CN113817795A - 一种醋酸泼尼松的发酵方法 - Google Patents
一种醋酸泼尼松的发酵方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN113817795A CN113817795A CN202111143524.2A CN202111143524A CN113817795A CN 113817795 A CN113817795 A CN 113817795A CN 202111143524 A CN202111143524 A CN 202111143524A CN 113817795 A CN113817795 A CN 113817795A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- fermentation
- seed
- tank
- culturing
- mycelium
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 title claims abstract description 114
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 title claims abstract description 114
- MOVRKLZUVNCBIP-RFZYENFJSA-N cortancyl Chemical compound C1CC2=CC(=O)C=C[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@@](C(=O)COC(=O)C)(O)[C@@]1(C)CC2=O MOVRKLZUVNCBIP-RFZYENFJSA-N 0.000 title claims abstract description 31
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 30
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims abstract description 59
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims abstract description 45
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 39
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims abstract description 37
- 239000000843 powder Substances 0.000 claims abstract description 33
- ITRJWOMZKQRYTA-RFZYENFJSA-N Cortisone acetate Chemical compound C1CC2=CC(=O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@@](C(=O)COC(=O)C)(O)[C@@]1(C)CC2=O ITRJWOMZKQRYTA-RFZYENFJSA-N 0.000 claims abstract description 22
- 229960003290 cortisone acetate Drugs 0.000 claims abstract description 22
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 claims abstract description 12
- 230000001502 supplementing effect Effects 0.000 claims abstract description 12
- 239000002904 solvent Substances 0.000 claims abstract description 8
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims abstract description 7
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 36
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 28
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 26
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims description 25
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 claims description 25
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims description 25
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 claims description 25
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 15
- 241000727169 Prinsepia utilis Species 0.000 claims description 14
- 229910000403 monosodium phosphate Inorganic materials 0.000 claims description 14
- 235000019799 monosodium phosphate Nutrition 0.000 claims description 14
- AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M sodium dihydrogen phosphate Chemical compound [Na+].OP(O)([O-])=O AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 14
- 241000203720 Pimelobacter simplex Species 0.000 claims description 13
- 235000012343 cottonseed oil Nutrition 0.000 claims description 13
- 230000009466 transformation Effects 0.000 claims description 13
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 claims description 11
- 239000008272 agar Substances 0.000 claims description 11
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 10
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 claims description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 4
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 claims 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 abstract description 42
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 abstract description 3
- 230000035764 nutrition Effects 0.000 abstract description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 29
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 13
- 241000186063 Arthrobacter Species 0.000 description 10
- 239000012074 organic phase Substances 0.000 description 9
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 6
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 5
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 3
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001052560 Thallis Species 0.000 description 2
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 2
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 2
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 2
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 2
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 2
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 208000026062 Tissue disease Diseases 0.000 description 1
- 239000003470 adrenal cortex hormone Substances 0.000 description 1
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000007815 allergy Effects 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 230000023852 carbohydrate metabolic process Effects 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- RKHQGWMMUURILY-UHRZLXHJSA-N cortivazol Chemical compound C([C@H]1[C@@H]2C[C@H]([C@]([C@@]2(C)C[C@H](O)[C@@H]1[C@@]1(C)C2)(O)C(=O)COC(C)=O)C)=C(C)C1=CC1=C2C=NN1C1=CC=CC=C1 RKHQGWMMUURILY-UHRZLXHJSA-N 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 210000003563 lymphoid tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000010606 normalization Methods 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 229960004618 prednisone Drugs 0.000 description 1
- XOFYZVNMUHMLCC-ZPOLXVRWSA-N prednisone Chemical compound O=C1C=C[C@]2(C)[C@H]3C(=O)C[C@](C)([C@@](CC4)(O)C(=O)CO)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 XOFYZVNMUHMLCC-ZPOLXVRWSA-N 0.000 description 1
- 229930010796 primary metabolite Natural products 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 238000007670 refining Methods 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001291 vacuum drying Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P33/00—Preparation of steroids
Landscapes
- Organic Chemistry (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
本发明公开了一种醋酸泼尼松的发酵方法，该发酵方法包括以下步骤：一级发酵：将成熟的菌体悬浮液分别接种于一号种子罐和二号种子罐中培养形成一号菌丝体和二号菌丝体；将一号菌丝体接种于发酵罐中培养15‑20h后，加入二号菌丝体继续培养16‑22h，再补入种子液继续培养4h；向发酵罐中加入溶剂、醋酸可的松微粉搅拌后进行转化，转化完成后，升温采用乙酸乙酯提取浓缩液得到醋酸泼尼松；本发明中通过分期加入菌丝体，并在二级发酵后期补入种子液，使得整个发酵过程中菌种都保持足够的营养，满足转化要求，获得更高的转化率；同时选用简单节杆菌对醋酸可的松进行转化，转化率更高。
Description
技术领域
本发明属于医药生物领域，特别涉及一种醋酸泼尼松的发酵方法。
背景技术
随着抗生素的大规模生产和深层发酵技术的建立，现代发酵工程制药迅速崛起，从一开始的利用代谢调控发酵生产出各类初级代谢产物，逐渐转化为细胞连续发酵技术。近年来，随着生物工程的发展，使得发酵制药所用的微生物菌种不仅仅局限在天然微生物的范围内。
醋酸泼尼松为白色或几乎白色的结晶性粉末；不溶于水，微溶于乙醇、醋酸乙酯，略溶于丙酮，易溶于氯仿，为肾上腺皮质激素类药物，具有影响糖代谢、抗炎、抗过敏、抗毒、抗恶性淋巴组织疾病等作用。醋酸泼尼松的制备一般都是将醋酸可的松转化为醋酸泼尼松，例如公告号为CN101760495B的专利提出了以节杆菌AS 1.94为转化菌种，将醋酸可的松转化成醋酸泼尼松，但该方法中转化率较低，仅有77.3％；同样公开号为CN 106893754 A的专利公开了以节杆菌AS 1.754为转化菌种，转化过程产生了8.2％的泼尼松杂质。上述方法在制备醋酸泼尼松时其转化率均不高，且会有杂质产生。
发明内容
针对上述问题，本发明公开了一种醋酸泼尼松的发酵方法，所述发酵方法包括以下步骤：
一级发酵：将菌体悬浮液分别接种于一号种子罐和二号种子罐中培养形成一号菌丝体和二号菌丝体；
二级发酵：将一号菌丝体接种于发酵罐中培养15-20h后，加入二号菌丝体继续培养16-22h，再补入种子液继续培养4h；
转化：向发酵罐中加入溶剂、醋酸可的松微粉搅拌后进行转化，转化完成后，升温采用乙酸乙酯提取浓缩液得到醋酸泼尼松。
所述孢子液按以下方法获得：
将简单节杆菌移植于斜面培养基，在28℃-30℃的条件下培养5-7天，菌体悬浮液成熟；
将成熟菌体的使用无菌生理盐水制成悬浮液。
进一步地，斜面培养基的成分为葡萄糖1.6％-1.8％、酵母浸膏1.5-1.8％、琼脂1％-1.5％和余量的水。
进一步地，所述一号种子罐中培养条件为：27℃培养40h，罐压为0.01-0.02MPa，搅拌转速为320-360r/min；
所述二号种子罐中培养条件为：二号种子罐中25℃培养40-50h，罐压为0.01-0.02MPa，搅拌转速为320-360r/min。
进一步地，所述一号种子罐和二号种子罐中的种子液组分相同，包括：葡萄糖2.0％-2.2％、棉子粉0.8％-1％、青刺果粉0.8％-1％、酵母浸膏0.8％-1.2％、磷酸二氢钠0.1％和余量的水。
进一步地，所述二级发酵中发酵液的组分和种子液组分相同。
进一步地，所述种子液和发酵液的灭菌温度为118℃-123℃。
进一步地，所述溶剂为甲醇、乙腈、乙醇和丙酮中的一种或几种混合。
进一步地，二级发酵过程中发酵过程优选为：26℃一号菌丝体培养15h时，补入二号菌丝体培养16h时，加入未接种的种子液，继续培养4h，搅拌转速为280r/min。
本发明的有益效果：
本发明中将悬浮液一分为二分开培养形成一号菌丝体和二号菌丝体，在二级发酵过程中分批加入一号菌丝体和二号菌丝体，并在二级发酵后期补入种子液，使得整个发酵过程中菌种都保持足够的营养，满足转化要求，获得更高的转化率；
本发明选用简单节杆菌对醋酸可的松进行转化，转化率更高；本发明中使用的原料均为常见原料，价格便宜大规模生产。
本发明的其它特征和优点将在随后的说明书中阐述，并且，部分地从说明书中变得显而易见，或者通过实施本发明而了解。本发明的目的和其他优点可通过在说明书、权利要求书中所指出的内容来实现和获得。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地说明，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明提出了一种醋酸泼尼松的发酵方法，选用简单节杆菌为转化菌种，将醋酸可的松转化成醋酸泼尼松。
培养基是提供微生物生长繁殖和生物合成各种代谢产物所需要的、按一定比例配制的多种营养物质的混合物。培养基组成对菌体生长繁殖、产物的生物合成、产品的分离精制乃至产品的质量和产量都有重要的影响。微生物的营养活动是依靠向外界分泌大量的酶，将周围环境中大分子蛋白质、糖类、脂肪等营养物质分解成小分子化合物，借助于细胞膜的渗透作用，吸收这些小分子营养物质来实现的。所有的发酵培养基都必须提供微生物生长繁殖和产物合成所需的碳源、氮源、无机元素、生长因子、水和氧气等。对于大规模发酵生产，除考虑上述微生物的需要外，还必须重视培养基原料的价格和来源，本发明中所选用的培养基原料均为市场上简单可购得的，且价格较为适宜，以上仅是本发明涉及的原料组分的示例性展出。
该发酵方法包括以下步骤：
种子液的制备：将简单节杆菌移植于斜面培养基，在28℃-30℃的条件下培养5-7天，种子成熟后，将成熟后的菌体使用无菌生理盐水制成悬浮液，进行真空干燥并进行低温保存；斜面培养基的成分为葡萄糖1.6％-1.8％、酵母浸膏1.5-1.8％、琼脂1％-1.5％和余量的水。
一级发酵：将保存的种子液分别接种于一号种子罐和二号种子罐中，一号种子罐中27℃培养40h得到一号菌丝体，二号种子罐中25℃培养40-50h得到二号菌丝体，罐压均为0.01-0.02MPa，搅拌转速为320-360r/min使种子液处于均匀状态；两个种子罐中的种子液成分均为葡萄糖2.0％-2.2％、棉子粉0.8％-1％、青刺果粉0.8％-1％、酵母浸膏0.8％-1.2％、磷酸二氢钠0.1％和余量的水，种子液多于正常使用量配制。
二级发酵：将一号菌丝体接种于发酵罐中，24-26℃培养15-20h后，利用传感器或者取样计算此时的菌体的比生长速率、氧比消耗速率和产物比生成速率等，补入二号菌丝体继续发酵培养16-22h，再补入未接的种子液，搅拌转速为260-280r/min继续培养，直至取样后的菌丝体镜检无杂菌，菌丝粗壮、密集，原生质丰满，菌丝浮力大方可进行下一步。发酵罐中发酵液的成分和种子液相同，为葡萄糖2.0％-2.2％、棉子粉0.8％-1％、青刺果粉0.8％-1％、酵母浸膏0.8％-1.2％、磷酸二氢钠0.1％和余量的水。
转化：在培养后的发酵液中加入有机溶剂、醋酸可的松微粉(底物)搅拌后进行转化，30-36℃转化30-35h，转速为400-500r/min，反应完成后升温至68℃终止反应，采用乙酸乙酯萃取提取发酵液，将有机相浓缩，测得底物转化率。其中，溶剂包括甲醇、乙腈、乙醇和丙酮中的一种或几种混合，优选为甲醇，甲醇可以增加醋酸可的松的溶解度，增加醋酸可的松的分解速率，该溶剂的浓度低于2％，不对微生物产生毒性，先将醋酸可的松溶解于有机溶剂中，醋酸可的松的加入速度随菌种的转化速率而定，一般浓度为300-700mg/L。
本发明实施例中所选用的部分原料如下表所示：
实施例1
一种醋酸泼尼松的发酵方法包括以下步骤：
种子液的制备：将简单节杆菌移植于斜面培养基，在28℃的条件下培养7天，种子成熟后，将成熟后的节杆菌菌种使用无菌生理盐水制成种子液；斜面培养基的成分为葡萄糖1.6％、酵母浸膏1.5％、琼脂1％和余量的水。
一级发酵：将种子液分别接种于一号种子罐和二号种子罐中，一号种子罐中27℃培养40h，二号种子罐中25℃培养40h，罐压为0.01MPa，搅拌转速为320r/min，分别得到一号菌丝体和二号菌丝体；两个种子罐中的种子液成分均为葡萄糖2.0％、棉子粉0.8％、青刺果粉0.8％、酵母浸膏0.8％、磷酸二氢钠0.1％和余量的水。
二级发酵：将一号菌丝体接种于发酵罐中，26℃培养15h后，补入二号菌丝体继续发酵培养16h后加入未接种孢子的种子液，搅拌转速为260r/min，发酵罐中发酵液的成分和种子液相同。
转化：在培养后的发酵液中加入乙醇、醋酸可的松搅拌后进行转化，转化温度为36℃转化30h，转速为400r/min。反应完成后升温至68℃终止反应，采用乙酸乙酯萃取提取发酵液，将有机相浓缩，测得底物转化率。
实施例2
一种醋酸泼尼松的发酵方法包括以下步骤：
种子液的制备：将简单节杆菌移植于斜面培养基，在29℃的条件下培养6天，种子成熟后，将成熟后的节杆菌菌种使用无菌生理盐水制成种子液；斜面培养基的成分为葡萄糖1.7％、酵母浸膏1.65％、琼脂1.25％和余量的水。
一级发酵：将种子液分别接种于一号种子罐和二号种子罐中，一号种子罐中27℃培养40h，二号种子罐中25℃培养45h，罐压为0.15MPa，搅拌转速为340r/min，分别得到一号菌丝体和二号菌丝体；两个种子罐中的种子液成分均为葡萄糖2.1％、棉子粉0.9％、青刺果粉0.9％、酵母浸膏1％、磷酸二氢钠0.1％和余量的水。
二级发酵：将一号菌丝体接种于发酵罐中，26℃培养15h时，补入二号菌丝体继续发酵培养16h后加入未接种的种子液，搅拌转速为270r/min，发酵罐中发酵液的成分和种子液相同。
转化：在培养后的发酵液中加入乙醇、醋酸可的松搅拌后进行转化，转化温度为33℃转化32h，转速为450r/min。反应完成后升温至68℃终止反应，采用乙酸乙酯萃取提取发酵液，将有机相浓缩，测得底物转化率。
实施例3
一种醋酸泼尼松的发酵方法包括以下步骤：
种子液的制备：将简单节杆菌移植于斜面培养基，在30℃的条件下培养5天，种子成熟后，将成熟后的节杆菌菌种使用无菌生理盐水制成孢子液；斜面培养基的成分为葡萄糖1.8％、酵母浸膏1.8％、琼脂1.5％和余量的水。
一级发酵：将种子液分别接种于一号种子罐和二号种子罐中，一号种子罐中27℃培养40h，二号种子罐中25℃培养50h，罐压为0.02MPa，搅拌转速为360r/min，分别得到一号菌丝体和二号菌丝体；两个种子罐中的种子液成分均为葡萄糖2.2％、棉子粉1％、青刺果粉1％、酵母浸膏1％、磷酸二氢钠0.1％和余量的水。
二级发酵：将一号菌丝体接种于发酵罐中，26℃培养15h时，补入二号菌丝体继续发酵培养16h后加入未接种孢子的种子液，培养4h，搅拌转速为280r/min。发酵罐中发酵液的成分和种子液相同。
转化：在培养后的发酵液中加入乙醇、醋酸可的松搅拌后进行转化，转化温度为30℃转化35h，转速为500r/min。反应完成后升温至68℃终止反应，采用乙酸乙酯萃取提取发酵液，将有机相浓缩，测得底物转化率。
实施例4
一种醋酸泼尼松的发酵方法包括以下步骤：
种子液的制备：将简单节杆菌移植于斜面培养基，在30℃的条件下培养5天，种子成熟后，将成熟后的节杆菌菌种使用无菌生理盐水制成种子液；斜面培养基的成分为葡萄糖1.8％、酵母浸膏1.8％、琼脂1.5％和余量的水。
一级发酵：将种子液分别接种于一号种子罐和二号种子罐中，一号种子罐中27℃培养40h，二号种子罐中25℃培养50h，罐压为0.02MPa，搅拌转速为360r/min，分别得到一号菌丝体和二号菌丝体；两个种子罐中的种子液成分均为葡萄糖2.2％、棉子粉1％、青刺果粉1％、酵母浸膏1％、磷酸二氢钠0.1％和余量的水。
二级发酵：将一号菌丝体接种于发酵罐中，26℃培养17.5h时，补入二号菌丝体继续发酵培养19h后加入未接的种子液，培养4h，搅拌转速为280r/min。发酵罐中发酵液的成分为葡萄糖2.0％、棉子粉1％、青刺果粉1％、酵母浸膏1.2％、磷酸二氢钠0.1％和余量的水。
转化：在培养后的发酵液中加入乙醇、醋酸可的松搅拌后进行转化，转化温度为30℃转化35h，转速为500r/min。反应完成后升温至68℃终止反应，采用乙酸乙酯萃取提取发酵液，将有机相浓缩，测得底物转化率。
实施例5
一种醋酸泼尼松的发酵方法包括以下步骤：
种子液的制备：将简单节杆菌移植于斜面培养基，在30℃的条件下培养5天，种子成熟后，将成熟后的节杆菌菌种使用无菌生理盐水制成种子液；斜面培养基的成分为葡萄糖1.8％、酵母浸膏1.8％、琼脂1.5％和余量的水。
一级发酵：将种子液分别接种于一号种子罐和二号种子罐中，一号种子罐中27℃培养40h，二号种子罐中25℃培养50h，罐压为0.02MPa，搅拌转速为360r/min，分别得到一号菌丝体和二号菌丝体；两个种子罐中的种子液成分均为葡萄糖2.2％、棉子粉1％、青刺果粉1％、酵母浸膏1％、磷酸二氢钠0.1％和余量的水。
二级发酵：将一号菌丝体接种于发酵罐中，26℃培养20h时，补入二号菌丝体继续发酵培养22h后加入的种子液，培养4h，搅拌转速为280r/min。发酵罐中发酵液的成分为葡萄糖2.0％、棉子粉1％、青刺果粉1％、酵母浸膏1.2％、磷酸二氢钠0.1％和余量的水。
转化：在培养后的发酵液中加入乙醇、醋酸可的松搅拌后进行转化，转化温度为0℃转化35h，转速为500r/min。反应完成后升温至68℃终止反应，采用乙酸乙酯萃取提取发酵液，将有机相浓缩，测得底物转化率。
对比例1
一种醋酸泼尼松的发酵方法包括以下步骤：
种子液的制备：将简单节杆菌移植于斜面培养基，在30℃的条件下培养5天，种子成熟后，将成熟后的节杆菌菌种使用无菌生理盐水制成孢子液；斜面培养基的成分为葡萄糖1.8％、酵母浸膏1.8％、琼脂1.5％和余量的水。
一级发酵：将种子液接种于种子罐中，培养40h，罐压为0.02MPa，搅拌转速为360r/min；种子罐中的种子液成分为葡萄糖2.2％、棉子粉1％、青刺果粉1％、酵母浸膏1％、磷酸二氢钠0.1％和余量的水。
二级发酵：将一号种子罐中的菌丝体接种于发酵罐中，26℃培养35h搅拌转速为280r/min，发酵罐中发酵液的成分和种子液相同。
转化：在培养后的发酵液中加入乙醇、醋酸可的松搅拌后进行转化，转化温度为35℃转化30h，转速为500r/min。反应完成后升温至75℃终止反应，采用乙酸乙酯萃取提取发酵液，将有机相浓缩，测得底物转化率。
对比例2
一种醋酸泼尼松的发酵方法包括以下步骤：
种子液的制备：将简单节杆菌移植于斜面培养基，在30℃的条件下培养5天，种子成熟后，将成熟后的节杆菌菌种使用无菌生理盐水制成种子液；斜面培养基的成分为葡萄糖1.8％、酵母浸膏1.8％、琼脂1.5％和余量的水。
一级发酵：将种子液接种于种子罐中，培养45h，罐压为0.02MPa，搅拌转速为360r/min；种子罐中的种子液成分为葡萄糖2.2％、棉子粉1％、青刺果粉1％、酵母浸膏1％、磷酸二氢钠0.1％和余量的水。
二级发酵：将一号种子罐中的菌丝体接种于发酵罐中，26℃培养40.5h，搅拌转速为280r/min。发酵罐中发酵液的成分和种子液相同。
转化：在培养后的发酵液中加入乙醇、醋酸可的松搅拌后进行转化，转化温度为35℃转化30h，转速为500r/min。反应完成后升温至75℃终止反应，采用乙酸乙酯萃取提取发酵液，将有机相浓缩，测得底物转化率。
对比例3
一种醋酸泼尼松的发酵方法包括以下步骤：
种子液的制备：将简单节杆菌移植于斜面培养基，在30℃的条件下培养5天，种子成熟后，将成熟后的节杆菌菌种使用无菌生理盐水制成种子液；斜面培养基的成分为葡萄糖1.8％、酵母浸膏1.8％、琼1.5％和余量的水。
一级发酵：将种子液接种于种子罐中，培养50h，罐压为0.02MPa，搅拌转速为360r/min；种子罐中的种子液成分为葡萄糖2.2％、棉子粉1％、青刺果粉1％、酵母浸膏1％、磷酸二氢钠0.1％和余量的水。
二级发酵：将一号种子罐中的菌丝体接种于发酵罐中，26℃培养48h，搅拌转速为280r/min。发酵罐中发酵液的成分和种子液相同。
转化：在培养后的发酵液中加入乙醇、醋酸可的松搅拌后进行转化，转化温度为35℃转化30h，转速为500r/min。反应完成后升温至75℃终止反应，采用乙酸乙酯萃取提取发酵液，将有机相浓缩，测得底物转化率。
对上述实施例1-5和对比例1-3中的产物进行计算：
底物转化率的测定：转化率用反应过程中转化为产物的底物质量占初始底物总质量的百分比来表示。采用HPLC测定，分离柱为C18柱，检测波长为240nm，流动相是乙腈：水(体积比)＝50：50的溶于流速为1.5mL/min。采用面积归一法计算醋酸可的松转化率。
从上表可知，本发明实施例中的转化率均高于对比例中的转化率，且在其它条件相同的情况下，在一号种子罐中的菌丝体培养条件为26℃培养15h时，再补入二号种子罐中的菌丝体继续发酵培养16h后加入未接种孢子的种子液，培养4h，搅拌转速为280r/min，这个方案培养条件下转化率最高(即实施例3的方案)。
尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。
Claims (9)
1.一种醋酸泼尼松的发酵方法，其特征在于，
所述发酵方法包括以下步骤：
一级发酵：将菌体悬浮液分别接种于一号种子罐和二号种子罐中培养形成一号菌丝体和二号菌丝体；
二级发酵：将一号菌丝体接种于发酵罐中培养15-20h后，加入二号菌丝体继续培养16-22h，再补入种子液继续培养4h；
转化：向发酵罐中加入溶剂、醋酸可的松微粉搅拌后进行转化，转化完成后，升温采用乙酸乙酯提取浓缩液得到醋酸泼尼松。
2.根据权利要求1所述的醋酸泼尼松的发酵方法，其特征在于，
所述孢子液按以下方法获得：
将简单节杆菌移植于斜面培养基，在28℃-30℃的条件下培养5-7天，孢子成熟；
将成熟后的简单节杆菌使用无菌生理盐水制成菌体悬浮液。
3.根据权利要求2所述的醋酸泼尼松的发酵方法，其特征在于，
斜面培养基的成分为葡萄糖1.6％-1.8％、酵母浸膏1.5-1.8％、琼脂1％-1.5％和余量的水。
4.根据权利要求1所述的醋酸泼尼松的发酵方法，其特征在于，
所述一号种子罐中培养条件为：27℃培养40h，罐压为0.01-0.02MPa，搅拌转速为320-360r/min；
所述二号种子罐中培养条件为：二号种子罐中25℃培养40-50h，罐压为0.01-0.02MPa，搅拌转速为320-360r/min。
5.根据权利要求4所述的醋酸泼尼松的发酵方法，其特征在于，
所述一号种子罐和二号种子罐中的种子液组分相同，包括：葡萄糖2.0％-2.2％、棉子粉0.8％-1％、青刺果粉0.8％-1％、酵母浸膏0.8％-1.2％、磷酸二氢钠0.1％和余量的水。
6.根据权利要求1所述的醋酸泼尼松的发酵方法，其特征在于，
所述二级发酵中发酵液的组分和种子液组分相同。
7.根据权利要求5或6所述的醋酸泼尼松的发酵方法，其特征在于，所述种子液和发酵液的灭菌温度为118℃-123℃。
8.根据权利要求1所述的醋酸泼尼松的发酵方法，其特征在于，
所述溶剂为甲醇、乙腈、乙醇和丙酮中的一种或几种混合。
9.根据权利要求1所述的醋酸泼尼松的发酵方法，其特征在于，
二级发酵过程中发酵过程优选为：26℃一号菌丝体培养15h时，补入二号菌丝体培养16h时，加入未接种孢子的种子液，继续培养4h，搅拌转速为280r/min。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202111143524.2A CN113817795B (zh) | 2021-09-28 | 2021-09-28 | 一种醋酸泼尼松的发酵方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202111143524.2A CN113817795B (zh) | 2021-09-28 | 2021-09-28 | 一种醋酸泼尼松的发酵方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN113817795A true CN113817795A (zh) | 2021-12-21 |
| CN113817795B CN113817795B (zh) | 2023-10-27 |
Family
ID=78915875
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202111143524.2A Active CN113817795B (zh) | 2021-09-28 | 2021-09-28 | 一种醋酸泼尼松的发酵方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN113817795B (zh) |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103695520A (zh) * | 2013-12-09 | 2014-04-02 | 天津科技大学 | 醋酸可的松转化中固定化细胞和环糊精循环利用的方法 |
| CN106893754A (zh) * | 2015-12-21 | 2017-06-27 | 天津金耀集团有限公司 | 一种通过生物发酵一步制备泼尼松的方法 |
| CN108588163A (zh) * | 2018-04-28 | 2018-09-28 | 浙江仙琚制药股份有限公司 | 制备醋酸泼尼松的方法 |
| CN112608969A (zh) * | 2020-12-22 | 2021-04-06 | 华中药业股份有限公司 | 一种醋酸泼尼松的制备方法 |
-
2021
- 2021-09-28 CN CN202111143524.2A patent/CN113817795B/zh active Active
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103695520A (zh) * | 2013-12-09 | 2014-04-02 | 天津科技大学 | 醋酸可的松转化中固定化细胞和环糊精循环利用的方法 |
| CN106893754A (zh) * | 2015-12-21 | 2017-06-27 | 天津金耀集团有限公司 | 一种通过生物发酵一步制备泼尼松的方法 |
| CN108588163A (zh) * | 2018-04-28 | 2018-09-28 | 浙江仙琚制药股份有限公司 | 制备醋酸泼尼松的方法 |
| CN112608969A (zh) * | 2020-12-22 | 2021-04-06 | 华中药业股份有限公司 | 一种醋酸泼尼松的制备方法 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| SHUHONG MAO，等: "Evaluation of deep eutectic solvents as co-solvent for steroids 1-en-dehydrogenation biotransformation by Arthrobacter simplex", J CHEM TECHNOL BIOTECHNOL * |
| 李静文: "简单节杆菌生物催化倍他米松中间体C1，2位脱氢的研究", 中国优秀硕士学位论文全文数据库 * |
| 龚万本，等: "简单节杆菌催化6α-甲基醋酸可的松C1,2 脱氢动力学", 高校化学工程学报 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN113817795B (zh) | 2023-10-27 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN102061320B (zh) | 11α，17α-二羟基-雄甾-4-烯-3，20-二酮的制备方法 | |
| CN117431292B (zh) | 一种一步发酵法制备地塞米松环氧水解物的方法 | |
| CN104561140B (zh) | 一种发酵制备柠檬酸的方法 | |
| CN113817795B (zh) | 一种醋酸泼尼松的发酵方法 | |
| CN108085359B (zh) | 一种11α-羟基-4-烯-3,17-雄甾二酮的生产方法 | |
| CN110066846A (zh) | 一种制备倍他米松中间体的方法 | |
| CN102181490B (zh) | 一种生产柠檬酸的方法 | |
| JPH06508763A (ja) | ナタマイシンの連続製造法 | |
| CN104862238B (zh) | 一株酿酒酵母及其应用 | |
| CN112980910A (zh) | 一种在相转移催化剂体系中微生物转化11α-羟基坎利酮的方法 | |
| CN110656131A (zh) | 一种放线菌抗菌次生代谢产物的制备方法 | |
| CN105483028B (zh) | 一种利用赤霉菌合成11α,15α-diOH-沃氏氧化物的方法 | |
| CN105112473A (zh) | 一种低聚果糖-新科斯糖的生产工艺 | |
| CN106591155B (zh) | 尖孢镰刀菌株及其在制备3β，7α，15α-三羟基雄甾-5-烯-17-酮中的应用 | |
| CN106957882A (zh) | 一种发酵制备柠檬酸的方法 | |
| CN1528906A (zh) | 一种发酵制备天然番茄红素的工艺 | |
| CN106497995B (zh) | 一种多阶段发酵生产利普司他汀的方法 | |
| RU2366712C2 (ru) | Способ получения лимонной кислоты, альфа-амилазы и глюкоамилазы | |
| CN109852658A (zh) | 一种利用微生物转化制备宝丹酮的方法 | |
| CN111041062B (zh) | 一种甾体化合物的制备方法 | |
| CN114292893B (zh) | 一种在vc混菌种子罐中添加多种微量元素缩短发酵周期提高产酸收率的方法 | |
| CN114875104B (zh) | 一种桑叶酵素原液及其制备方法和应用 | |
| CN102286595B (zh) | 一种短刺小克银汉霉转化白桦脂醇合成白桦脂酸的方法 | |
| CN110982716B (zh) | 用于生产天然酪醇的菌株及天然酪醇的制备方法 | |
| CN108330120B (zh) | 好食脉孢菌生产复合酶并联产维生素b12的发酵方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |