CN113827607A

CN113827607A - 乌苯苷在制备下调肿瘤细胞pd-l1水平的制剂中的应用

Info

Publication number: CN113827607A
Application number: CN202111033779.3A
Authority: CN
Inventors: 刘相国; 苏玲; 李晓鹏; 孙庆国; 王莹莹
Original assignee: Shandong University
Current assignee: Shandong University
Priority date: 2021-09-03
Filing date: 2021-09-03
Publication date: 2021-12-24
Anticipated expiration: 2041-09-03
Also published as: CN113827607B

Abstract

本发明公开了一种乌苯苷在制备下调肿瘤细胞PD‑L1水平的制剂中的应用，其中有效下调肿瘤细胞PD‑L1水平的乌苯苷的浓度为100～200nmol/L。本发明证明了乌苯苷可以通过改变细胞质中Ca²⁺稳态来诱导肿瘤细胞产生内质网应激，干扰PD‑L1正常的糖基化修饰。内质网应激后，PD‑L1进而被RNF19B识别并进行泛素化，最终导向蛋白酶体降解。本发明还揭示RNF19B会影响USP22与PD‑L1的结合，减弱PD‑L1在肿瘤细胞内的稳定性。本发明的应用实现了通过下调肿瘤中的PD‑L1水平抑制肿瘤的发展，为研制开发有关制备下调肿瘤细胞PD‑L1水平的制剂奠定了基础，也为传统药物在肿瘤治疗领域中的二次开发提供了一定的参考和启示，为提高免肿瘤疫疗法的技术手段和临床疗效提供了新的策略。

Description

乌苯苷在制备下调肿瘤细胞PD-L1水平的制剂中的应用

技术领域

本发明涉及钠-钾ATP酶抑制剂乌苯苷的应用，尤其涉及乌苯苷在制备下调肿瘤细胞 PD-L1(Programmed Cell Death 1Ligand 1，细胞程序性死亡受体配体1，又称为CD274或 B7-H1)水平的制剂中的应用，属于生物医药和分子生物学技术领域。

背景技术

PD-L1是存在于肿瘤细胞质膜的糖蛋白，通过与T淋巴细胞表面的PD-1(Programmed Death Receptor1，细胞程序性死亡受体-1)结合后，抑制T细胞的增殖、细胞因子的释放和杀伤能力，最终导致免疫系统功能的抑制。针对PD-1/PD-L1通路目前正在或已经开展的临床实验已有报道，在临床诊治某些癌症，比如黑色素瘤、非小细胞型肺癌、膀胱癌、乳腺癌、淋巴癌以及肾脏细胞癌方面都收获了不错的效果。目前上市的相关药物主要有 pembrolizumab、nivolumab、pidilizuma、durvalumab、atezolizumab等单克隆抗体。但是，随着肿瘤免疫治疗的进一步开展，其使用效率并非尽如人意，脱靶效应、抗药性以及潜在的毒副作用等相继出现。

天然小分子化合物一直是治疗癌症等重点疾病的药物来源，通过药物的筛选寻找具有抗癌活性的小分子化合物，具有快速、经济、简便、有效的特点。天然活性的化合物还可以作为先导物通过适当的结构改造便有望成为新一代的肿瘤免疫治疗药物。因此寻找能够下调肿瘤细胞中PD-L1表达的天然小分子化合物也是目前热门的科研课题。

乌苯苷是一种甾类糖苷，别名g-毒毛旋花苷。用作强心剂。乌苯苷可用于研究钠-钾 ATP酶的特异性抑制剂(k-毒毛旋花苷也有效)，其强心作用也是基于此种抑制作用。乌苯苷作为一种强心苷类化合物在自然界中广泛存在，在临床上主要用于治疗心衰和心律不齐。常见的强心苷主要有地高辛、乌苯苷、夹竹桃苷和蟾毒灵几类。强心苷的作用位点为质膜上的Na⁺-K⁺-ATPase(NKA)。对于乌苯苷的相关实验表明，乌苯苷对于机体免疫具有一定的影响。

乌苯苷可以活化免疫细胞以及提高免疫细胞抵抗自身凋亡的能力，以此来消除癌细胞产生的免疫抑制。然而，检索发现乌苯苷对肿瘤细胞中PD-L1的相关影响目前尚未见报道。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明要解决的问题是提供一种乌苯苷在制备下调肿瘤细胞PD- L1水平的制剂中的应用。

本发明所述乌苯苷在制备下调肿瘤细胞PD-L1水平的制剂中的应用。

其中：有效下调肿瘤细胞PD-L1水平的乌苯苷的浓度为100～200nmol/L。所述的肿瘤为PD-L1受体天然高表达或因为肿瘤的治疗导致PD-L1受体高表达的肿瘤。

优选的，有效下调肿瘤细胞PD-L1水平的乌苯苷的浓度为200nmol/L。所述的肿瘤为非小细胞肺癌。

本发明提供了一种针对PD-L1泛素化的调控方式，有助于进一步了解PD-L1有关的分子机制，为设计相关药物提供理论依据。

本发明揭示了乌苯苷在抗肿瘤免疫反应中的潜力，为传统药物在肿瘤治疗领域中的二次开发提供了一定的参考和启示。

为了更好地理解本发明的实质，下面用乌苯苷的生化和细胞实验及结果来阐明其在制备下调肿瘤细胞PD-L1水平的制剂及其相关研究中的应用。

采用生物化学、细胞生物学和分子生物学的方法，进行如下实验：

1、乌苯苷下调肺癌细胞PD-L1蛋白水平呈现明显的浓度与时间依赖性

N-连接的糖基化是PD-L1翻译后修饰中最为重要的一个方式，不成熟的非糖基化形式的PD-L1结构极其不稳定，会被细胞中有关的蛋白质降解系统识别降解。PD-L1分子上的糖链结构会明显增强PD-L1与T细胞表面PD-1的结合并且这种亲和力的上升也会提高肿瘤细胞免疫逃逸的效率。

将1.0×10⁵个细胞/ml的H157细胞种于12孔的细胞培养板中，待细胞数量增长到约60％左右，加入不同浓度的乌苯苷(Ouabain)处理，24h后观察细胞状态并收集细胞，通过 Western blot检测糖基化和非糖基化的PD-L1蛋白水平。

在H1792、H1299、H460和A549中，使用不同浓度的乌苯苷处理细胞后继续培养12h，通过Western blot检测PD-L1和USP22蛋白水平。(USP22是一个去泛素化酶，可以维持 PD-L1分子在细胞中的稳定表达)。在H157和H460使用200nmol/L的乌苯苷处理不同时间后，通过Western blot检测PD-L1和USP22蛋白水平。

在H1792和A549中，使用200nmol/L的乌苯苷处理12h后，提取总的RNA进行反转录，获得cDNA，再利用获得的cDNA为模板，以PD-L1基因设计的上下游引物进行PCR 扩增PD-L1的基因序列，再进行1％琼脂糖凝胶电泳以检测PD-L1的转录情况。

结果表明：(1)随着乌苯苷的处理浓度的上升，PD-L1糖基化逐渐下降的同时伴随着非糖基化PD-L1的上升，说明乌苯苷干扰了PD-L1的正常合成(图8)。(2)乌苯苷对PD-L1的下调在H460、A549、H1792以及H1299中均显示出浓度依赖效应，并且在H157和H460 中，乌苯苷对PD-L1的影响也存在时间依赖性(图1A、1B)。(3)乌苯苷处理后PD-L1的转录水平无变化趋势(图1C),说明乌苯苷对PD-L1的影响不是发生在转录水平上的。

2、乌苯苷可以通过改变细胞质中Ca²⁺稳态来诱导肿瘤细胞产生内质网应激，乌苯苷对 PD-L1的下调依赖蛋白酶体途径而非溶酶体途径

乌苯苷对PD-L1进行调控不是在转录水平上，那么PD-L1的下调只可能在翻译或翻译后过程中出现了问题，PD-L1的非糖基化形式在乌苯苷处理下明显上升，说明PD-L1在内质网的合成出现了问题。CHOP或p-eIF2α是内质网应激(ER Stress)的标志蛋白，在H460和A549中使用浓度为0、100、200nmol/L的乌苯苷处理后，通过Western blot检测ER Stress的标志蛋白CHOP的变化。在H460和A549中使用1mol/L的4-PBA(4-PBA是常用的ER Stress抑制剂)预处理1h后，再加入200nmol/L的乌苯苷继续处理12h。12h后通过Western blot检测PD-L1、CHOP和p-eIF2α的变化。乌苯苷作用于质膜上的Na+-K+-ATPase，而 Na+-K+-ATPase牵涉多条能够引起细胞质中Ca²⁺水平上升的信号通路。在A549和H1792细胞系，加入10μmol/L的(Ca²⁺的螯合剂)BAPTA/AM预处理1h后再加入200nmol/L乌苯苷继续培养12h后，通过Western blot检测PD-L1、ER Stress的标志蛋白CHOP的水平。

在A549和H1792两个肺癌细胞系中分别使用20μmol/L的蛋白酶体抑制剂MG132和15μmol/L的溶酶体抑制剂CQ处理阻断各自的降解途径。200nmol/L乌苯苷处理4h后分别加入MG132和CQ后继续培养8h。收集细胞，通过Western blot检测PD-L1和ACTB的水平，检测乌苯苷对PD-L1的下调所依赖的途径。

结果表明：(1)随着乌苯苷处理浓度的上升，CHOP或p-eIF2α在肿瘤细胞中的蛋白含量出现增高，4-PBA处理后，在一定程度阻止了乌苯苷介导的ER Stress的产生，同时也阻止了乌苯苷下调PD-L1的强度(图2A、2B)。使用Ca²⁺的螯合剂BAPTA/AM与乌苯苷同时处理细胞，内质网应激标志物CHOP的上升受到了抑制，与此PD-L1含量的下降也出现减弱(图2C)。说明乌苯苷可以通过打破Ca²⁺的平衡，让肿瘤细胞处于内质网应激状态，干扰了PD-L1的合成。(2)与蛋白酶体抑制剂MG132联合处理能抑制乌苯苷引起的PD-L1下调，而联合使用溶酶体抑制剂CQ与乌苯苷单独处理相比二者无明显变化(图2D)，说明乌苯苷对PD-L1的下调依赖蛋白酶体途径而非溶酶体途径。

3、RNF19B与PD-L1存在相互作用

由于PD-L1的糖基化对其蛋白稳定性很重要，因此本申请中构建两种关于PD-L1的质粒，一种是pcDNA3.1-FLAG-PD-L1，它能表达正常糖基化形式的PD-L1；另一种是pcDNA3.1-FLAG-PD-L1(3NQ)，它将PD-L1主要的三个糖基化位点(N192、N200和N219) 突变，使其无法正常糖基化，最终以不成熟的非糖基化形式存在于内质网中。乌苯苷介导 PD-L1是通过蛋白酶体途径完成的。蛋白质的降解通常需要E3 Ligase的加入，RNF19B是一种E3Ligase。在HEK293FT细胞中过表达pcDNA3.1-FLAG-PD-L1、pcDNA3.1-FLAG- PD-L1(3NQ)、pcDNA3.1-V5-RNF19B质粒，使用FLAG蛋白抗体进行Co-IP实验。通过 Western blot检测RNF19B与PD-L1(WT)和PD-L1(3NQ)的结合情况。在H1299中过表达pcDNA3.1-FLAG-PD-L1、pcDNA3.1-FLAG-PD-L1(3NQ)的质粒，利用FLAG抗体进行 CO-IP实验，通过Western blot检测内源蛋白RNF19B与PD-L1两种形式的结合。

结果表明：RNF19B与糖基化和非糖基化PD-L1均存在相互作用(图3A、3B)。另外，通过Co-IP实验验证RNF19B能与内源PD-L1结合(图3C)。

4、RNF19B影响PD-L1蛋白水平

在A549和H1792中过表达RNF19B，在收集细胞12h前向细胞中加入200nmol/L的乌苯苷继续处理12h，通过Western blot检测PD-L1、CHOP、ACTB、的表达情况。在A549 和H1792中使用RNF19B的siRNA干扰RNF19B的表达同时使用200nmol/L的乌苯苷处理 12h，通过Western blot检测PD-L1、RNF19B、CHOP、ACTB的表达情况。

结果表明：在A549和H1792细胞中使用乌苯苷诱发内质网应激并且过表达RNF19B后，加速了PD-L1的降解，使癌细胞中PD-L1的总量出现明显的下降(图4A)，使用RNF19B 的siRNA干扰RNF19B后，乌苯苷引起的PD-L1下降的力度就会受到抑制(图4B、4C)。说明RNF19B影响PD-L1蛋白水平。

5、乌苯苷处理下RNF19B增强PD-L1的泛素化，RNF19B对非糖基化的PD-L1的亲和力以及泛素化水平较强

在H1299中过表达pcDNA3.1-V5-RNF19B、pcDNA3.1-FLAG-PD-L1或pcDNA3.1-FLAG-PD-L1(3NQ)、pcDNA3.1-HA-UB，进行Co-IP实验，通过Western blot检测糖基化和非糖基化PD-L1的泛素化水平。在H1299和A549中过表达pcDNA3.1-V5-RNF19B、 pcDNA3.1-FLAG-PD-L1或pcDNA3.1-FLAG-PD-L1(3NQ)、pcDNA3.1-HA-UB同时使用 200nmol/L乌苯苷处理12h，进行Co-IP实验，通过Western blot检测糖基化和非糖基化的 PD-L1的泛素化水平。

在H1299和H1792细胞中转染pcDNA3.1-V5-RNF19B、pcDNA3.1-FLAG-PD-L1、pcDNA3.1-FLAG-PD-L1(3NQ)、pcDNA3.1-HA-UB质粒，进行Co-IP实验，通过Western blot检测RNF19B与两种形式PD-L1的结合情况以及泛素化水平。在H1299细胞中转染 pcDNA3.1-V5-RNF19B、pcDNA3.1-FLAG-PD-L1(3NQ)、pcDNA3.1-HA-UB，使用1mmol/L 的4-PBA(ERStress的抑制剂)预处理30min后加入200nmol/L的乌苯苷继续处理12h，收集细胞8h前加入20μmol/L的MG132处理，收集细胞进行Co-IP实验，通过Western blot检测RNF19B对非糖基化的PD-L1的泛素化水平。在H1299中转染pcDNA3.1-V5-RNF19B、 pcDNA3.1-FLAG-PD-L1(3NQ)质粒，培养过夜后将细胞固定，进行免疫荧光染色，在激光共聚焦显微镜下拍照观察二者共定位情况。

结果表明：(1)乌苯苷处理下RNF19B增强PD-L1的泛素化。过表达RNF19B并同时使用乌苯苷诱导ER Stress后，RNF19B可以对糖基化和非糖基化形式的PD-L1的泛素化起到促进的作用(图5B、5C)。如果不使用乌苯苷处理，单纯的过表达RNF19B，对于PD-L1两种形式的泛素化的影响是比较小的(图5A)。说明了RNF19B是PD-L1 的E3泛素连接酶，在乌苯苷介导PD-L1的下降过程中，RNF19B参与了PD-L1的泛素化过程。(2)RNF19B对非糖基化的PD-L1的亲和力以及泛素化水平较强。(图5D和 5E)。使用免疫荧光共聚焦技术，观察到非糖基化的PD-L1与RNF19B之间存在共定位 (图5G)，说明RNF19B对PD-L1的调控一方面主要是在细胞质中进行，这个过程主要是RNF19B对于不成熟的PD-L1进行泛素化识别并降解。(3)使用ER Stress的抑制剂4-PBA处理细胞，抑制ER Stress后，RNF19B对非糖基化PD-L1的泛素水平也明显降低(图5F)，说明乌苯苷引发ER Stress后会通过RNF19B对PD-L1进行泛素化。

6、RNF19B通过其(252～732)段结构区域(其核苷酸序列见SEQ ID No.8)与PD-L1的胞质段发生结合

本申请中，针对RNF19B的结构特性设计并构建了它的几个分段(图6E)，分别是RNF19B(1-167)(其核苷酸序列见SEQ ID No.5)、RNF19B(1-252)(其核苷酸序列见SEQ IDNo.6)、RNF19B(167-732)(其核苷酸序列见SEQ ID No.7)、RNF19B(252-732)(其核苷酸序列见SEQ ID No.8)、RNF19B(319-732)(其核苷酸序列见SEQ ID No.9)的5个分段质粒，也构建了PD-L1的分段形式：全长pEGFPC2-PD-L1，胞外段与跨膜区pEGFPC2-PD- L1(1-259)(其核苷酸序列见SEQ ID No.2)，跨膜区与胞内段pEGFPC2-PD-L1(239-290)(其核苷酸序列见SEQ ID No.3)。在HEK293FT细胞中转染pcDNA3.1-V5-RNF19B，pEGFPC2- PD-L1，pEGFPC2-PD-L1(1-259)，pEGFPC2-PD-L1(239-290)质粒，使用20μmol/L的MG132 处理6h后收集细胞，进行Co-IP实验，通过Western blot检测RNF19B与PD-L1分段的结合情况。

在HEK293FT细胞中转染RNF19B的五个分段质粒以及PD-L1(WT)/PD-L1(3NQ)的质粒，收集细胞6h前加入20μmol/L的MG132，进行Co-IP实验，通过Western blot检测 RNF19B的分段与PD-L1两种形式的结合情况。

同时，本申请中构建了PD-L1胞质区域的5个泛素化位点突变的质粒pcDNA3.1-T7-PD- L1(K5R)，这5个位点分别是K263、K270、K271、K280、K281。在HEK293FT细胞中转染pcDNA3.1-V5-RNF19B，pcDNA3.1-T7-PD-L1，pcDNA3.1-T7-PD-L1(K5R)三种质粒，使用 20μmol/L的MG132处理6h后收集细胞，进行Co-IP实验，通过Western blot检测RNF19B 与胞质区5个Lys泛素化位点突变PD-L1的结合情况。

结果表明：(1)在肿瘤细胞中RNF19B会与PD-L1的胞质段存在相互结合(图6A)，从而介导PD-L1的泛素化过程。(2)在HEK293FT细胞中转染PD-L1(WT)以及RNF19B 的5个分段、PD-L1(3NQ)以及RNF19B的5个分段，通过Co-IP实验发现RNF19B的 167-732(其核苷酸序列见SEQ ID No.7)、252-732(其核苷酸序列见SEQ ID No.8)、319- 732(其核苷酸序列见SEQID No.9)的氨基酸序列与PD-L1都存在结合，但各自的结合强度不同(图6C、6D)。RNF19B的167-732氨基酸序列中包括了RNF19B的两个活性区域 IBR区域和RING2区域，当这两个区域同时存在时，RNF19B与PD-L1的结合最强，如果没有IBR区域只有RING2结构域时RNF19B也可以与PD-L1结合但结合的能力没有上一个分段强。如果两个区域都不存在，RNF19B与PD-L1的结合能力将大为减弱。这就说明 RNF19B与PD-L1结合时关键的区域就是RING2结构域。(3)在HEK293FT细胞中通过 Co-IP实验发现RNF19B无法与5个泛素化位点突变的PD-L1继续结合(图6B)。由此说明 RNF19B要想对PD-L1进行泛素化，必须先与PD-L1的胞质区域结合，并且胞质区域的5个泛素化位点对于RNF19B与PD-L1的结合至关重要。

7、RNF19B影响USP22与PD-L1的结合。

USP22是一个去泛素化酶，可以维持PD-L1分子在细胞中的稳定表达。在HEK293FT细胞中过表达pcDNA3.1-V5-RNF19B、pcDNA3.1-HA-USP22质粒，使用20μmol/L的 MG132处理6h后收集细胞，进行Co-IP实验，通过Western blot检测RNF19B与USP22的结合。

在HEK293FT细胞中过表达pcDNA3.1-V5-RNF19B、pcDNA3.1-HA-USP22、 pcDNA3.1-FLAG-PD-L1质粒，使用20μmol/L的MG132处理6h后收集细胞，进行Co-IP实验，通过Westernblot检测RNF19B对于PD-L1和USP22的结合的影响。在A549和H1299 细胞中过表达pcDNA3.1-V5-RNF19B、pcDNA3.1-HA-USP22、pcDNA3.1-HIS-UB，加入或不加200nmol/L的乌苯苷处理6h，使用20μmol/L的MG132处理6h后收集细胞，进行Co- IP实验，检测在乌苯苷存在或不存在的条件下RNF19B对USP22泛素化。

结果表明：(1)Co-IP实验发现RNF19B与USP22存在相互结合(图7A)。(2)Co-IP 实验发现RNF19B减少了PD-L1与USP22的结合(图7B)。增加了PD-L1的不稳定性。过表达RNF19B后，USP22的泛素化并没有增加(图7C)，这就是说明RNF19B在整个过程中通过影响USP22与PD-L1的结合从而使PD-L1暴露出自己的泛素化位点。证实RNF19B是在ER Stress下影响PD-L1的水平而不是通过降低USP22的水平间接来影响PD-L1的含量。

由上述实验及其结果，可以得出如下结论：

在非小细胞肺癌中，乌苯苷可以通过作用质膜上的钠钾泵引起Ca²⁺稳态的失衡，诱发内质网应激的产生。内质网应激下，PD-L1正常的糖基化修饰受到干扰，非糖基化的PD-L1 进而被RNF19B识别并进行泛素化，最终导向蛋白酶体降解。同时，RNF19B不仅可以对非糖基化PD-L1起到下调的作用，同时也会对成熟的PD-L1起到同样的效果。此外，在整个过程中，RNF19B会影响USP22与PD-L1的结合，降低USP22对PD-L1的保护，增加PD- L1在肿瘤细胞内的不稳定性。所有的结果最终导致了肿瘤细胞中PD-L1水平的显著下降。

本发明的有益效果体现在：

本发明提供了乌苯苷在制备下调肿瘤细胞PD-L1水平的制剂中的应用。其中：能有效下调肿瘤细胞PD-L1水平的乌苯苷的浓度为100～200nmol/L。并进一步证实乌苯苷可以通过下调肿瘤中的PD-L1水平抑制肿瘤的发展和乌苯苷在抗肿瘤免疫反应中的应用潜力。同时本发明公开的乌苯苷为研制开发有关制备下调肿瘤细胞PD-L1水平的制剂奠定了基础，也为传统药物在肿瘤治疗领域中的二次开发提供了一定的参考和启示。

本发明提供的针对PD-L1泛素化的调控方式，有助于进一步了解PD-L1有关的分子机制，为设计相关药物提供了理论依据，为了解肿瘤逃逸的基本机制提供了理论基础，也拓展了乌苯苷在抗肿瘤免疫治疗领域的应用，为提高肿瘤免疫疗法的技术手段和临床疗效提供了新的策略。

附图说明

图1为乌苯苷下调肺癌细胞PD-L1蛋白水平呈现明显的浓度与时间依赖性

其中，图1A为在H1792、H1299、H460和A549中，使用不同浓度的乌苯苷处理细胞后继续培养12h，Western blot检测蛋白发现PD-L1和USP22的水平均随着乌苯苷处理浓度的上升而下降，呈现明显的浓度依赖效应。图1B为在H157和H460使用200nmol/L的乌苯苷处理不同时间后，Western blot检测蛋白发现随着处理时间的增多，PD-L1和USP22也继续下降。图1C为在H1792和A549中，使用200nmol/L的乌苯苷处理12h后，提取总的 RNA进行反转录，获得cDNA。利用获得的cDNA为模板，以PD-L1基因设计的上下游引物进行PCR扩增PD-L1的基因序列，再进行1％琼脂糖凝胶电泳以检测PD-L1的转录情况。

图2为乌苯苷可以通过改变细胞质中Ca²⁺稳态来诱导肿瘤细胞产生内质网应激，乌苯苷对PD-L1的下调依赖蛋白酶体途径而非溶酶体途径

其中，图2A为在H460和A549中使用浓度为0、100、200nmol/L的乌苯苷处理后，进行WB检测ER Stress的标志蛋白CHOP的变化。图2B为在H460和A549中使用1mol/L的 4-PBA(4-PBA时常用的ER Stress抑制剂)预处理30min后，再加入200nmol/L的乌苯苷继续处理12h。12h后检测PD-L1和CHOP和p-eIF2α的变化。图2C为使用A549和H1792两种NSCLC细胞系，加入10μmol/L的BAPTA/AM预处理1h后再加入200nmol/L乌苯苷继续培养12h后，进行WB检测PD-L1、CHOP和ACTB的水平。图2D为在A549和H1792两个肺癌细胞系中分别使用20μmol/L的蛋白酶体抑制剂MG132和15μmol/L的溶酶体抑制剂 CQ处理阻断各自的降解途径。200nmol/L乌苯苷处理4h后分别加入MG132和CQ后继续培养8h。收集细胞，WB检测PD-L1和ACTB的水平。

图3为RNF19B与PD-L1相互作用

其中，图3A、3B为在HEK293FT细胞中过表达pcDNA3.1-FLAG-PD-L1、pcDNA3.1-FLAG-PD-L1(3NQ)、pcDNA3.1-V5-RNF19B质粒，使用FLAG蛋白抗体进行Co-IP实验。通过WB检测RNF19B与PD-L1(WT)和PD-L1(3NQ)的结合情况。图3C为在H1299 中过表达pcDNA3.1-FLAG-PD-L1、pcDNA3.1-FLAG-PD-L1(3NQ)的质粒，利用FLAG抗体进行CO-IP实验，检测内源蛋白RNF19B与PD-L1两种形式的结合。

图4为RNF19B影响PD-L1水平

其中，图4A为在A549和H1792中过表达RNF19B，在收集细胞前12h向细胞中加入200nmol/L的乌苯苷继续处理12h，收集细胞并制样跑胶，通过WB检测PD-L1、CHOP、 ACTB的表达情况。图4B为在A549和H1792中使用RNF19B的siRNA敲低RNF19B的表达同时使用200nmol/L的乌苯苷处理12h，通过WB检测PD-L1、RNF19B、CHOP、ACTB 的表达情况。

图5为乌苯苷处理下RNF19B增强PD-L1的泛素化，RNF19B对非糖基化的PD-L1的亲和力以及泛素化水平较强

其中，图5A为在H1299中过表达pcDNA3.1-V5-RNF19B、pcDNA3.1-FLAG-PD-L1或pcDNA3.1-FLAG-PD-L1(3NQ)、pcDNA3.1-HA-UB，通过免疫共沉淀检测PD-L1糖基化和非糖基化的泛素化水平。图5B、5C为在H1299和A549中过表达pcDNA3.1-V5-RNF19B、 pcDNA3.1-FLAG-PD-L1或pcDNA3.1-FLAG-PD-L1(3NQ)、pcDNA3.1-HA-UB同时使用 200nmol/L乌苯苷处理12h，通过免疫共沉淀检测PD-L1糖基化和非糖基化的泛素化水平。图5D、5E为在H1299和H1792细胞中转染pcDNA3.1-V5-RNF19B、pcDNA3.1-FLAG-PD- L1、pcDNA3.1-FLAG-PD-L1(3NQ)、pcDNA3.1-HA-UB质粒，通过免疫共沉淀以及WB检测RNF19B与两种形式PD-L1的结合情况以及泛素化水平。图5F为在H1299细胞中转染 pcDNA3.1-V5-RNF19B、pcDNA3.1-FLAG-PD-L1(3NQ)、pcDNA3.1-HA-UB，使用1mmol/L 的4-PBA预处理30min后加入200nmol/L的乌苯苷继续处理12h，收集细胞前8h加入 20μmol/L的MG132处理，收集细胞通过Co-IP检测RNF19B对非糖基化PD-L1的泛素化水平。图5G为在H1299中转染pcDNA3.1-V5-RNF19B、pcDNA3.1-FLAG-PD-L1(3NQ)质粒，培养过夜后将细胞固定，进行荧光染色，在激光共聚焦显微镜下拍照观察二者共定位情况。

图6为RNF19B通过其(252～732)段结构区域(其核苷酸序列见SEQ ID No.8)与PD-L1的胞质段发生结合

其中，图6A为在HEK293FT细胞中转染pcDNA3.1-V5-RNF19B,pEGFPC2-PD- L1,pEGFPC2-PD-L1(1-259)，pEGFPC2-PD-L1(239-290)三种质粒，使用20μmol/L的MG132 处理6h后收集细胞，通过Co-IP实验检测RNF19B与PD-L1分段的结合情况。图6B为在 HEK293FT细胞中转染pcDNA3.1-V5-RNF19B，pcDNA3.1-T7-PD-L1，pcDNA3.1-T7-PD- L1(K5R)三种质粒，使用20μmol/L的MG132处理6h后收集细胞，通过Co-IP实验检测RNF19B与胞质区5个Lys泛素化位点突变PD-L1的结合情况。图6C、6D为在HEK293FT 细胞中转染RNF19B的五个分段质粒以及PD-L1(WT)/PD-L1(3NQ)的质粒，收集细胞前 6h加入20μmol/L的MG132，收集细胞通过Co-IP实验检测RNF19B的分段与PD-L1两种形式的结合情况。图6E为RNF19B的结构域分段：全长按结构域(深色标记段)划分，其中左数第1段为RING1区域，左数第2段为IBR区域，左数第3段为RING2区域，左数第4 和第5段为TM区域(跨膜区域)。

图7为RNF19B影响USP22与PD-L1的结合

其中，图7A为在HEK293FT细胞中过表达pcDNA3.1-V5-RNF19B、pcDNA3.1-HA-USP22质粒。利用HA蛋白抗体进行免疫共沉淀实验，通过WB检测RNF19B与USP22的结合。图7B为在HEK293FT细胞中过表达pcDNA3.1-V5-RNF19B、pcDNA3.1-HA-USP22、 pcDNA3.1-FLAG-PD-L1质粒，使用FLAG抗体进行免疫共沉淀实验，通过WB检测 RNF19B对于PD-L1和USP22的结合。图7C为在A549和H1299细胞中过表达pcDNA3.1- V5-RNF19B、pcDNA3.1-HA-USP22、pcDNA3.1-HIS-UB，使用HA抗体进行免疫共沉淀，通过WB检测RNF19B在乌苯苷存在或不存在的条件下对USP22泛素化。

图8为乌苯苷下调肺癌细胞糖基化PD-L1蛋白水平

其中显示，将1.0×10⁵个细胞/ml的H157细胞种于12孔的细胞培养板中，待细胞数量增长到约60％左右，加入不同浓度的乌苯苷(Ouabain)溶液，24h后观察细胞状态并收集细胞进行WB检测糖基化和非糖基化的PD-L1蛋白水平的结果。

具体实施方式

下面结合具体附图和实施例对本发明内容进行详细说明。如下所述例子仅是本发明的较佳实施方式而已，应该说明的是，下述说明仅仅是为了解释本发明，并非对本发明作任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对实施方式所做的任何简单修改，等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围内。

下述实施例中，所使用的材料、质粒、试剂等，如无特殊说明，均从商业途径得到。

其中：乌苯苷(Ouabain)购自Selleck；人非小细胞型肺癌细胞系(NSCLC)：H460、H1792、A549、H157、H1299、Calu-1均购自美国ATCC；人胚肾细胞系：HEK293FT、 HEK293T购自Invitrogen。

本发明实施例中涉及的质粒有：pcDNA3.1-FLAG-PD-L1、pcDNA3.1-HA-UB、pcDNA3.1-HIS-UB、pEGFPC2-PD-L1、pEGFPC2-PD-L1(1-259)、pEGFPC2-PD-L1(239- 290)、pcDNA3.1-T7-PD-L1、pcDNA3.1-HA-USP22、pcDNA3.1-V5-RNF19B(1-167)、 pcDNA3.1-V5-RNF19B(1-252)、pcDNA3.1-V5-RNF19B(167-732)、pcDNA3.1-V5-RNF19B (252-732)、pcDNA3.1-V5-RNF19B(319-732)、pcDNA3.1-FLAG-PD-L1(3NQ)、pcDNA3.1- T7-PD-L1(K5R)、pcDNA3.1-V5-RNF19B。其构建均采用常规分子生物学方法，其中以 pcDNA3.1-FLAG-PD-L1质粒为例具体构建方法如下：

1、肿瘤细胞RNA提取

(1)细胞培养在6孔板中，提取RNA前先用真空吸泵吸出培养板中的培养基溶液，之后加入1×PBS磷酸缓冲溶液清洗一遍，吸去残留的液体。

(2)向每个6孔板中加入500μL的TRIZOL溶液进行裂解，裂解时应用移液器反复吹打以使细胞完全破裂，之后将6孔板放在室温的条件下静置5分钟。

(3)静置后将上述所得的裂解液放入高压灭菌的无RNase的1.5mL的离心管中。之后再加入100μL的氯仿溶液进行15s左右的充分摇晃，最后再在室温条件下静置2分钟。

(4)2分钟静置后，将离心管放入4摄氏度的低温离心机中离心15分钟，转速为12000g。

(5)离心完成后，溶液明显分为上中下三层，使用移液器将上层的液体吸入到新的离心管中，再加入250μL的异丙醇溶液。体系混匀后放于室温下静置10分钟。

(6)静置完成后，将离心管放入4摄氏度离心机中，转速12000g时间10分钟。

(7)离心后，使用移液器将上清小心去除，之后再向离心管中加入500μL用DEPC 水配置的75％的乙醇溶液，轻轻弹匀后，放于4摄氏度离心机中，转速7500g离心5分钟。此过程重复两遍。

(8)使用移液器将上清液全部弃去，将离心管管口朝下放于无菌的吸水纸上自然晾干。

(9)晾干过程中可以清晰看见离心管底部白色沉淀变得越来越透明，之后加入40μL 的DEPC水，轻轻弹匀沉淀使底物的RNA全部溶解。

(10)使用分光光度计测量提取的RNA的纯度和浓度。

2、反转录过程

(1)该过程加样全程在冰盒上进行。取反转录试剂盒于冰上。

(2)取高压灭菌后的PCR小管，向其中加入1μL的Oligo(dT)和1μg的提取的RNA (计算RNA所加的体积)，剩余的的体积使用无菌超纯水补齐到13μL，轻轻混匀后，在高速离心机中短离10秒。

(3)离心后将PCR小管放入PCR仪中，65摄氏度进行反应，设定反应时间为时间 10分钟。

(4)反应完成后取出PCR管，再向其加入4μL的5×Reaction buffer和0.5μL的RNase 抑制剂和0.5μL的逆转录酶以及2μL的dNTP溶液，轻轻混匀，进行瞬时离心。

(5)离心后，将PCR管再次放置于PCR仪中，设定程序为先55摄氏度进行30分钟的反应，然后再进行85摄氏度5分钟的反应，最后反应完成后放入-20摄氏度保存。

3、目的基因克隆

(1)基因克隆使用的PCR体系：

试剂名称加入体积

2×PrimeSTAR Max Premix 5μL

10μmol/L的PD-L1上游引物 0.4μL

10μmol/L的PD-L1下游引物 0.4μL

模板cDNA 0.4μL

双蒸水 3.8μL

总体积 10μL

PD-L1基因上下游引物序列如下：

pcDNA3.1-PD-L1-FLAG FWD:

CGGTACCGCCGCCACCATGAGGATATTTGCTGTCTTTATATTC

pcDNA3.1-PD-L1-FLAG REV:

CCTCGAGTTACTTGTCGTCATCGTCTTTGTAGTCCGTCTCCTCCAAATGT

GTATC

(2)PCR反应时间和温度设定：

温度设定时间设定

98摄氏度 2分钟

98摄氏度 10秒

53摄氏度 15秒

72摄氏度 30秒

72摄氏度 7分钟

4摄氏度保存

注：PCR循环数设定为35个循环。

(3)加A反应：取30μL的PCR终产物于新的PCR管中，向其中加入DNA Taq聚合酶0.3μL，轻轻混匀后放于PCR仪中进行72摄氏度20分钟的反应过程。

(4)目的基因的片段与T载体的连接：

试剂名称体积

PD-L1基因PCR产物 4μL

pMD19-T Vector 1μL

Solution Ⅰ 5μL

双蒸水补齐体积至 10μL

放于PCR仪中16摄氏度过夜进行T载体连接

4、质粒表达载体构建

(1)从-80摄氏度冰箱中取10μL的大肠杆菌感受态细胞，放置于冰盒上

(2)向感受态细胞中加入3-5μL的基因与T载体连接的产物，轻轻混匀后在冰盒上静置30分钟。

(3)冰上静置完成后，在42摄氏度的恒温水浴锅中进行热激反应90秒，紧接着再放入冰上静置2分钟。

(4)静置后向离心管中加入500μL的液体LB培养基，在37摄氏度细菌培养要床上震动培养1h。

(5)1h后使用移液器将500μL的上述菌液加入含有抗生素的LB固体培养基中，抗生素的选取要根据所连接的载体所带的抗性基因决定。

(6)细菌涂布后，将细菌平板在37摄氏度细菌培养箱中倒置培养一夜。

(7)取合适数量的1.5mL的离心管，向其中加入15μL的无菌水，之后根据平板上长出的菌落，挑取一定数量的单菌株放入无菌水中。

(8)挑取完成后，向离心管中加入15μL的的酚氯仿异戊醇溶液，使用涡旋振荡仪充分裂解细菌。

(9)裂解完成后，在常温下进行离心，12000g离心10分钟，离心后溶液分为三层，取上层溶液进行琼脂糖凝胶电泳验证。

(10)根据电泳结果挑选连接成功的菌落，进行摇菌步骤。先在5mL摇菌管中加入液体LB培养基以及1‰的抗生素，后挑取选定的单菌落放入其中在细菌培养箱中震荡培养16h。

(11)提取质粒，质粒的提取使用小提中量质粒提取试剂盒。

(12)将提取的质粒送入生物公司测基因序列，比对基因序列是否与目的基因序列一致。

(13)对连接上PD-L1基因片段的T载体以及质粒表达载体pcDNA3.1进行相同的限制性内切酶KpnI和XhoI酶切，酶切结束后，进行琼脂糖凝胶电泳验证。酶切体系如下：

试剂名称体积

10×快切酶buffer 3μL

限制性内切酶KpnI 1.5μL

限制性内切酶XhoI 1.5μL

质粒表达载体pcDNA3.1/连接PD-L1基因的T载体 4μg

双蒸水补齐体积到 30μL

(14)验证成功后，将琼脂糖凝胶电泳上的条带切割下来进行胶回收，提纯DNA。

(15)胶回收的PD-L1基因片段与质粒表达载体按照如下体系进行连接：

试剂名称体积

胶回收的PD-L1基因片段 3.7μL

质粒表达载体pcDNA3.1片段 0.3μL

T4-DNA连接酶 1μL

T4-DNA连接酶buffer 1μL

双蒸水补齐体积至 10μL

5、蛋白验证

选取构建测序正确的质粒转染细胞，收集细胞，做western blot，验证蛋白是否过表达。

除上述pcDNA3.1-FLAG-PD-L1质粒构建外，所述其他质粒的构建步骤也同上，不同的是各质粒所需上下游引物序列如下：

pEGFPC2-PD-L1(1-259)FWD:

CCTCGAGGCCGCCACCATGAGGATATTTGCTGTCTTTATATTC

pEGFPC2-PD-L1(1-259)REV:

CGGTACCTTAGAAGATGAATGTCAGTGCTACACC

pEGFPC2-PD-L1(239-290)FWD:

CCTCGAGGCCGCCACCATGACTCACTTGGTAATTCTGG

pEGFPC2-PD-L1(239-290)REV:

CGGTACCTTACGTCTCCTCCAAATGTGTATC

pcDNA3.1-V5-RNF19B(1-167)FWD:

CAAGCTTGCCGCCACCATGGGCTCCGAGAAGGACTC

pcDNA3.1-V5-RNF19B(1-167)REV:

CCTCGAGTCACGTAGAATCGAGACCGAGGAGAGGGTTAGGGATAGGCTTACCGCT

GCACTCGGGGCAGCTG

pcDNA3.1-V5-RNF19B(1-252)FWD:

CAAGCTTGCCGCCACCATGGGCTCCGAGAAGGACTC

pcDNA3.1-V5-RNF19B(1-252)REV:

CCTCGAGTCACGTAGAATCGAGACCGAGGAGAGGGTTAGGGATAGGCTTACCATC

GCATGTCTGATTTGGATGC

pcDNA3.1-V5-RNF19B(167-732)FWD:

CAAGCTTGCCGCCACCATGAGCGAGCGACTCAACCC

pcDNA3.1-V5-RNF19B(167-732)REV:

CCTCGAGTCACGTAGAATCGAGACCGAGGAGAGGGTTAGGGATAGGCTTACCTCAT

ACTCTGGCTTCTCCACC

pcDNA3.1-V5-RNF19B(252-732)FWD:

CAAGCTTGCCGCCACCATGGATATGGCCCGTCAACAG

pcDNA3.1-V5-RNF19B(252-732)REV:

CCTCGAGTCACGTAGAATCGAGACCGAGGAGAGGGTTAGGGATAGGCTTACCTCAT

ACTCTGGCTTCTCCACC

pcDNA3.1-V5-RNF19B(319-732)FWD:

CAAGCTTGCCGCCACCATGAAAGAGATCTCAGACTTGC

pcDNA3.1-V5-RNF19B(319-732)REV:

CCTCGAGTCACGTAGAATCGAGACCGAGGAGAGGGTTAGGGATAGGCTTACCTCAT

ACTCTGGCTTCTCCACC

实施例1：乌苯苷下调肺癌细胞PD-L1蛋白水平呈现明显的浓度与时间依赖性

将1.0×10⁵个细胞/ml的H157细胞种于12孔板(细胞培养皿)中，37℃，CO₂孵箱内培养，待细胞数量增长到约60％左右，加入不同浓度的乌苯苷(Ouabain)溶液(0-500nmol/L)处理细胞24h之后，将长有细胞的培养板(皿)置于冰上，吸走培养基；用事先预冷的 1×PBS清洗细胞一次，后吸走板中液体；加入适当体积含1％混合蛋白酶抑制剂的细胞裂解液(PIC)，冰上裂解30min，收集细胞裂解液，4℃13200r/min离心15min，取上清待制样。再制作标准曲线并测蛋白浓度，先取5个1.5mL EP管，各加入10μL去离子水，再分别加入 (0、1、2、4、8)μL BSA(浓度为2mg/mL)，此组用于标准曲线的制作；取0.5mL EP管，加入10μL去离子水，再加入2μL蛋白样品裂解液；配制适量的1×蛋白染液(5×蛋白染液稀释而成，现用现配)，实验组加入500μL染液，标曲组中加入1mL染液，混合均匀；每管液体中分别取200μL，加入到96孔板中，用酶标仪测量595nm波长下的OD值，根据标曲组 OD值，绘制标准曲线，根据样品的OD值计算样品的浓度；根据浓度和上样量，计算所需的蛋白裂解液、3×SDS以及1×SDS的体积，依次加入0.5mL EP管中，制蛋白样；95℃金属浴，变性5min，可用于SDS-PAGE胶上样。根据配方制备分离胶与浓缩胶。将金属浴加热变性后的蛋白样品短暂离心后进行上样。将胶孔梳子拔出向电泳槽和胶板中加入稀释后的 1×Running Buffer溶液。在上样孔道中按照蛋白样品的实验顺序依次加入并在不同实验组之间加入标准蛋白Marker以用来指示不同蛋白的分子量大小。上样完成后进行跑胶，先90V 电压进行压胶，待蛋白Marker分离后使用120V电压待溴酚蓝跑至胶的底部附近时，结束跑胶。然后转膜，先用甲醇活化PVDF膜1min，提前预冷Transfer buffer，采用湿转法将胶上的蛋白转移至PVDF膜上，150V，2-3h。转膜完成后，5％的脱脂奶粉(1×PBST配置)封闭 1h；1×PBST洗三遍，每遍5min；一抗孵育，3％BSA配置一抗，4℃孵育过夜；第二天回收一抗，1×PBST洗两遍，每遍8min；室温下二抗(3％脱脂奶粉配置)孵育1h；1×PBST洗三遍，每遍10min；ECL显色，将膜与底物混合后，置于暗室，利用显影片进行曝光，再分析结果。经过以上western blot步骤后检测糖基化和非糖基化的PD-L1蛋白水平。

将H1792、H1299、H460和A549细胞分别接种于12孔板(细胞培养皿)中，37℃， CO₂孵箱内培养24h之后，加入不同浓度的乌苯苷(0-450nmol/L)处理细胞24h之后，将长有细胞的培养板(皿)置于冰上，吸走培养基；用事先预冷的1×PBS清洗细胞一次，后吸走板中液体；加入适当体积含1％混合蛋白酶抑制剂的细胞裂解液(PIC)，冰上裂解 30min，收集细胞裂解液，4℃13200r/min离心15min，取上清，通过以上western blot步骤后检测PD-L1和USP22蛋白水平。

将H460和H157细胞分别接种于12孔板(细胞培养皿)中，37℃，CO₂孵箱内培养24 h之后，加入乌苯苷(200nmol/L)处理细胞不同时间(12-24h)之后，将长有细胞的培养板(皿)置于冰上，吸走培养基；用事先预冷的1×PBS清洗细胞一次，后吸走板中液体；加入适当体积含1％混合蛋白酶抑制剂的细胞裂解液(PIC)，冰上裂解30min，收集细胞裂解液，4℃13200r/min离心15min，取上清，通过以上western blot步骤后检测PD-L1和 USP22蛋白水平。

将H1792和A549细胞分别接种于6孔板(细胞培养皿)中，37℃，CO₂孵箱内培养24 h之后，加入乌苯苷(200nmol/L)处理细胞12h之后，提取RNA前先用真空吸泵吸出培养板中的培养基溶液，之后加入1×PBS磷酸缓冲溶液清洗一遍，吸去残留的液体；向每个6 孔板中加入500μL的TRIZOL溶液进行裂解，裂解时应用移液器反复吹打以使细胞完全破裂，之后将6孔板放在室温的条件下静置5分钟；静置后将上述所得的裂解液放入高压灭菌的无RNase的1.5mL的离心管中。之后再加入100μL的氯仿溶液进行15s左右的充分摇晃，最后再在室温条件下静置2分钟；2分钟静置后，将离心管放入4摄氏度的低温离心机中离心15 分钟，转速为12000g；离心完成后，溶液明显分为上中下三层，使用移液器将上层的液体吸入到新的离心管中，再加入250μL的异丙醇溶液。体系混匀后放于室温下静置10分钟；静置完成后，将离心管放入4摄氏度离心机中，转速12000g时间10分钟；离心后，使用移液器将上清小心去除，之后再向离心管中加入500μL用DEPC水配置的75％的乙醇溶液，轻轻弹匀后，放于4摄氏度离心机中，转速7500g离心5分钟。此过程重复两遍；使用移液器将上清液全部弃去，将离心管管口朝下放于无菌的吸水纸上自然晾干；晾干过程中可以清晰看见离心管底部白色沉淀变得越来越透明，之后加入40μL的DEPC水，轻轻弹匀沉淀使底物的RNA全部溶解；使用分光光度计测量提取的RNA的纯度和浓度。取反转录试剂盒于冰上；取高压灭菌后的PCR小管，向其中加入1μL的Oligo(dT)和1μg的提取的RNA(计算 RNA所加的体积)，剩余的的体积使用无菌超纯水补齐到13μL，轻轻混匀后，在高速离心机中短离10秒；离心后将PCR小管放入PCR仪中，65摄氏度进行反应，设定反应时间为时间10分钟；反应完成后取出PCR管，再向其加入4μL的5×Reaction buffer和0.5μL的 RNase抑制剂和0.5μL的逆转录酶以及2μL的dNTP溶液，轻轻混匀，进行瞬时离心；离心后，将PCR管再次放置于PCR仪中，设定程序为先55摄氏度进行30分钟的反应，然后再进行85摄氏度5分钟的反应，最后反应完成后放入-20摄氏度保存。利用获得的cDNA为模板，使用的10μL PCR体系(2×PrimeSTAR MaxPremix 5μL，10μmol/L的PD-L1基因上游引物0.4μL，10μmol/L的PD-L1基因下游引物0.4μL，模板cDNA 0.4μL，双蒸水 3.8μL，总体积共10μL)以PD-L1基因设计的上下游引物进行PCR扩增PD-L1的基因序列，再进行1％琼脂糖凝胶电泳以检测PD-L1的转录情况。

上述PD-L1基因的上下游引物序列如下：

FWD:CGGTACCGCCGCCACCATGAGGATATTTGCTGTCTTTATATTC

REV:CCTCGAGTTCGTCTCCTCCAAATGTGTATC

实施例2：乌苯苷可以通过改变细胞质中Ca²⁺稳态来诱导肿瘤细胞产生内质网应激，乌苯苷对PD-L1的下调依赖蛋白酶体途径而非溶酶体途径

将H460和A549细胞分别接种于6孔板(细胞培养皿)中，37℃，CO₂孵箱内培养24 h之后，加入不同浓度的乌苯苷(0、100、200nmol/L)处理细胞12h之后，收集细胞裂解 (具体步骤见实施例1)，再通过western blot(步骤见实施例1)后检测ER Stress的标志蛋白CHOP的变化。将H460和A549细胞分别接种于6孔板(细胞培养皿)中，37℃，CO₂孵箱内培养24h之后，加入1mol/L的4-PBA预处理30min后，再加入200nmol/L的乌苯苷继续处理12h后，收集细胞裂解(具体步骤见实施例1)，再通过western blot(步骤见实施例1)后检测PD-L1、CHOP和p-eIF2α的变化。将H460和A549细胞分别接种于6孔板 (细胞培养皿)中，37℃，CO₂孵箱内培养24h之后，加入10μmol/L的(Ca²⁺的螯合剂) BAPTA/AM预处理1h后再加入200nmol/L乌苯苷继续培养12h后，收集细胞裂解(具体步骤见实施例1)，再通过westernblot(步骤见实施例1)后检测PD-L1、ER Stress的标志蛋白CHOP的水平。

将A549和H1792细胞分别接种于6孔板(细胞培养皿)中，37℃，CO₂孵箱内培养24 h之后，加入200nmol/L乌苯苷处理4h后，再分别加入20μmol/L的蛋白酶体抑制剂MG132 和15μmol/L的溶酶体抑制剂CQ处理8h,然后收集细胞裂解(具体步骤见实施例1)，再通过western blot(步骤见实施例1)后检测PD-L1和ACTB的水平。

结果表明：(1)随着乌苯苷处理浓度的上升，CHOP或p-eIF2α在肿瘤细胞中的蛋白含量出现增高，4-PBA处理后，在一定程度阻止了乌苯苷介导的ER Stress的产生，同时也阻止了乌苯苷下调PD-L1的强度(图2A、2B)。使用Ca²⁺的螯合剂BAPTA/AM与乌苯苷同时处理细胞，内质网应激标志物CHOP的上升受到了抑制，与此PD-L1含量的下降也出现减弱(图2C)。说明乌苯苷可以通过打破Ca²⁺的平衡，让肿瘤细胞处于内质网应激状态，干扰了PD-L1的合成。(2)与蛋白酶体抑制剂MG132联合处理能抑制乌苯苷引起的PD-L1下调, 而联合使用溶酶体抑制剂CQ与乌苯苷单独处理相比二者无明显变化(图2D)，说明乌苯苷对PD-L1的下调依赖蛋白酶体途径而非溶酶体途径。

实施例3：RNF19B与PD-L1存在相互作用

将HEK293FT细胞接种于6cm细胞培养皿中，37℃，CO₂孵箱内培养24h之后，在HEK293FT细胞中转染pcDNA3.1-FLAG-PD-L1/pcDNA3.1-FLAG-PD-L1(3NQ)、pcDNA3.1- V5-RNF19B质粒，每个处理取2个1.5mL的EP管，各加入200μL的培养基，根据实验要求计算后，分别加入质粒和质粒质量2倍的转染试剂，分别用移液枪吹打五次，静置5min；将2个1.5mL的EP管中的液体混合，吹打五次使之充分混匀，静置20min；将原先的一部分培养基吸走，滴加上述混匀静置后的液体，晃动，令其均匀分布；转染6h后换加入5％血清的新鲜培养基，继续培养至24h。收集细胞6h前加入20μmol/L的MG132处理，然后将长有细胞的培养板(皿)置于冰上，吸走培养基；用事先预冷的1×PBS清洗细胞一次，后吸走板中液体；加入适当体积含1％混合蛋白酶抑制剂(PIC)的IP裂解液，冰上裂解 30min，收集细胞裂解液，4℃13200r/min离心15min，取上清。为避免珠子与蛋白的非特异性结合，取10μL的Protein A珠子或者Protein G珠子于1.5mLEP管中，加入900μL 1×PBS，4℃离心机中9000g离心1min，小心吸走上清，注意不要吸到珠子，再加入900μL IP裂解液，重复以上操作，最后加入蛋白样品裂解液，4℃缓慢摇晃孵育2-4h；取15μL的 Protein A珠子或者Protein G珠子于新的1.5mLEP管中，加入900μL 1×PBS，4℃离心机中 9000g离心1min，小心吸走上清，注意不要吸到珠子，再加入900μL IP裂解液，重复以上操作；然后对含珠子的蛋白样品离心，9000g，1min，取上清，同Western blot实验(步骤见实施例1)，根据实验要求计算出Co-IP(免疫共沉淀)实验所需蛋白样的体积，加入新洗好的珠子中，并用IP裂解液(含1％PIC)补齐至500μL，还需制input蛋白样；按抗体与蛋白 1:1000的比例中向500μL体系IP样品中加入抗体，4℃摇床孵育4-6h；孵育完成后，取出离心管进行4摄氏度1分钟，9000g的离心，使用移液器将上清液吸出，之后再加入900μL含 1％PIC的IP裂解液，放于4摄氏度摇床上清洗珠子5分钟，最后再9000g,1分钟离心，用移液枪吸出上清；重复一次加入900μL含1％PIC的IP裂解液，放于4摄氏度摇床上清洗珠子5分钟，最后再9000g,1分钟离心，用移液枪吸出上清；最后加入20-25μL 2×SDS，短暂离心后放于100摄氏度金属浴上变性10分钟；13200r/min，离心5min，吸取上清跑SDS- PAGE胶，后续操作同Western blot实验(步骤见实施例1)。通过Western blot检测RNF19B 与PD-L1(WT)和PD-L1(3NQ)的结合情况。

将H1299细胞接种于10cm细胞培养皿中，37℃，CO₂孵箱内培养24h之后，在H1299细胞中按常规方法转染(具体步骤见实施例3)pcDNA3.1-FLAG-PD-L1、pcDNA3.1-FLAG- PD-L1(3NQ)质粒24h，收集细胞6h前加入20μmol/L的MG132处理，然后收集细胞进行 Co-IP实验(步骤见实施例3)，通过Western blot(步骤见实施例1)检测内源蛋白RNF19B 与PD-L1两种形式的结合。

实施例4：RNF19B影响PD-L1蛋白水平

将A549和H1792细胞分别接种于6孔板(细胞培养皿)中，37℃，CO₂孵箱内培养 24h后，在A549和H1792细胞中转染(具体步骤见实施例3)pcDNA3.1-V5-RNF19B质粒 24h后，在收集细胞12h前向细胞中加入200nmol/L的乌苯苷继续处理12h，通过Western blot(步骤见实施例1)检测PD-L1、CHOP、ACTB的表达情况。

将A549和H1792细胞分别接种于6孔板(细胞培养皿)中，37℃，CO₂孵箱内培养 24h后，在A549和H1792细胞中转染(具体步骤见实施例3)RNF19B的siRNA干扰 RNF19B的表达24h后，在收集细胞12h前向细胞中加入200nmol/L的乌苯苷继续处理12h，通过Westernblot(步骤见实施例1)检测PD-L1、RNF19B、CHOP、ACTB的表达情况。

实施例5：乌苯苷处理下RNF19B增强PD-L1的泛素化，RNF19B对非糖基化的PD-L1的亲和力以及泛素化水平较强

将H1299细胞接种于10cm细胞培养皿中，37℃，CO₂孵箱内培养24h之后，在H1299细胞转染(具体步骤见实施例3)pcDNA3.1-V5-RNF19B、pcDNA3.1-FLAG-PD-L1或 pcDNA3.1-FLAG-PD-L1(3NQ)、pcDNA3.1-HA-UB质粒24h，收集细胞6h前加入20μmol/L 的MG132处理，收集细胞进行Co-IP实验(步骤见实施例3)，通过Western blot(步骤见实施例1)检测糖基化和非糖基化PD-L1的泛素化水平。将H1299和A549细胞分别接种于 10cm细胞培养皿中，37℃，CO₂孵箱内培养24h后，在H1299和A549细胞中分别转染 (具体步骤见实施例3)pcDNA3.1-V5-RNF19B、pcDNA3.1-FLAG-PD-L1或pcDNA3.1- FLAG-PD-L1(3NQ)、pcDNA3.1-HA-UB质粒24h，在收集细胞12h前向细胞中加入 200nmol/L的乌苯苷继续处理12h，收集细胞6h前加入20μmol/L的MG132处理，然后收集细胞进行Co-IP实验(步骤见实施例3)，通过Western blot(步骤见实施例1)检测糖基化和非糖基化的PD-L1的泛素化水平。

将H1299和H1792细胞分别接种于10cm细胞培养皿中，37℃，CO₂孵箱内培养24h 之后，在H1299和H1792细胞中分别转染(具体步骤见实施例3)pcDNA3.1-V5-RNF19B、pcDNA3.1-FLAG-PD-L1、pcDNA3.1-FLAG-PD-L1(3NQ)、pcDNA3.1-HA-UB质粒24h，在收集细胞12h前向细胞中加入200nmol/L的乌苯苷继续处理，收集细胞6h前加入20μmol/L的 MG132处理，然后收集细胞进行Co-IP实验(步骤见实施例3)，通过Western blot(步骤见实施例1)检测RNF19B与两种形式PD-L1的结合情况以及泛素化水平。将H1299细胞接种于10cm细胞培养皿中，37℃，CO₂孵箱内培养24h之后，在H1299细胞转染(具体步骤见实施例3)pcDNA3.1-V5-RNF19B、pcDNA3.1-FLAG-PD-L1(3NQ)、pcDNA3.1-HA-UB质粒24h，使用1mmol/L的4-PBA(ER Stress的抑制剂)预处理30min后加入200nmol/L的乌苯苷继续处理12h，收集细胞8h前加入20μmol/L的MG132处理，收集细胞进行Co-IP实验 (步骤见实施例3)，通过Western blot(步骤见实施例1)检测RNF19B对非糖基化的PD- L1的泛素化水平。

将H1299细胞接种于6cm细胞培养皿中，37℃，CO₂孵箱内培养24h之后，在H1299 细胞转染(具体步骤见实施例3)pcDNA3.1-V5-RNF19B、pcDNA3.1-FLAG-PD-L1(3NQ)质粒24h。在生物安全柜中将需要用的细胞爬片浸泡于75％乙醇溶液中，浸泡时间30分钟； 30分钟后，将细胞爬片取出，放入已经灭菌的滤纸上风干残留的乙醇溶液。准备24孔细胞培养板，在生物安全柜中将干燥后的细胞爬片放入培养板的孔中；将转染24h后的H1299细胞处理，通过计算细胞数量将适量的细胞种于放入细胞爬片的24孔板中；过夜培养后，第二天使用真空泵吸去旧的培养基，使用1×PBS溶液清洗残余培养基；吸去参与溶液后，向 24孔板中加入适量体积的PHEMO固定液，室温状态下进行10分钟的孵育，完成对细胞的固定；孵育完成后，吸走参与固定液并使用1×PBS溶液清洗细胞，此步骤重复3次，每次时间为5分钟；清洗后在室温状态下使用含有3％BSA的1×PBS溶液对上述细胞进行封闭处理1h；将所加的一抗溶解于1％BSA的1×PBS溶液中，一抗稀释比为1:200，使用移液器向每个孔中加入约300μL的溶液，4℃过夜(18h以上)；一抗孵育完成后，将含有一抗的 PBS溶液吸走，再使用1×PBS溶液清洗细胞，重复2次每次5分钟；清洗后，将二抗也稀释于含有1％BSA的1×PBS溶液中并向每个孔中加入300μL的溶液，在室温下进行避光孵育 1h。此后的所有步骤均需要避光进行。将含有二抗的PBS溶液吸走，再使用1×PBS溶液清洗细胞，重复2次每次5分钟；加入另一种一抗，一抗溶解于1％BSA的1×PBS溶液中，一抗稀释比为1:200，使用移液器向每个孔中加入约300μL的溶液，4℃过夜(18h以上)；一抗孵育完成后，将含有一抗的PBS溶液吸走，再使用1×PBS溶液清洗细胞，重复2次每次 5分钟，将另一种二抗也稀释于含有1％BSA的1×PBS溶液中并向每个孔中加入300μL的溶液，在室温下进行避光孵育1h；二抗孵育后将二抗溶液吸出，用1×PBS溶液清洗2次，每次5分钟；最后染细胞核，使用含有1μg/mLDAPI的1×PBS溶液，向每个孔加入300μL溶液进行染色，时间约为1分钟，之后吸去溶液并清洗3次，每次5分钟；所有染色结束后，将细胞爬片从24孔板出一个个取出，利用封片液将细胞爬片固定在载玻片上，完成制样的操作；制备好的样品，最后在蔡斯LSM700激光共聚焦显微镜上拍照观察二者共定位情况。

结果表明：(1)乌苯苷处理下RNF19B增强PD-L1的泛素化。过表达RNF19B并同时使用乌苯苷诱导ER Stress后，RNF19B可以对糖基化和非糖基化形式的PD-L1的泛素化起到促进的作用(图5B、5C)。如果不使用乌苯苷处理，单纯的过表达RNF19B，对于PD-L1 两种形式的泛素化的影响是比较小的(图5A)。说明了RNF19B是PD-L1的E3泛素连接酶，在乌苯苷介导PD-L1的下降过程中，RNF19B参与了PD-L1的泛素化过程。(2)RNF19B对非糖基化的PD-L1的亲和力以及泛素化水平较强。(图5D和5E)。使用免疫荧光共聚焦技术，观察到非糖基化的PD-L1与RNF19B之间存在共定位(图5G)，说明RNF19B对PD- L1的调控一方面主要是在细胞质中进行，这个过程主要是RNF19B对于不成熟的PD-L1进行泛素化识别并降解。(3)使用ER Stress的抑制剂4-PBA处理细胞，抑制ER Stress后， RNF19B对非糖基化PD-L1的泛素水平也明显降低(图5F)，说明乌苯苷引发ER Stress后会通过RNF19B对PD-L1进行泛素化。

实施例6：RNF19B通过其(252～732)段结构区域(其核苷酸序列见SEQ ID No.8)与PD-L1的胞质段发生结合

将HEK293FT细胞接种于6cm细胞培养皿中，37℃，CO₂孵箱内培养24h之后，在HEK293FT细胞转染(具体步骤见实施例3)pcDNA3.1-V5-RNF19B、pEGFPC2-PD-L1、 pEGFPC2-PD-L1(1-259)、pEGFPC2-PD-L1(239-290)质粒24h，收集细胞6h前加入20μmol/L 的MG132处理，然后收集细胞进行Co-IP实验(步骤见实施例3)，通过Western blot(步骤见实施例1)检测RNF19B与PD-L1分段的结合情况。

将HEK293FT细胞接种于6cm细胞培养皿中，37℃，CO₂孵箱内培养24h之后，在HEK293FT细胞转染(具体步骤见实施例3)RNF19B的五个分段质粒以及PD-L1(WT) /PD-L1(3NQ)的质粒24h，收集细胞6h前加入20μmol/L的MG132处理，然后收集细胞进行 Co-IP实验(步骤见实施例3)，通过Western blot(步骤见实施例1)检测RNF19B的分段与 PD-L1两种形式的结合情况。

将HEK293FT细胞接种于6cm细胞培养皿中，37℃，CO₂孵箱内培养24h之后，在HEK293FT细胞转染(具体步骤见实施例3)pcDNA3.1-V5-RNF19B，pcDNA3.1-T7-PD- L1,pcDNA3.1-T7-PD-L1(K5R)质粒24h，收集细胞6h前加入20μmol/L的MG132处理，然后收集细胞进行Co-IP实验(步骤见实施例3)，通过Western blot(步骤见实施例1)检测 RNF19B与胞质区5个Lys泛素化位点突变PD-L1的结合情况。

实施例7：RNF19B影响USP22与PD-L1的结合

将HEK293FT细胞接种于6cm细胞培养皿中，37℃，CO₂孵箱内培养24h之后，在HEK293FT细胞转染(具体步骤见实施例3)pcDNA3.1-V5-RNF19B、pcDNA3.1-HA-USP22 质粒24h，收集细胞6h前加入20μmol/L的MG132处理，然后收集细胞进行Co-IP实验(步骤见实施例3)，通过Western blot(步骤见实施例1)检测RNF19B与USP22的结合。

将HEK293FT细胞接种于6cm细胞培养皿中，37℃，CO₂孵箱内培养24h之后，在HEK293FT细胞转染(具体步骤见实施例3)pcDNA3.1-V5-RNF19B、pcDNA3.1-HA-USP22、pcDNA3.1-FLAG-PD-L1质粒24h，收集细胞6h前加入20μmol/L的MG132处理，然后收集细胞进行Co-IP实验(步骤见实施例3)，通过Western blot(步骤见实施例1)检测RNF19B 对于PD-L1和USP22的结合的影响。

将A549和H1299细胞分别接种于10cm细胞培养皿中，37℃，CO₂孵箱内培养24h之后，在A549和H1299细胞中分别转染(具体步骤见实施例3)pcDNA3.1-V5-RNF19B、pcDNA3.1-HA-USP22、pcDNA3.1-HIS-UB质粒24h，加入或不加200nmol/L的乌苯苷处理 6h，收集细胞6h前加入20μmol/L的MG132处理，然后收集细胞进行Co-IP实验(步骤见实施例3)，通过Western blot(步骤见实施例1)检测在乌苯苷存在或不存在的条件下 RNF19B对USP22泛素化的影响。

序列表

<110> 山东大学

<120> 乌苯苷在制备下调肿瘤细胞PD-L1水平的制剂中的应用

<141> 2021-08-28

<160> 9

<210> 1

<211> 873

<212> DNA

<213> Homo sapiens?(human)

<221> PD-L1（1-290）全长的核苷酸序列

<222>（1）…（873）

<400> 1

atgaggatat ttgctgtctt tatattcatg acctactggc atttgctgaa cgcatttact 60

gtcacggttc ccaaggacct atatgtggta gagtatggta gcaatatgac aattgaatgc 120

aaattcccag tagaaaaaca attagacctg gctgcactaa ttgtctattg ggaaatggag 180

gataagaaca ttattcaatt tgtgcatgga gaggaagacc tgaaggttca gcatagtagc 240

tacagacaga gggcccggct gttgaaggac cagctctccc tgggaaatgc tgcacttcag 300

atcacagatg tgaaattgca ggatgcaggg gtgtaccgct gcatgatcag ctatggtggt 360

gccgactaca agcgaattac tgtgaaagtc aatgccccat acaacaaaat caaccaaaga 420

attttggttg tggatccagt cacctctgaa catgaactga catgtcaggc tgagggctac 480

cccaaggccg aagtcatctg gacaagcagt gaccatcaag tcctgagtgg taagaccacc 540

accaccaatt ccaagagaga ggagaagctt ttcaatgtga ccagcacact gagaatcaac 600

acaacaacta atgagatttt ctactgcact tttaggagat tagatcctga ggaaaaccat 660

acagctgaat tggtcatccc agaactacct ctggcacatc ctccaaatga aaggactcac 720

ttggtaattc tgggagccat cttattatgc cttggtgtag cactgacatt catcttccgt 780

ttaagaaaag ggagaatgat ggatgtgaaa aaatgtggca tccaagatac aaactcaaag 840

aagcaaagtg atacacattt ggaggagacg taa 873

<210> 2

<211> 777

<212> DNA

<213> Homo sapiens?(human)

<221> PD-L1（1-259）的核苷酸序列

<222>（1）…（777）

<400> 2

atgaggatat ttgctgtctt tatattcatg acctactggc atttgctgaa cgcatttact 60

gtcacggttc ccaaggacct atatgtggta gagtatggta gcaatatgac aattgaatgc 120

aaattcccag tagaaaaaca attagacctg gctgcactaa ttgtctattg ggaaatggag 180

gataagaaca ttattcaatt tgtgcatgga gaggaagacc tgaaggttca gcatagtagc 240

tacagacaga gggcccggct gttgaaggac cagctctccc tgggaaatgc tgcacttcag 300

atcacagatg tgaaattgca ggatgcaggg gtgtaccgct gcatgatcag ctatggtggt 360

gccgactaca agcgaattac tgtgaaagtc aatgccccat acaacaaaat caaccaaaga 420

attttggttg tggatccagt cacctctgaa catgaactga catgtcaggc tgagggctac 480

cccaaggccg aagtcatctg gacaagcagt gaccatcaag tcctgagtgg taagaccacc 540

accaccaatt ccaagagaga ggagaagctt ttcaatgtga ccagcacact gagaatcaac 600

acaacaacta atgagatttt ctactgcact tttaggagat tagatcctga ggaaaaccat 660

acagctgaat tggtcatccc agaactacct ctggcacatc ctccaaatga aaggactcac 720

ttggtaattc tgggagccat cttattatgc cttggtgtag cactgacatt catcttc 777

<210> 3

<211> 159

<212> DNA

<213> Homo sapiens?(human)

<221> PD-L1（239-290）的核苷酸序列

<222>（1）…（159）

<400> 3

actcacttgg taattctggg agccatctta ttatgccttg gtgtagcact gacattcatc 60

ttccgtttaa gaaaagggag aatgatggat gtgaaaaaat gtggcatcca agatacaaac 120

tcaaagaagc aaagtgatac acatttggag gagacgtaa 159

<210> 4

<211> 2199

<212> DNA

<213> Homo sapiens?(human)

<221> RNF19B（1-732）全长的核苷酸序列

<222>（1）…（2199）

<400> 3

atgggctccg agaaggactc cgagtcgccg cgctccacat cgctacatgc ggccgcaccc 60

gaccctaagt gccgcagcgg cggccggcgc cggcgcctca ccttgcacag cgtcttctct 120

gcctcggccc gcggccgccg cgcccgggcc aagccgcagg ccgagccgcc gcccccggct 180

gcgcagccgc cgcccgcccc ggcccctgcc gcggcccagg gcccgccgcc cgaggcgctg 240

cccgccgagc cggccgccga ggccgaggcg gaggccgcgg cggcggcggc ggagcctggg 300

ttcgacgatg aggaggcggc ggagggcggt ggcccgggcg cggaggaggt ggagtgtccg 360

ctgtgcctgg tgcggctgcc gcctgagcgg gccccgcgcc tcctcagctg tccgcaccgc 420

tcgtgccggg actgcctccg ccactacctg cgcctggaga taagcgagag cagggtgccc 480

atcagctgcc ccgagtgcag cgagcgactc aacccgcacg acatccgctt gctgctcgcc 540

gacccgccgc ttatgcacaa gtacgaggag ttcatgctgc gccgctacct agcctcggac 600

cccgactgcc gctggtgccc ggccccggac tgcggttatg ctgttattgc ctatggctgt 660

gccagctgcc cgaagctaac ttgtgagagg gaaggttgcc agactgagtt ctgctaccac 720

tgcaagcaga tatggcatcc aaatcagaca tgcgatatgg cccgtcaaca gagggcccag 780

actttacgag ttcggaccaa acacacttca ggtctcagtt atgggcaaga atctggacca 840

gcagatgaca tcaagccatg cccacgatgc agtgcataca ttatcaagat gaatgatgga 900

agctgtaatc acatgacctg tgcagtgtgt ggctgtgaat tctgttggct ttgtatgaaa 960

gagatctcag acttgcatta cctcagcccc tctggctgta cattctgggg caagaagcca 1020

tggagccgta agaagaaaat tctttggcag ctgggcacgt tgattggtgc tccagtgggg 1080

atttctctca ttgctggcat tgccattcct gccatggtca ttggcattcc tgtttatgtt 1140

ggaaggaaga ttcacagcag gtatgaggga aggaaaacct ccaaacacaa gaggaatttg 1200

gctatcactg gaggagtgac tttgtcggtc attgcatccc cagttattgc tgcagttagt 1260

gttggtattg gtgtccccat tatgctggca tatgtttatg gggttgtgcc catttctctt 1320

tgtcgtggag gcggctgtgg agttagcaca gccaacggaa aaggagtgaa aattgaattt 1380

gatgaagatg atggtccaat cacagtggca gatgcctgga gagccctcaa gaatcccagc 1440

attggggaaa gcagcattga aggcctgact agtgtattga gcactagtgg aagccctaca 1500

gatggactta gtgttatgca aggtccttac agcgaaacgg ccagctttgc agccctctca 1560

gggggcacgc tgagtggcgg cattctctcc agtggcaagg gaaaatatag caggttagaa 1620

gttcaagccg atgtccaaaa ggaaattttc cccaaagaca cagccagtct tggtgcaatt 1680

agtgacaacg caagcactcg tgctatggcc ggttccataa tcagttccta caacccacag 1740

gacagagaat gcaacaatat ggaaatccaa gtggacattg aagccaaacc aagccactat 1800

cagctggtga gtggaagcag cacggaggac tcgctccatg ttcatgctca gatggcagag 1860

aatgaagaag aaggtagtgg tggcggaggc agtgaagagg atcccccctg cagacaccaa 1920

agctgtgaac agaaagactg cctggccagc aaaccttggg acatcagcct ggcccagcct 1980

gaaagcatcc gcagtgacct agagagttct gatgcacagt cagacgatgt gccagacatc 2040

acctcagatg agtgtggctc cccccgctcc catactgcag cctgcccctc gacccccaga 2100

gcccaaggtg caccgagccc aagtgcccat atgaacctct ctgccctagc cgagggacaa 2160

actgtcttga agccagaagg tggagaagcc agagtatga 2199

<210> 5

<211> 501

<212> DNA

<213> Homo sapiens?(human)

<221> RNF19B（1-167）的核苷酸序列

<222>（1）…（501）

<400> 5

atgggctccg agaaggactc cgagtcgccg cgctccacat cgctacatgc ggccgcaccc 60

gaccctaagt gccgcagcgg cggccggcgc cggcgcctca ccttgcacag cgtcttctct 120

gcctcggccc gcggccgccg cgcccgggcc aagccgcagg ccgagccgcc gcccccggct 180

gcgcagccgc cgcccgcccc ggcccctgcc gcggcccagg gcccgccgcc cgaggcgctg 240

cccgccgagc cggccgccga ggccgaggcg gaggccgcgg cggcggcggc ggagcctggg 300

ttcgacgatg aggaggcggc ggagggcggt ggcccgggcg cggaggaggt ggagtgtccg 360

ctgtgcctgg tgcggctgcc gcctgagcgg gccccgcgcc tcctcagctg tccgcaccgc 420

tcgtgccggg actgcctccg ccactacctg cgcctggaga taagcgagag cagggtgccc 480

atcagctgcc ccgagtgcag c 501

<210> 6

<211> 756

<212> DNA

<213> Homo sapiens?(human)

<221> RNF19B（1-252）的核苷酸序列

<222>（1）…（756）

<400> 6

atgggctccg agaaggactc cgagtcgccg cgctccacat cgctacatgc ggccgcaccc 60

gaccctaagt gccgcagcgg cggccggcgc cggcgcctca ccttgcacag cgtcttctct 120

gcctcggccc gcggccgccg cgcccgggcc aagccgcagg ccgagccgcc gcccccggct 180

gcgcagccgc cgcccgcccc ggcccctgcc gcggcccagg gcccgccgcc cgaggcgctg 240

cccgccgagc cggccgccga ggccgaggcg gaggccgcgg cggcggcggc ggagcctggg 300

ttcgacgatg aggaggcggc ggagggcggt ggcccgggcg cggaggaggt ggagtgtccg 360

ctgtgcctgg tgcggctgcc gcctgagcgg gccccgcgcc tcctcagctg tccgcaccgc 420

tcgtgccggg actgcctccg ccactacctg cgcctggaga taagcgagag cagggtgccc 480

atcagctgcc ccgagtgcag cgagcgactc aacccgcacg acatccgctt gctgctcgcc 540

gacccgccgc ttatgcacaa gtacgaggag ttcatgctgc gccgctacct agcctcggac 600

cccgactgcc gctggtgccc ggccccggac tgcggttatg ctgttattgc ctatggctgt 660

gccagctgcc cgaagctaac ttgtgagagg gaaggttgcc agactgagtt ctgctaccac 720

tgcaagcaga tatggcatcc aaatcagaca tgcgat 756

<210> 7

<211> 1701

<212> DNA

<213> Homo sapiens?(human)

<221> RNF19B（167-732）的核苷酸序列

<222>（1）…（1701）

<400> 7

agcgagcgac tcaacccgca cgacatccgc ttgctgctcg ccgacccgcc gcttatgcac 60

aagtacgagg agttcatgct gcgccgctac ctagcctcgg accccgactg ccgctggtgc 120

ccggccccgg actgcggtta tgctgttatt gcctatggct gtgccagctg cccgaagcta 180

acttgtgaga gggaaggttg ccagactgag ttctgctacc actgcaagca gatatggcat 240

ccaaatcaga catgcgatat ggcccgtcaa cagagggccc agactttacg agttcggacc 300

aaacacactt caggtctcag ttatgggcaa gaatctggac cagcagatga catcaagcca 360

tgcccacgat gcagtgcata cattatcaag atgaatgatg gaagctgtaa tcacatgacc 420

tgtgcagtgt gtggctgtga attctgttgg ctttgtatga aagagatctc agacttgcat 480

tacctcagcc cctctggctg tacattctgg ggcaagaagc catggagccg taagaagaaa 540

attctttggc agctgggcac gttgattggt gctccagtgg ggatttctct cattgctggc 600

attgccattc ctgccatggt cattggcatt cctgtttatg ttggaaggaa gattcacagc 660

aggtatgagg gaaggaaaac ctccaaacac aagaggaatt tggctatcac tggaggagtg 720

actttgtcgg tcattgcatc cccagttatt gctgcagtta gtgttggtat tggtgtcccc 780

attatgctgg catatgttta tggggttgtg cccatttctc tttgtcgtgg aggcggctgt 840

ggagttagca cagccaacgg aaaaggagtg aaaattgaat ttgatgaaga tgatggtcca 900

atcacagtgg cagatgcctg gagagccctc aagaatccca gcattgggga aagcagcatt 960

gaaggcctga ctagtgtatt gagcactagt ggaagcccta cagatggact tagtgttatg 1020

caaggtcctt acagcgaaac ggccagcttt gcagccctct cagggggcac gctgagtggc 1080

ggcattctct ccagtggcaa gggaaaatat agcaggttag aagttcaagc cgatgtccaa 1140

aaggaaattt tccccaaaga cacagccagt cttggtgcaa ttagtgacaa cgcaagcact 1200

cgtgctatgg ccggttccat aatcagttcc tacaacccac aggacagaga atgcaacaat 1260

atggaaatcc aagtggacat tgaagccaaa ccaagccact atcagctggt gagtggaagc 1320

agcacggagg actcgctcca tgttcatgct cagatggcag agaatgaaga agaaggtagt 1380

ggtggcggag gcagtgaaga ggatcccccc tgcagacacc aaagctgtga acagaaagac 1440

tgcctggcca gcaaaccttg ggacatcagc ctggcccagc ctgaaagcat ccgcagtgac 1500

ctagagagtt ctgatgcaca gtcagacgat gtgccagaca tcacctcaga tgagtgtggc 1560

tccccccgct cccatactgc agcctgcccc tcgaccccca gagcccaagg tgcaccgagc 1620

ccaagtgccc atatgaacct ctctgcccta gccgagggac aaactgtctt gaagccagaa 1680

ggtggagaag ccagagtatg a 1701

<210> 8

<211> 1446

<212> DNA

<213> Homo sapiens?(human)

<221> RNF19B（252-732）的核苷酸序列

<222>（1）…（1446）

<400> 8

gatatggccc gtcaacagag ggcccagact ttacgagttc ggaccaaaca cacttcaggt 60

ctcagttatg ggcaagaatc tggaccagca gatgacatca agccatgccc acgatgcagt 120

gcatacatta tcaagatgaa tgatggaagc tgtaatcaca tgacctgtgc agtgtgtggc 180

tgtgaattct gttggctttg tatgaaagag atctcagact tgcattacct cagcccctct 240

ggctgtacat tctggggcaa gaagccatgg agccgtaaga agaaaattct ttggcagctg 300

ggcacgttga ttggtgctcc agtggggatt tctctcattg ctggcattgc cattcctgcc 360

atggtcattg gcattcctgt ttatgttgga aggaagattc acagcaggta tgagggaagg 420

aaaacctcca aacacaagag gaatttggct atcactggag gagtgacttt gtcggtcatt 480

gcatccccag ttattgctgc agttagtgtt ggtattggtg tccccattat gctggcatat 540

gtttatgggg ttgtgcccat ttctctttgt cgtggaggcg gctgtggagt tagcacagcc 600

aacggaaaag gagtgaaaat tgaatttgat gaagatgatg gtccaatcac agtggcagat 660

gcctggagag ccctcaagaa tcccagcatt ggggaaagca gcattgaagg cctgactagt 720

gtattgagca ctagtggaag ccctacagat ggacttagtg ttatgcaagg tccttacagc 780

gaaacggcca gctttgcagc cctctcaggg ggcacgctga gtggcggcat tctctccagt 840

ggcaagggaa aatatagcag gttagaagtt caagccgatg tccaaaagga aattttcccc 900

aaagacacag ccagtcttgg tgcaattagt gacaacgcaa gcactcgtgc tatggccggt 960

tccataatca gttcctacaa cccacaggac agagaatgca acaatatgga aatccaagtg 1020

gacattgaag ccaaaccaag ccactatcag ctggtgagtg gaagcagcac ggaggactcg 1080

ctccatgttc atgctcagat ggcagagaat gaagaagaag gtagtggtgg cggaggcagt 1140

gaagaggatc ccccctgcag acaccaaagc tgtgaacaga aagactgcct ggccagcaaa 1200

ccttgggaca tcagcctggc ccagcctgaa agcatccgca gtgacctaga gagttctgat 1260

gcacagtcag acgatgtgcc agacatcacc tcagatgagt gtggctcccc ccgctcccat 1320

actgcagcct gcccctcgac ccccagagcc caaggtgcac cgagcccaag tgcccatatg 1380

aacctctctg ccctagccga gggacaaact gtcttgaagc cagaaggtgg agaagccaga 1440

gtatga 1446

<210> 9

<211> 1245

<212> DNA

<213> Homo sapiens?(human)

<221> RNF19B（319-732）的核苷酸序列

<222>（1）…（1245）

<400> 9

atgaaagaga tctcagactt gcattacctc agcccctctg gctgtacatt ctggggcaag 60

aagccatgga gccgtaagaa gaaaattctt tggcagctgg gcacgttgat tggtgctcca 120

gtggggattt ctctcattgc tggcattgcc attcctgcca tggtcattgg cattcctgtt 180

tatgttggaa ggaagattca cagcaggtat gagggaagga aaacctccaa acacaagagg 240

aatttggcta tcactggagg agtgactttg tcggtcattg catccccagt tattgctgca 300

gttagtgttg gtattggtgt ccccattatg ctggcatatg tttatggggt tgtgcccatt 360

tctctttgtc gtggaggcgg ctgtggagtt agcacagcca acggaaaagg agtgaaaatt 420

gaatttgatg aagatgatgg tccaatcaca gtggcagatg cctggagagc cctcaagaat 480

cccagcattg gggaaagcag cattgaaggc ctgactagtg tattgagcac tagtggaagc 540

cctacagatg gacttagtgt tatgcaaggt ccttacagcg aaacggccag ctttgcagcc 600

ctctcagggg gcacgctgag tggcggcatt ctctccagtg gcaagggaaa atatagcagg 660

ttagaagttc aagccgatgt ccaaaaggaa attttcccca aagacacagc cagtcttggt 720

gcaattagtg acaacgcaag cactcgtgct atggccggtt ccataatcag ttcctacaac 780

ccacaggaca gagaatgcaa caatatggaa atccaagtgg acattgaagc caaaccaagc 840

cactatcagc tggtgagtgg aagcagcacg gaggactcgc tccatgttca tgctcagatg 900

gcagagaatg aagaagaagg tagtggtggc ggaggcagtg aagaggatcc cccctgcaga 960

caccaaagct gtgaacagaa agactgcctg gccagcaaac cttgggacat cagcctggcc 1020

cagcctgaaa gcatccgcag tgacctagag agttctgatg cacagtcaga cgatgtgcca 1080

gacatcacct cagatgagtg tggctccccc cgctcccata ctgcagcctg cccctcgacc 1140

cccagagccc aaggtgcacc gagcccaagt gcccatatga acctctctgc cctagccgag 1200

ggacaaactg tcttgaagcc agaaggtgga gaagccagag tatga 1245

Claims

1.乌苯苷在制备下调肿瘤细胞PD-L1水平的制剂中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：有效下调肿瘤细胞PD-L1水平的乌苯苷的浓度为100～200nmol/L；所述的肿瘤为PD-L1受体天然高表达或因为肿瘤的治疗导致PD-L1受体高表达的肿瘤。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：有效下调肿瘤细胞PD-L1水平的乌苯苷的浓度为200nmol/L；所述的肿瘤为非小细胞肺癌。