CN113817639A - 高效玉米秸秆降解复合菌剂及其制备方法和其应用 - Google Patents

高效玉米秸秆降解复合菌剂及其制备方法和其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种高效玉米秸秆降解复合菌剂，包括放线菌Streptomyces sp.CTM001(保藏编号：CGMCC No.19310)、Streptomyces sp.CTM002(保藏编号：CGMCC No.23358)和Streptomyces sp.CTM003(保藏编号：CGMCC No.23359)。所述复合菌剂可直接用于玉米秸秆还田，具体步骤为将接种了复合菌剂的玉米秸秆，于玉米播种前10‑15天翻埋入土壤20‑30cm深处。本发明筛选获得的复合菌剂，可耐受低温、高温(4‑40℃)和复杂的酸性、碱性环境(pH耐受范围5‑11)，对环境具有普适性，适用于秸秆还田的复杂环境。秸秆降解速率显著加快，当季玉米秸秆即可达到最高80％以上的降解率。

Description

高效玉米秸秆降解复合菌剂及其制备方法和其应用
技术领域
本发明涉及微生物领域，尤其涉及高效玉米秸秆降解复合菌剂及其制备方法和其应用。
背景技术
东北地区每年产出玉米秸秆数量约为1.5亿t，而玉米秸秆还田作为东北黑土保护的技术措施，其生产力提升、资源利用及环境保护等方面意义十分重大。还田秸秆降解是在一定土壤、水热气候条件下在土壤微生物作用下完成的，通过多种形式的玉米秸秆还田技术，可以在一定程度上可以增加土壤有机质，改善土壤理化性质，减少秸秆中磷、钾养分的流失。
近年来，许多学者筛选出了一些具有降解玉米秸秆能力的菌株，包括放线菌、黑曲霉和枯草芽孢杆菌，但单一菌株对促进玉米秸秆直接还田的效果不佳，主要原因包括：一是现有菌株的筛选大多仅以纤维素的降解为筛选指标，忽略了该菌株是否具有降解玉米秸秆中其他两种主要成分(半纤维素和木质素)的能力。玉米秸秆的主要成分是纤维素，除此之外，它还含有半纤维素、木质素、少量的结构蛋白和一些矿质元素，这些元素形成了坚固的组织，直接影响纤维素的降解率。二是现有菌株多数耐低温性能较差，无法适应玉米秸秆直接还田的复杂温度变化，导致玉米秸秆直接还田降解速度缓慢，年降解率仅为45％-60％、3年累计降解率也仅为80％-90％，秸秆长期留存于土壤中，影响土壤肥力，带来了作物播种难及出苗质量差等问题，造成下一季的作物一定程度的减产。因此，秸秆降解需要不同的微生物参与完成，对如何把筛选到的优良菌株进行优化组合，提高玉米秸秆降解率，加速玉米秸秆分解，对于提高秸秆还田的经济、生态与环境效益十分必要。
发明内容
本发明的目的在于提供一种高效玉米秸秆降解复合菌剂，包括放线菌Streptomyces sp.CTM001(保藏编号：CGMCC No.19310)、放线菌 Streptomyces sp.CTM002(保藏编号：CGMCC No.23358)和放线菌 Streptomyces sp.CTM003(保藏编号：CGMCCNo.23359)。
本发明优选的技术方案中，所述复合菌剂还包括黑曲霉、枯草芽孢杆菌中的任一种或其组合。
本发明优选的技术方案中，所述黑曲霉为有效活菌数不低于10亿 /g的黑曲霉菌剂。
本发明优选的技术方案中，所述枯草芽孢杆菌为有效活菌数不低于 10亿/g的枯草杆菌菌剂。
本发明优选的技术方案中，所述复合菌剂的有效活菌数不低于109个/ml。
本发明优选的技术方案中，所述复合菌剂的制备方法为，将复合菌剂中的每个菌分别制成有效活菌数不低于109个/mL的菌液，再将各个菌液按等比例体积混合，即得复合菌剂。
本发明优选的技术方案中，所述放线菌菌液的制备方法为：将放线菌菌株划线在高氏1号固体培养基上，28-30℃培养5-7d，待产孢后，用无菌水洗下孢子，再按3-5％的接种量接种于ISP2号培养基中， 180-200rmp/min摇床下，30-40℃培养5-10天，得菌液，菌液中有效活菌数不低于109个/mL。
本发明优选的技术方案中，所述黑曲霉菌液的制备方法为：将黑曲霉菌剂按1:10-15的固液比(g/ml)的比例加入到察氏液体培养基中， 180-200rmp/min摇床下，28-30℃培养1-2h，得菌液，菌液中有效活菌数量不低于109个/mL。
本发明优选的技术方案中，所述枯草芽孢杆菌菌液的制备方法为：将枯草芽孢杆菌菌剂按1:10-15的固液比(g/ml)的比例加入到LB液体培养基中，28-30℃培养1-2h，得菌液，菌液中有效活菌数不低于109个/mL。
本发明优选的技术方案中，所述高氏1号固体培养基配方组成为：可溶性淀粉2％，FeSO4·7H2O 0.001％，KNO3 0.1％，NaCl 0.05％，MgSO4·7H2O 0.05％，K2HPO4·3H2O0.05％，琼脂2％，pH 7.4-7.6。
本发明优选的技术方案中，所述ISP2号培养基的配方组成为葡萄糖0.4％，麦芽浸粉1％，酵母提取物0.4％，琼脂2％，pH 7.0-7.4。
本发明优选的技术方案中，察氏液体培养基：硝酸钠3g、磷酸氢二钾1g、硫酸镁0.5g、氯化钾0.5g、硫酸亚铁0.01g、蔗糖30g、蒸馏水 1000ml。
本发明优选的技术方案中，所述LB液体培养基配方组成为：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g。蒸馏水1000ml，pH 7.0。
本发明的另一目的在于提供本发明所述高效玉米秸秆降解复合菌剂在玉米秸秆还田中的应用。
本发明优选的技术方案中，所述应用的具体步骤为：将接种了复合菌剂的玉米秸秆，于玉米播种前10-15天翻埋入土壤20-30cm深处。
本发明优选的技术方案中，复合菌剂的有效活菌数不低于109个/ml。
本发明优选的技术方案中，所述复合菌剂在玉米秸秆上的接种量为 3-5％。
本发明优选的技术方案中，所述玉米秸秆在接种复合菌剂前，压扁并截成1-5cm小段，在70-80℃下烘干。
本发明优选的技术方案中，所述土壤温度为1-40℃，优选为4-30℃。
本发明优选的技术方案中，所述土壤pH值为5-11，优选为6-7。
除非另有说明，本发明涉及液体与液体之间的百分比时，所述的百分比为体积/体积百分比；本发明涉及液体与固体之间的百分比时，所述百分比为体积/重量百分比；本发明涉及固体与液体之间的百分比时，所述百分比为重量/体积百分比；其余为重量/重量百分比。
除非另有说明，本发明采用如下方法测试：
(1)纤维素，木质素，半纤维素，灰分等主要成分的测定参照范氏洗涤法。
(2)纤维素降解率(％)＝(处理前纤维素量-处理后纤维素量)/ 处理前纤维素量×100％；
半纤维素降解率(％)＝(处理前半纤维素量-处理后半纤维素量)/ 处理前半纤维素量×100％；
木质素降解率(％)＝(处理前木质素量-处理后木质素量)/处理前木质素量×100％。
秸秆降解率(％)＝(还田前秸秆重量-还田后残留秸秆重量)/还田前秸秆重量×100％。
与现有技术相比，本发明具有下述有益技术效果：
1.本发明自东北高寒地区秸秆堆下农田土壤和深山林地土壤筛选筛选出3株菌株Streptomyces sp.CTM001、Streptomyces sp.CTM002 和Streptomyces sp.CTM003，纤维素、半纤维素及木质素的降解能力强，将3株菌株复配，或与黑曲霉、枯草芽孢杆菌复配，得到多种复合菌剂，均比单一菌株具有更高的秸秆降解效率。
2.本发明筛选获得的复合菌剂，可耐受低温、高温(4-40℃)和复杂的酸性、碱性环境(pH耐受范围5-11)，对环境具有普适性，适用于秸秆还田的复杂环境，秸秆降解速率显著加快，黑龙江省冷寒地区玉米播种到收获一个生长季节(5月1日-10月1日)，直接还田玉米秸秆可达到最高80％以上的降解率。
3.本发明通过将接种了复合菌剂的玉米秸秆直接还田，实现了玉米秸秆的高效降解，同时增强土壤肥力，实现了废物的资源化利用。该还田应用操作方便，成本低，适用于工业化生产。
附图说明
图1实施例3中CTM001菌液、CTM002菌液、CTM003菌液、复合菌剂1-3的玉米秸秆室内降解率比较
图2实施例4中空白组、对照组、试验组1-3的40天玉米秸秆还田降解率比较
图3实施例4中空白组、对照组、试验组1-3的全生育期玉米秸秆还田降解率比较
具体实施方式
以下结合实施例对本发明做进一步的说明。
实施例1高效玉米秸秆降解菌的筛选
1.土壤样品采集
实验材料采自黑龙江省大兴安岭地区漠河市图强镇(52.55°N，122.47°E)的深山林地土壤，黑龙江省黑河市(50.25°N，127.48°E) 秸秆堆下农田土壤、伊春市(46.48°N，128.29°E)的深山林地土壤，五大连池市(48.17°N，126.35°E)、逊克县(47.58°N，129.17°E)和北安县(47.35°N，127.51°E)的秸秆堆下农田土壤。每个地区采集5个地点，每个地点取5个点混合。
2.制备培养基
(1)分离培养基(AAG氨基酸培养基或DPA培养基)：
AAG氨基酸培养基：苏氨酸0.05％，丙氨酸0.05％，丝氨酸0.05％，精氨酸0.05％，菌多糖2％，pH 7.2-7.4。
DPA培养基：甜醇0.2％，脯氨酸0.05％，NaCl 0.03％，MgSO4·7H2O 0.1％，K2HPO40.03％，CaCl2·2H2O 0.1％，琼脂2％，pH 7.2-7.4。
(2)燕麦琼脂培养基：2％燕麦片水煮30min，过滤，滤液定容到 100mL，MgSO40.02％，KNO3 0.02％，K2HPO4 0.05％，琼脂2％。
(3)纤维素刚果红培养基：CMC-Na 2.0g，(NH4)2SO4 2.0g，MgSO4·7H2O 0.5g，K2HPO4 1.0g，NaCl 0.5g，刚果红0.4g，琼脂20g，水1000 mL，pH 7.0。
2.菌株的筛选
(1)土壤预处理：土样自然阴干，研钵磨成细粉，置于三角瓶中，加入适量灭菌玻璃珠，置于180rpm空气振荡器中摇动半小时，稀释后涂于分离培养基表面。
(2)菌株分离：向分离培养基中，依次加入荼啶酮酸20mg/L、放线菌酮50mg/L和重铬酸钾50mg/L，于28℃恒温箱中倒置培养2-3周，将长出的放线菌转接到分离培养基上，继续培养2-3周，观察并记录。
(3)菌株纯化：将分离培养基上得到的放线菌划线转接到燕麦琼脂培养基，培养2-3周后得到单菌落的放线菌。
(4)刚果红透明圈筛选：分别在纤维素和半纤维素为唯一碳源的固体平板培养基中加入刚果红，固体培养基呈现红色。然后将单菌落放线菌点接至红色平板培养基上，在恒定培养箱中培养一周后，在平板上的部分菌落周围形成了透明圈和菌落生长圈，菌落直径与透明圈直径的比值反映了菌株产纤维素酶、半纤维素酶的能力。
(5)滤纸崩解实验筛选：再对菌株进行滤纸条崩解实验。“+++”表示滤纸不定型，近似糊状，反映了菌株降解纤维素、木质素、半纤维素的能力。结合刚果红透明圈筛选和滤纸崩解实验筛选结果，得到产酶效果最好的3株菌。
表1
菌名 菌落直径d(mm) 透明圈直径D(mm) 比值D/d 滤纸条崩解情况
1 4 23 5.75 +++
2 3 16 5.3 +++
3 3 15 5 +++
注：“+”表示滤纸边缘出现毛边；“++”表示滤纸弯曲，不成糊状；“+++”表示滤纸不定型，近似糊状。
(6)菌株生物保藏：经鉴定，菌株1、2和3为放线菌，将其依次命名为Streptomycessp.CTM001、Streptomyces sp.CTM002和 Streptomyces sp.CTM003，保藏编号分别为：CGMCC No.19310、CGMCC No.23358、CGMCC No.23359，保藏单位为：中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期分别为2020年1月7日、2021年9月3日、2021年9月3日。3株菌株可生长温度范围在分别为4-38℃、18-40℃和18-40℃；pH耐受范围分别为5-11、6-10和6-11。
实施例2高效玉米秸秆降解复合菌剂的制备
(1)培养基制备
高氏一号培养基：可溶性淀粉2％，FeSO4·7H2O 0.001％，KNO3 0.1％， NaCl0.05％，MgSO4·7H2O 0.05％，K2HPO4·3H2O 0.05％，Ager 2％，pH 7.4-7.6。
ISP2号培养基：葡萄糖0.4％，麦芽浸粉1％，酵母提取物0.4％，Ager2％，pH 7.0-7.4。
LB液体培养基：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g。蒸馏水 1000ml，pH 7.0。
察氏液体培养基：硝酸钠3g、磷酸氢二钾1g、硫酸镁0.5g、氯化钾0.5g、硫酸亚铁0.01g、蔗糖30g、蒸馏水1000ml。
(2)菌剂制备
取实施例1所得的放线菌CTM001、CTM002、CTM003和黑曲霉菌剂 (商购于山东长泰生物科技有限公司，有效活菌数不低于10亿/g)、枯草芽孢杆菌菌剂(商购于保定瑞谷生物科技有限公司，有效活菌数不低于10亿/g)。
放线菌菌液制备：分别将保存于-80℃冰箱的放线菌CTM001、 CTM002、CTM003划线在高氏1号固体培养基，28℃培养5d，待产孢后，用无菌水洗下孢子，再按3％的接种量接种于ISP2号培养基中， 180rmp/min摇床下，30℃培养10天，得CTM001菌液、CTM002菌液、CTM003菌液，3种菌液中有效活菌数均不低于109个/mL。
黑曲霉菌液制备：取黑曲霉菌剂20g，加入到200ml察氏液体培养基中，180rmp/min摇床下，30℃培养2h，得菌液，菌液中有效活菌数不低于109个/mL。
枯草芽孢杆菌菌液制备：取枯草芽孢杆菌菌剂20g，加入到200mlLB 液体培养基中，180rmp/min摇床下，30℃培养2h，得菌液，菌液中有效活菌数量不低于109个/mL。
复合菌剂1制备：将CTM001菌液、CTM002菌液、CTM003菌液，按等体积比混合得复合菌剂1。
复合菌剂2制备：将CTM001菌液、CTM002菌液、CTM003菌液、黑曲霉菌液，按等体积比混合得复合菌剂2。
复合菌剂3制备：将CTM001菌液、CTM002菌液、CTM003菌液、黑曲霉菌液、枯草芽孢杆菌菌液，按等体积比混合得复合菌剂3。
实施例3高效玉米秸秆降解复合菌剂的室内降解实验
秸秆为秋季收获后，采集于黑龙江省农业科学院科技园区，玉米秸秆主要成分见表2。将获取的玉米秸秆于80℃下烘干，用中药压碎研磨机粉碎处理后过40目筛，储存备用。
表2玉米秸秆主要成分
Figure RE-GDA0003369930690000101
将CTM001菌液、CTM002菌液、CTM003菌液、复合菌剂1、复合菌剂2、复合菌剂3按5％的接种量分别加入到150ml发酵培养基中，加入粉碎40目玉米秸秆30g，调节pH值7.0，在转速210rpm/min下30℃培养7天后，取发酵后的玉米秸秆，烘干，测定烘干产物中纤维素、半纤维素和木质素含量，计算降解率，见图1。
发酵培养基：葡萄糖0.5％，谷氨酸2％，K2HPO4·3H2O 0.2％，MgSO4·7H2O 0.05％，FeSO4·7H2O 0.005％，ZnSO4·7H2O 0.005％，CaCl2·2H2O 0.01％，pH 7.2。
实施例4高效玉米秸秆降解复合菌剂的还田试验
大田试验于黑龙江省农业科学院科技园区，属于寒温带大陆性气候，年降水量500～550mm之间，无霜期140d左右，≥10℃积温2700℃左右。试验期间土壤耕层20cm温度在1.55-24.22℃。将试验田划分为四块实验区域，每块区域中土壤面积为7.14m2，土壤采集于黑龙江省农业科学院科技园区，土壤pH值为6.66。
秸秆采集于黑龙江省农业科学院科技园区，玉米秸秆成分见表2。将压扁并截成1cm小段的玉米秸秆于80℃下烘干，待用。
称取20g玉米秸秆，处理后放入尼龙网袋中，用尼龙线缝好封口，埋入20cm土层中。尼龙网袋的大小为34cm×36cm，孔径为80目。设置4组试验组：
空白组：秸秆中不加微生物菌剂，添加0.6ml蒸馏水。
对照组：秸秆中添加沃宝秸秆腐熟剂0.05g(购买自河南省沃宝生物科技有限公司，有效活菌数不低于1亿/g)和0.6ml蒸馏水。
试验组1：秸秆中添加0.6ml实施例2制备得到的复合菌剂1。
试验组2：秸秆中添加0.6ml实施例2制备得到的复合菌剂2。
试验组3：秸秆中添加0.6ml实施例2制备得到的复合菌剂3。
在4月20日(玉米播种前10天)埋入土壤中，40天后取出秸秆，烘干，计算烘干产物的降解率，结果见图2。
在4月20日(玉米播种前10天)埋入土壤中，10月1日取出秸秆，烘干，计算烘干产物的降解率，结果见图3。
以上对本发明具体实施方式的描述并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变或变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明权利要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种高效玉米秸秆降解复合菌剂，其特征在于，包括放线菌Streptomycessp.CTM001(保藏编号：CGMCC No.19310)、放线菌Streptomyces sp.CTM002(保藏编号：CGMCC No.23358)和放线菌Streptomyces sp.CTM003(保藏编号：CGMCC No.23359)。
2.如权利要求1所述的复合菌剂，其特征在于，所述复合菌剂还包括黑曲霉、枯草芽孢杆菌中的任一种或其组合，优选所述黑曲霉为有效活菌数不低于10亿/g的黑曲霉菌剂，所述枯草杆菌为有效活菌数不低于10亿/g的枯草杆菌菌剂。
3.如权利要求1-2任一项所述的复合菌剂，其特征在于，所述复合菌剂的制备方法为，将复合菌剂中的每个菌分别制成有效活菌数不低于109个/mL的菌液，再将各个菌液按等比例体积混合，即得复合菌剂，优选所述复合菌剂的有效活菌数不低于109个/ml。
4.如权利要求1-3任一项所述的复合菌剂，其特征在于，所述放线菌菌液的制备方法为：将放线菌菌株划线在高氏1号固体培养基上，28-30℃培养5-7d，待产孢后，用无菌水洗下孢子，再按3-5％的接种量接种于ISP2号培养基中，180-200rmp/min摇床下，30-40℃培养5-10天，得菌液，菌液中有效活菌数不低于109个/mL。
5.如权利要求1-4任一项所述的复合菌剂，其特征在于，所述黑曲霉菌液的制备方法为：将黑曲霉菌剂按1:10-15的固液比(g/ml)的比例加入到察氏液体培养基中，180-200rmp/min摇床下，28-30℃培养1-2h，得菌液，菌液中有效活菌数量不低于109个/mL。
6.如权利要求1-5任一项所述的复合菌剂，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌菌液的制备方法为：将枯草芽孢杆菌菌剂按1:10-15的固液比(g/ml)的比例加入到LB液体培养基中，28-30℃培养1-2h，得菌液，菌液中有效活菌数量不低于109个/mL。
7.如权利要求1-6任一项所述的高效玉米秸秆降解复合菌剂在玉米秸秆还田中的应用。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述应用的具体步骤为：将接种了复合菌剂的玉米秸秆，于玉米播种前10-15天翻埋入土壤20-30cm深处，优选所述复合菌剂在玉米秸秆上的接种量为3-5％。
9.如权利要求7-8任一项所述的应用，其特征在于，所述土壤温度为1-40℃，优选为4-30℃。
10.如权利要求7-9任一项所述的应用，其特征在于，所述土壤pH值为5-11，优选为6-7。
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