水产养殖的领域，尤其涉及一种杂交鳢无弹状病毒苗种繁育方法。
背景技术
乌鳢(Channa maculata)隶属鲈形目(Perciformes)、攀鲈亚目(Anabantoidei)、鳢科(Channidae)、鳢属(Channa)；斑鳢(Channa argus)同为鳢属，与乌鳢为同属不同种，这两种鱼除新疆、西藏地区外，其他省份各大水系均有分布，是我国名贵的特种淡水养殖品种，其不但肉质细腻，肉味鲜美，刺少肉多，还可以生肌补血，加速伤口愈合，具有很高的食疗价值，深受国内外广大消费者的喜爱，目前也是我国外贸出口的重要经济鱼类。但这两种鱼在养殖过程中都有各自的弊端，例如生长速度慢，规格不整齐，不耐运输等。
近年来，科研人员为了克服这些问题，通过将斑鳢(雄鱼)、乌鳢(雌鱼)杂交获得了杂交鳢新品种，生长速度较斑鳢、乌鳢明显提高，经人工驯食可在成鱼养殖阶段全程摄食人工配合饲料，饵料利用率大幅提升，养殖水体水质明显改善。杂交鳢也逐渐被越来越多的养殖户接受，大家对杂交鳢种苗的需求也随之增大。但是新品种的培育和推广，并没有完全解决养殖过程中的病害问题，其中弹状病毒等导致的的病毒病是威胁杂交鳢养殖业健康发展的主要因素之一，每年造成的死亡量非常大，经济损失惨重。
目前杂交鳢的繁育研究，都集中在如何提高受精率和孵化率上，以及优良品性的选育，而关于如何生产出不携带病毒的杂交鳢还没有相关的研究报道。繁育过程中，亲本可能本身携带病毒造成垂直传播，孵化和培育的过程中，水和工具可能水平传播病毒，同时杂交鳢的自然受精过程中，发情时会互相追咬，加大病毒感染的可能性。
为此，急需研究杂交鳢的无病毒繁殖技术，减少病毒感染传播，以期提高杂交鳢繁殖苗种的产量和质量。
发明内容
本发明提供了一种杂交鳢无弹状病毒苗种繁育方法，从杂交鳢的后备亲本开始进行病毒追踪，杜绝病毒的携带和传播，进行杂交鳢无病毒苗种的繁育，以提高杂交鳢苗种的质量和产量，有助于杂交鳢繁育技术的推广。
为了解决上述技术问题，本发明实施例提供了一种杂交鳢无弹状病毒苗种繁育方法，具体包括以下步骤：
S1、选取不携带病毒的后备亲本苗种，进行疫苗免疫，培育过程定期进行病毒抽检，淘汰携带病毒的全部苗种；
S2、筛选出不携带病毒且性成熟的后备亲本，进行产前营养强化；
S3、对后备亲本进行人工催产和人工受精，取得受精卵；
S4、将所述受精卵置于浓度为20ppm-50ppm的病毒灭活剂中进行净化处理，浸泡时间为30min，经清水漂洗后进行苗种孵化，孵化期间进行病毒监测，淘汰携带病毒的全部苗种；
S5、对不携带病毒的苗种进行培育，培育期间进行病毒监测，淘汰携带病毒的全部苗种，结果为阴性即得杂交鳢无病毒苗种。
其中，所述病毒灭活剂包括聚六亚甲基双胍、绿原酸、乙二胺四乙酸、壳聚糖和去离子水。
通过采用上述方案，本申请的杂交鳢繁殖技术从后备亲本的苗种开始监测，利用先进的病原检测技术无创筛选亲本，并采用病毒净化手段，杜绝病毒的携带和传播，繁殖期间经过多次的病毒监测筛查工作，严格把控、筛查每个繁殖阶段的病毒情况，采用人工授精的方式可以避免由于自然受精使后备亲本的受伤而感染病毒，受精卵经过病毒灭活剂浸泡后可以杀灭病毒和细菌，严格控制病毒灭活剂的浓度和浸泡时间，可以在保证受精卵的孵化不受影响的前提下，最大限度地完成净化，提高苗种的孵化和培育过程中的成活率。其中，聚六亚甲基双胍可以吸附病毒和细菌，并进行杀灭，且使用安全无毒，不影响受精卵的孵化，最终可以获得高产量的杂交鳢无病毒苗种，有助于杂交鳢繁殖技术的推广。
作为优选方案，所述病毒灭活剂包括以下重量份原料：
聚六亚甲基双胍：10份-20份；
绿原酸：5份-10份；
乙二胺四乙酸：5份-10份；
壳聚糖：2份-3份；
去离子水：57份-78份。
作为优选方案，在所述S2中，所述产前营养强化为采用含有亲本营养强化剂的人工配合饲料对后备亲本进行投喂，所述亲本营养强化剂的添加量为每日投喂人工配合饲料的0.3wt％-0.5wt％，所述亲本营养强化剂包括以下重量份原料：
复合维生素：5份-10份；
黄芪多糖：10份-20份；
甘草酸：5份-10份；
虾青素：5份-10份；
N-氨甲酰谷氨酸：10份-20份；
鱼粉：30份-65份。
通过采用上述方案，进入性成熟阶段的亲本消耗量增大，需要额外补足营养，使体内生成的精子和卵子可以保证较高的受精率和孵化率，同时可以增加此时亲本的自身抵抗力，通过自身免疫能力消灭刚入侵的病毒，避免由于体能的降低而使病毒有了入侵和繁殖的机会。
作为优选方案，在所述S5中，苗种出膜第4天后采用净化后的丰年虫幼体投喂杂交鳢无病毒苗种，并在培育后期投喂人工配合饲料。
作为优选方案，所述丰年虫幼体的净化方法为在投喂前用浓度为100ppm-200ppm的病毒灭活剂浸泡30min。
通过采用上述方案，由于丰年虫幼体具有坚硬的外壳且耐受能力较强，病毒灭活剂的有效成分很难进入虫卵内部完成消毒，选用上述病毒灭活剂的浓度范围有助于有效杀灭丰年虫幼体的病毒和细菌。
作为优选方案，在所述S5中，培育用水消毒处理，培育用工具和培育场所均采用50ppm-100ppm过氧化酸溶液消毒处理，培育人员操作时手脚消毒，进入培育场所前替换消毒过的工作服和胶鞋。
通过采用上述方案，对杂交鳢苗种过程中，由于杂交鳢苗种自身的免疫能力尚不完善，配以严格的生物安保措施，可以最大限度防止病毒的入侵，提供苗种的存活率，最终可以培育获得杂交鳢无病毒苗种。
作为优选方案，所述病毒为鳢弹状病毒，在所述S1中，采用鳢弹状病毒灭活疫苗进行免疫。
作为优选方案，在所述S4中，所述受精卵经净化和清水漂洗后，将同一母本的受精卵置于同一孵化空间孵化。
通过采用上述方案，由于亲本存在将病毒遗传给后代的风险，且由于父本的精子与多个母本的卵子受精，导致同一父本的受精卵数量较大，集中孵育不理想，因此将同一母本的受精卵集中孵育，若亲本中携带有病毒，此方法有助于控制病毒的入侵和传播，提高苗种的存活率。
作为优选方案，在所述S3中，所述人工催产后备亲本的激素为绒毛膜促性腺激素、促黄体素释放激素类似物和马来酸地欧酮中的一种或多种。
作为优选方案，在所述S3中，母本的人工催产采用二次注射法，两针间隔10-14小时，母本第一针注射促黄体素释放激素类似物4μg/kg，母本第二针注射绒毛膜促性腺激素1000IU/kg和促黄体素释放激素类似物15μg/kg；
父本的人工催产采用一次注射法，父本注射800IU/kg绒毛膜促性腺激素和2μg/kg促黄体素释放激素类似物，父本在母本注射第二针时注射。
作为优选方案，在所述S2中，筛选出不携带病毒且性成熟的斑鳢作为父本，筛选出不携带病毒且性成熟的乌鳢作为母本。
相比于现有技术，本发明实施例具有如下有益效果：
1、本申请的杂交鳢繁殖技术利用先进的病原检测技术无创筛选亲本，并采用病毒净化手段，杜绝病毒的携带和传播，受精卵经过病毒灭活剂浸泡后可以杀灭病毒和细菌，提高苗种的孵化和培育过程中的成活率，最终可以获得高产量的杂交鳢无病毒苗种，有助于杂交鳢繁育技术的推广。
2、对杂交鳢苗种过程中，由于杂交鳢苗种自身的免疫能力尚不完善，配以严格的生物安保措施，可以最大限度防止病毒的入侵，提高苗种的存活率。
3、进入性成熟阶段的亲本消耗量增大，额外补足营养，可以保证较高的受精率和孵化率，同时增强此时亲本的自身抵抗力，避免由于体能的降低而使病毒有了入侵和繁殖的机会。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本申请发明人经过长期的病害监测和风险评估发现，弹状病毒不但危害杂交鳢的苗种也危害成鱼，这几年苗种的病毒携带率非常高，经常发生全塘苗种因为感染弹状病毒短时间内全部死亡的病例。因此，本发明利用先进的病原检测技术无创筛选亲本，并采用病毒净化，配以严格的生物安保措施进行杂交鳢无特定病毒苗种的培育，繁育技术全程采用无毒化生产工艺，采样本发明繁育的杂交鳢苗种不携带弹状病毒，可以提升苗种培育成活率，提高杂交鳢苗种的产量，且操作简便，可复制易推广，有利于产业的稳定健康发展。
制备例一
一种营养强化剂，包括以下原料组分：
复合维生素：5g；
黄芪多糖：20g；
甘草酸：5g；
虾青素：5g；
N-氨甲酰谷氨酸：10g；
鱼粉：65g。
制备例二
一种营养强化剂，包括以下原料组分：
复合维生素：10g；
黄芪多糖：10g；
甘草酸：10g；
虾青素：10g；
N-氨甲酰谷氨酸：20g；
鱼粉：30g。
制备例三
一种病毒灭活剂，包括以下原料组分：
聚六亚甲基双胍：10g-20g，在本实施例方案中优选为15g；绿原酸：5g-10g，在本实施例方案中优选为6g；
乙二胺四乙酸：5g-10g，在本实施例方案中优选为8g；壳聚糖：2g-3g，在本实施例方案中优选为3g；
去离子水：57g-78g，在本实施例方案中优选为70g。
制备例四
一种病毒灭活剂，包括以下原料组分：
聚六亚甲基双胍：10g-20g，在本实施例方案中优选为15g；绿原酸：5g-10g，在本实施例方案中优选为6g；
乙二胺四乙酸：5g-10g，在本实施例方案中优选为8g；壳聚糖：2g-3g，在本实施例方案中优选为3g；
去离子水：57g-78g，在本实施例方案中优选为70g。
实施例一
一种杂交鳢无弹状病毒苗种繁育方法，具体包括以下步骤：
1、无特定病毒后备亲本的培育
1.1、场地的选择：
选择乌鳢和斑鳢作为杂交鳢后备亲本苗种，选择的乌鳢和斑鳢的后备亲本养殖场环境偏僻独立，水源独立，远离乌鳢和斑鳢苗种繁育和成鱼养殖区域，近3年未发生过弹状病毒案例。
1.2、杂交鳢后备亲本苗种放养前准备：
杂交鳢后备亲本苗种投放前进行病毒检测，确定不携带鳢弹状病毒，再用鳢弹状病毒灭活疫苗进行免疫，免疫剂量和免疫方法按照疫苗说明书进行操作。
1.3、放养及投喂管理：
放养体长在5cm-8cm的杂交鳢后备亲本苗种到鱼塘中，放养密度为3000-5000尾/亩，养殖过程中全程投喂人工配合饲料。
1.4、病毒监测：
每3个月对杂交鳢后备亲本进行病毒检测，每个鱼塘随机挑选30尾鱼，取脑提取RNA后，用数字PCR检测方法检测是否携带鳢弹状病毒，淘汰含有检测结果为阳性的后备亲本的鱼塘，并采取紧急无害处理，留下检测结果均为阴性的后备亲本的鱼塘。
2、无特定病毒后备亲本的筛选和营养强化
2.1、后备亲本的选择
开春后，从步骤1中培育的后备亲本基础上，挑选1龄及以上，体重1kg以上不携带鳢弹状病毒的雄性斑鳢为父本，挑选1龄及以上，体重0.5kg以上不携带鳢弹状病毒的雌性乌鳢为母本；
2.2、亲本的营养强化
将挑选的父本和母本分开放入亲本培育池，每天按照亲本体重的3％投喂人工配合饲料，并添加0.5wt％的制备例1获得的亲本营养强化剂到人工配合饲料中一起投喂，在本实施例方案中，亲本营养强化剂的添加量优选为0.5wt％；
3、人工授精、净化和孵化
3.1、检查待催产的后备亲本
当亲本培育到4月底或5月初，水温稳定达到22℃以上时，检测亲本的性腺发育情况，挑选出生殖孔稍粉红，略凹的斑鳢父本，以及生殖孔略红肿凸出，腹部膨大，头向上竖起时卵巢轮廓明显的乌鳢母本。
3.2、人工催产
乌鳢母本催产采用二次注射法，两针间隔10-14小时，雌鱼第一针注射促黄体素释放激素类似物(LRH-A2)4μg/kg，第二针雌鱼注射绒毛膜促性腺激素(HCG)1000IU/kg和促黄体素释放激素类似物(LRH-A2)15μg/kg，注射部位均为胸鳍基部；
斑鳢父本催产采用一次注射法，雄鱼注射800IU/kg绒毛膜促性腺激素(HCG)和2μg/kg促黄体素释放激素类似物(LRH-A2)，雄鱼在雌鱼注射第二针时注射，注射部位均为胸鳍基部；
催产后开始将乌鳢母本和斑鳢父本分别放在避光恒温的孵化箱中，水温控制在28±2℃。
3.3、人工授精
催产20多个小时后，进行人工授精，具体操作如下：
将斑鳢父本麻醉后解剖，用无菌器械取出精巢，在消毒好的研钵中研碎，并加入0.8％生理盐水稀释保存，同时用碘酒擦拭乌鳢母本的消毒泄殖孔后，用干净的毛巾擦干挤出卵子，并立即将保存的精液倒入装有卵子盆中混匀，并加入新水激活精子，充分搅拌让其充分受精，1尾斑鳢父本的精子可以供5尾乌鳢母本的卵子受精。
3.4、受精卵病毒净化
授精5分钟后，将受精卵转移至含有制备例三获得的病毒灭活剂的容器中进行浸泡净化，浸泡净化时间为30分钟，病毒灭活剂的浓度为20ppm-50ppm，在本方案中优选为50ppm，然后用消毒处理过的清水漂清2次受精卵，并转运至孵化箱进行孵化。
3.5、受精卵孵化
受精卵在50cm*80cm*50cm的塑料箱中孵化，塑料箱放置在室内避光处，水温维持在28±2℃，孵化用水使用前经沉淀、过滤和消毒处理，同一尾乌鳢母本的受精卵放置在同一个塑料箱中，随机从5个箱中取200个受精卵观察孵化情况，孵化率的统计结果如表1所示，受精卵的孵化率总体达到85％以上。
表1-受精卵孵化率统计结果
| 编号 | 受精卵数(颗) | 孵化出苗数量(尾) | 孵化率 |
| 1 | 200 | 183 | 91.5％ |
| 2 | 200 | 176 | 88％ |
| 3 | 200 | 180 | 90％ |
| 4 | 200 | 175 | 87.5％ |
| 5 | 200 | 182 | 91％ |
3.6、水花苗种检测
大约25小时后，水花出膜，每个孵化池采集不少于30尾杂交鳢幼苗，进行病毒检测，保留含有检测结果呈阴性的水花，并转移至水泥池进行苗种培育，淘汰含有检测结果为阳性的水花，并采取紧急无害处理。
4、杂交鳢无病毒苗种的培育
4.1、培育方式
本实例苗种的培育在独立车间中隔离的20m3水泥池中完成，养殖水经过严格消毒处理，配备有增氧设备，溶氧不低于8mg/L，用水泵控制水流，池中水流速度控制在0.1m/s左右，培育密度为0.5-1.0万尾/m3，共放养了25万尾苗种。
4.2、培育前处理
1)所有的养殖用水都经过严格消毒处理；
2)所有的培育池和工具在使用前都要严格消毒，消毒方法为将培育池冲洗干净后，用100ppm的过氧化酸溶液全面泼洒消毒60分钟；
3)所有工具、气管、气石用100ppm的过氧化酸浸泡8h后，冲洗干净方可用；
4)培育人员进入车间操作前要换上干净的工作服和车间专用的胶鞋，手脚用消毒液消毒。
4.3、杂交鳢苗种培育
本实例的水花从出膜后第4天开始投喂净化后的丰年虫幼体，丰年虫幼体净化处理为在投喂前用200ppm的病毒灭活剂浸泡30分钟，随着杂交鳢苗种的长大，逐渐加入人工配合饲料，直至全部驯化吃人工配合饲料。
4.4、杂交鳢无病毒苗种的获得
待杂交鳢长至5cm-6cm时，随机选取30尾杂交鳢进行弹状病毒检测，若检测结果为阳性，则进行无害化处理，若检测结果为阴性，则获得杂交鳢无病毒苗种。
本实施例方案共对5万尾杂交鳢水花苗种进行培育，经过30天的培育，共培育出37万尾平均体长为5.8cm的杂交鳢苗种，统计成活率为74％，苗种经过三次弹状病毒检测，结果均为阴性。
实施例二
一种杂交鳢无弹状病毒苗种繁育方法，各步骤及各步骤的试剂、参数均与实施例一相同，不同的地方在于：
在步骤2.2亲本的营养强化中，营养强化剂采用制备例二获得的营养强化剂替代，营养强化剂的添加量为人工配合饲料的0.3wt％；
在步骤3.4受精卵病毒净化中，病毒灭活剂采用制备例四获得的病毒灭活剂，病毒灭活剂的浓度为20ppm；
所有的培育池和工具在使用前都要严格消毒，消毒方法为将培育池冲洗干净后，用50ppm的过氧化酸溶液全面泼洒消毒30分钟；在步骤4.2培育前处理中，所有工具、气管、气石用50ppm的过氧化酸浸泡6h后，冲洗干净方可用；
在步骤4.3杂交鳢苗种培育中，丰年虫幼体净化处理为在孵化前将虫卵用100ppm的病毒灭活剂浸泡30分钟。
效果验证试验
本申请采用不同浓度的病毒灭活剂和浸泡时间依次对500个杂交鳢受精卵进行试验，以比较验证不同病毒灭活剂浓度和浸泡时间对杂交鳢受精卵孵化效果的影响，试验结果如下：
表1-不同浓度的病毒灭活剂和浸泡时间对受精卵孵化率的影响
由表1可知，高浓度的病毒灭活剂和过长时间的浸泡会降低杂交鳢受精卵的孵化率，因此，本申请采用浓度为20ppm和50ppm的病毒灭活剂对杂交鳢受精卵进行30min浸泡，浸泡的时候保证溶氧充足，可以获得保证杂交鳢受精卵的孵化率达到85％以上，满足繁育的要求。
以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步的详细说明，应当理解，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限定本发明的保护范围。特别指出，对于本领域技术人员来说，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种杂交鳢无弹状病毒苗种繁育方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、选取不携带病毒的后备亲本苗种，进行疫苗免疫，培育过程定期进行病毒抽检，淘汰携带病毒的全部苗种；
S2、筛选出不携带病毒且性成熟的后备亲本，进行产前营养强化；
S3、对后备亲本进行人工催产和人工受精，取得受精卵；
S4、将所述受精卵置于浓度为20ppm-50ppm的病毒灭活剂中进行净化处理，浸泡时间为30min，经清水漂洗后进行苗种孵化，孵化期间进行病毒监测，淘汰携带病毒的全部苗种；
S5、对不携带病毒的苗种进行培育，培育期间进行病毒监测，淘汰携带病毒的全部苗种，结果为阴性即得杂交鳢无病毒苗种。
其中，所述病毒灭活剂包括聚六亚甲基双胍、绿原酸、乙二胺四乙酸、壳聚糖和去离子水。
2.如权利要求1所述的一种杂交鳢无弹状病毒苗种繁育方法，其特征在于，所述病毒灭活剂包括以下重量份原料：
聚六亚甲基双胍：10份-20份；
绿原酸：5份-10份；
乙二胺四乙酸：5份-10份；
壳聚糖：2份-3份；
去离子水：57份-78份。
3.如权利要求1所述的一种杂交鳢无弹状病毒苗种繁育方法，其特征在于，在所述S2中，所述产前营养强化为采用含有亲本营养强化剂的人工配合饲料对后备亲本进行投喂，所述亲本营养强化剂的添加量为每日投喂人工配合饲料的0.3wt％-0.5wt％，所述亲本营养强化剂包括以下重量份原料：
复合维生素：5份-10份；
黄芪多糖：10份-20份；
甘草酸：5份-10份；
虾青素：5份-10份；
N-氨甲酰谷氨酸：10份-20份；
鱼粉：30份-65份。
4.如权利要求1或2所述的一种杂交鳢无弹状病毒苗种繁育方法，其特征在于，在所述S5中，苗种出膜第4天后采用净化后的丰年虫幼体投喂杂交鳢无病毒苗种，并在培育后期投喂人工配合饲料。
5.如权利要求4所述的一种杂交鳢无弹状病毒苗种繁育方法，其特征在于，所述丰年虫幼体的净化方法为投喂前用浓度为100ppm-200ppm的病毒灭活剂浸泡30min。
6.如权利要求1所述的一种杂交鳢无弹状病毒苗种繁育方法，其特征在于，在所述S5中，培育用水消毒处理，培育用工具和培育场所均采用50ppm-100ppm过氧化酸溶液消毒处理，培育人员操作时手脚消毒，进入培育场所前替换消毒过的工作服和胶鞋。
7.如权利要求1所述的一种杂交鳢无弹状病毒苗种繁育方法，其特征在于，所述病毒为鳢弹状病毒，在所述S1中，采用鳢弹状病毒灭活疫苗进行免疫。
8.如权利要求1所述的一种杂交鳢无弹状病毒苗种繁育方法，其特征在于，在所述S4中，所述受精卵经净化和清水漂洗后，将同一母本的受精卵置于同一孵化空间孵化。
9.如权利要求1所述的一种杂交鳢无弹状病毒苗种繁育方法，其特征在于，在所述S3中，所述人工催产亲本的激素为绒毛膜促性腺激素、促黄体素释放激素类似物和马来酸地欧酮中的一种或多种。
10.如权利要求1所述的一种杂交鳢无弹状病毒苗种繁育方法，其特征在于，在所述S2中，筛选出不携带病毒且性成熟的斑鳢作为父本，筛选出不携带病毒且性成熟的乌鳢作为母本。
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