CN113812625A - 六堡茶在制备防治淀粉样蛋白疾病的功能性产品中的应用 - Google Patents

Abstract

六堡茶在制备防治淀粉样蛋白疾病的功能性产品中的应用，其中，六堡茶以六堡茶干粉末、六堡茶热水提取物或其浓缩物添加至功能性产品中。六堡茶在制备防治淀粉样蛋白疾病的功能性产品中的应用，其功能性产品多样化，如药品、保健品、食品或饮料等；且六堡茶添加至功能性产品中的形式多样化，如六堡茶直接添加、六堡茶粉碎后或通过热水浸提后的提取物或六堡茶提取后的浓缩物等；该功能性产品的应用领域广泛，且加工工艺简单。

Description

六堡茶在制备防治淀粉样蛋白疾病的功能性产品中的应用

技术领域

本发明涉及医药保健品领域，尤其是涉及六堡茶在制备防治淀粉样蛋白疾病的功能性产品中的应用。

背景技术

茶被誉为“世界三大饮料之一”，按其发酵程度可依次分为绿茶、白茶、黄茶、青茶、红茶、黑茶六大类。各种茶的生物活性成分有所差别，绿茶经杀青，酶活性被破坏，鲜叶中的成分得到最多的保留，其中茶多酚含量约20％-35％，表没食子儿茶素没食子酸酯(Epigallocatechin gallate,EGCG)占茶多酚的50％-60％。白茶和黄茶属于轻发酵茶，内含成分与绿茶有些相似。乌龙茶为半发酵的茶，所用原料为成熟鲜叶，含有更为丰富的茶多酚类化合物。红茶为全发酵茶，含有丰富的茶黄素、茶红素和茶褐素等氧化聚合多酚。黑茶为后发酵茶，在微生物的转化作用下，功效成分更为复杂，含有更多的有机酸、茶褐素和碱性多酚等化合物。发酵茶不仅在风味方面与绿茶有所不同，且根据具体的发酵过程和微生物的种类，其在活性成分的种类和含量方面也有很大差异。

六堡茶是黑茶中的典型代表之一，属山茶科常绿灌木，叶呈长椭圆披针形，叶色褐黑光润，间有黄花点，叶底红褐。六堡茶素以“红、浓、陈、醇”四绝著称。其条索长整紧结，汤色红浓，香气陈厚，滋味甘醇可口。正统应带松烟和槟榔味，叶底铜褐色。

六堡茶的制作是采用当地的大叶种茶树的鲜叶作为原料，采摘标准是成熟新梢的一芽二三叶或一芽三四叶，经杀青、揉捻、渥堆、复揉、干燥5道工序制成，其中，渥堆是形成六堡茶独特品质的关键性工序，其目的是通过渥堆湿热作用，促进内含物质的变化，减掉苦涩味，使滋味变醇，消除青臭气，并使叶色变为深黄褐青。

淀粉样蛋白(Amyloid-protein)通常被认为是不同序列、结构和功能的蛋白质自组装成形态相似、富含β-sheet的纤维聚集体。现代研究已确定约60种蛋白质能形成纤维聚集体，其中，至少36种蛋白与家族性淀粉样变性、帕金森病、阿尔茨海默症、Ⅱ型糖尿病等人类淀粉样疾病相关；另外，淀粉样蛋白聚集和纤维形成还能导致血管性淀粉样病变。

至今，用于淀粉样蛋白疾病的药物主要包括：①乙酰胆碱酯酶抑制剂，②兴奋性氨基酸受体拮抗剂，③抗炎药物，④神经营养因子，⑤中药复方药，如黄连解毒汤、当归芍药散等，但现有药物并不能根治淀粉样蛋白疾病。

目前，针对绿茶和单体成分EGCG、茶黄素、茶多酚等物质的应用及作用机理的研究报道较多，如CN1317313A_茶多酚在制备抑制β－淀粉样蛋白(β-amyloid)聚集和纤维形成的药物中的应用、CN109843087A包含新的后发酵茶来源的山奈酚类化合物的认知功能改善组合物；但目前暂未公开利用六堡茶对预防或治疗淀粉样蛋白疾病的应用的相关报道。

发明内容

本发明要解决的技术问题是：克服现有技术的不足，提供六堡茶的新用途，具体的说，六堡茶在制备防治(即，预防和/或治疗)淀粉样蛋白疾病的功能性产品中的应用，为淀粉样蛋白相关疾病的治疗或预防提供新的药物或具有保健功能的食品或饮料。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

六堡茶在制备防治淀粉样蛋白疾病的功能性产品中的应用，其作用机制为：六堡茶(T4)为后发酵茶，经渥堆后，茶叶中的多酚类物质发生氧化聚合会形成一类高分子聚合物，具有较强的体内抗氧化活性，可以有效提高早衰型SAMP8高脂模型小鼠的抗氧化应激酶活性水平，使其体内的丙二醛(MDA)含量显著下降；且六堡茶能使β-amyloid的水平显著下降，进而抑制淀粉样蛋白的形成。

优选，六堡茶以六堡茶茶叶及其干粉末、六堡茶热水提取物或其浓缩物添加至功能性产品中。

在某一示范实施例中，所述六堡茶提取物采用热水浸提法制备，所述热水浸提法的具体操作为：取定量的六堡茶茶叶，按茶水比为1:8～1:12(w/w)注入沸水，然后，将茶水煮沸并维持微沸或在100℃水浴锅中保温浸提45～60min，过滤，重复浸提2～3次，合并茶汤；茶汤冷却至后放入-20℃预冻，预冻后在-42℃真空条件下进行冷冻干燥得到六堡茶提取物，最后装袋保存于-20℃。

所述六堡茶提取物的用量≥50μg/mL，优选，六堡茶提取物的用量为250～500μg/mL。

在某一示范实施例中，所述六堡茶提取物的抗氧化能力的平均半有效浓度EC50值为486±30.4μg/mL。

由于六堡茶具有较强的体内抗氧化能力，因此，防治淀粉样蛋白疾病的功能性产品为具有预防或治疗淀粉样蛋白疾病作用且含六堡茶或含六堡茶有效成分的药品或保健食品、或采用六堡茶或其粉末制成的饮料，其中药物可以采用口服剂型，如片剂、颗粒剂、胶囊剂、口服液等，也可以加入食物中食用。

在某一示范实施例中，六堡茶在制备防治淀粉样蛋白疾病的功能性产品中的应用，六堡茶与防治淀粉样蛋白疾病的西药复方制成复方制剂。

在某一示范实施例中，六堡茶与防治淀粉样蛋白疾病的中药如当归药散复方制成复方制剂。

本发明六堡茶在制备防治淀粉样蛋白疾病的功能性产品中的应用的有益效果：

本发明探究了六堡茶对淀粉样蛋白成纤维的作用机理，且明确：六堡茶通过其自身的体内强抗氧化能力及茶多酚等有效成分，进而抑制淀粉样蛋白的形成及淀粉样蛋白成纤维的作用过程。当六堡茶提取物的浓度达到250μg/mL以上，通过高效抑制MDA的形成及其参与的羰-氨交联反应，同时高效阻止淀粉样蛋白β-sheet结构的形成，进而达到对淀粉样蛋白的形成的显著、高效抑制作用。

在基于茶叶中富含茶多酚、酯型儿茶素等成分而对淀粉样蛋白形成起抑制作用的分析方向上，本发明通过分析六堡茶对抑制淀粉样蛋白成纤维的工作机制——体内抗氧化活性对淀粉样蛋白形成的抑制作用，为本领域技术人员对茶叶抑制淀粉样蛋白形成的机理研究以及六堡茶的应用提供了新的研究方向。

六堡茶具有显著保护蛋白质的天然结构，其功效与常见的绿茶几乎一致；且具有显著的体内抗氧化以及体内、外抑制淀粉样蛋白形成活性，可以降低快速衰老SAM-prone/8(SAMP8)小鼠的脑组织氧化损伤程度。

六堡茶在制备防治淀粉样蛋白疾病的功能性产品中的应用，其功能性产品多样化，如药品、保健品、食品或饮料等；且六堡茶添加至功能性产品中的形式多样化，如六堡茶直接添加、六堡茶粉碎后或通过热水浸提后的提取物或六堡茶提取后的浓缩物等；该功能性产品的应用领域广泛，且加工工艺简单。

附图说明

图1—为本发明六堡茶在制备防治淀粉样蛋白疾病的功能性产品中的应用中六堡茶抑制体外淀粉样蛋白形成的活性分析图，其中，(a)荧光检测法检测六堡茶抑制淀粉样蛋白的形成；(b)ThT检测β-sheet结构的产生；(c)六堡茶抑制衰老相关淀粉样蛋白生成的半有效浓度(EC50)；

图2—为本发明六堡茶在制备防治淀粉样蛋白疾病的功能性产品中的应用中六堡茶提取物体外抗氧化活性分析图；

图3—为本发明六堡茶在制备防治淀粉样蛋白疾病的功能性产品中的应用中六堡茶处理蛋白质结构的FTIR分析图；

图4—为本发明六堡茶在制备防治淀粉样蛋白疾病的功能性产品中的应用中六堡茶调节早衰型SAMP8高脂模型小鼠代谢后小鼠体重及附睾脂肪组织重量分析图；

图5—为本发明六堡茶在制备防治淀粉样蛋白疾病的功能性产品中的应用中六堡茶调节早衰型SAMP8高脂模型小鼠代谢后小鼠附睾脂肪组织HE染色图；

图6—为本发明六堡茶在制备防治淀粉样蛋白疾病的功能性产品中的应用中六堡茶调节早衰型SAMP8高脂模型小鼠代谢后小鼠氧化应激水平分析图，其中，(a)超氧化物酶活性，(b)过氧化氢酶活性，(c)谷胱甘肽过氧化物酶活性，(d)丙二醛水平；

图7—为绿茶、白茶、红茶和六堡茶调节早衰型SAMP8高脂模型小鼠代谢后小鼠氧化应激水平分析对比图，其中：(a)超氧化物酶活性，(b)过氧化氢酶活性，(c)谷胱甘肽过氧化物酶活性，(d)丙二醛水平；

图8—为本发明六堡茶在制备防治淀粉样蛋白疾病的功能性产品中的应用中六堡茶调节早衰型SAMP8高脂模型小鼠代谢后小鼠脑皮层淀粉样蛋白水平分析图，其中(a)β-amyloid和GAPDH印迹分析灰度扫描图，(b)β-amyloid和GAPDH含量对比图；

图9—为绿茶、白茶、红茶和六堡茶六堡茶调节早衰型SAMP8高脂模型小鼠代谢后小鼠脑皮层淀粉样蛋白水平分析对比图，其中(a)β-amyloid和GAPDH印迹分析灰度扫描图，(b)β-amyloid和GAPDH含量对比图；

图10-本发明六堡茶在制备防治淀粉样蛋白疾病的功能性产品中的应用中六堡茶提取物抑制ApoE高脂建模小鼠动脉粥样硬化油红O染色分析图，其中，(a)ApoE高脂建模小鼠动脉粥样硬化油红O染色图，(b)ApoE高脂建模小鼠动脉粥样硬化油红O染色量化对比图。

具体实施方式

以下结合附图及实施例对本发明作进一步说明。

实施例1

六堡茶在制备防治淀粉样蛋白疾病的功能性产品中的应用，具体应用方法为：六堡茶以六堡茶提取物添加至功能性产品中。

其中，六堡茶提取物采用热水浸提法制备，所述热水浸提法的具体操作为：准确称取茶叶100g投入2L锥形瓶中，注入沸水，茶水比为1:10。将锥形瓶放入100℃水浴锅中浸提45min，过滤，浸提两次，合并茶汤冷却至后放入-20℃预冻，预冻后在-42℃真空条件下进行冷冻干燥得到茶提取物，最后装袋保存于-20℃。

需要说明的是，后续申请人对不同种类茶(绿茶、白茶、红茶)的提取物用于动物实验处理，相应采用上述的热水浸提法处理不同种类的茶，获得相应的茶提取物。

茶叶基本信息：

发明人对本实施例的六堡茶提取物其体外抑制淀粉样蛋白形成的活性及抗氧化能力、理化成分进行了测定分析，同时，采用相同的制备方法，对常见的绿茶、白茶和红茶进行处理，获得相应的绿茶提取物、白茶提取物和红茶提取物，用于早衰性SAMP8高脂建模小鼠的灌胃处理，具体操作和检测结果如下：

1)六堡茶提取物体外抑制淀粉样蛋白形成的活性分析

①10mol/L MDA配制

实验方法：MDA可以通过TMP的酸水解制得，加4.5mL 1mmol/L氯化氢(HCL)至50mL容量瓶中，随后吸取0.0845mL TMP，40℃水浴震荡2.5min，直到溶液均匀澄清。然后加入1mL6mol/L的NaOH，调节溶液的pH至中性。再用0.1mmol/L pH为7.0的PBS定容至50mL，储存于4℃冰箱中备用。

②六堡茶干预BSA/MDA反应体系的制备

实验方法：根据文献(S.Cai,H.Yang,K.Zeng,et al.,EGCG InhibitedLipofuscin Formation Based on Intercepting Amyloidogenicβ-Sheet-RichStructure Conversion,PLoS One,2016,11,e0152064.)体外制备衰老相关的淀粉样蛋白体系，做进一步的优化，方法简述如下：在添加浓度分别0、10、50、100、250、500、1000、2000、4000μg/mL六堡茶提取物的条件下，BSA(1mg/mL)与MDA(2mmol/L)在相应pH7.0的PBS中37℃电热恒温鼓风干燥箱中孵育24h。空白对照组加入等体积相应pH的PBS(磷酸缓冲液)。24h后，对样品进行如下处理：加反应体系总体积1/5的20％三氯乙酸(TCA)于BSA/MDA反应体系中，充分混匀，11000g离心3min，离心后弃去上清液，加入0.5mL PBS和0.1mL的20％TCA，充分混匀，11000g离心3min，以确保将样品中杂质完全除去；最后，将沉淀溶解于0.5mL的PBS中，即得到处理组的蛋白质样品。

③淀粉样蛋白含量的荧光检测

实验方法：将制备的淀粉样蛋白稀释10倍，吸取0.1mL于96孔板中，置于多功能酶标仪上，以其在激发波长395nm，发射波长460nm下的荧光强度来确定衰老相关淀粉样蛋白的特征性结构羰-氨交联结构的含量生成。

将制备的淀粉样蛋白稀释10倍，吸取40μL于96孔板中，随后每孔吸入160μL硫磺素T(ThT)工作液，置于多功能酶标仪上，在激发波长440nm和发射波长485nm下检测蛋白质集聚物的毒性种子结构β-sheet结构的含量。

实验结果：由附图1-(A)可知，六堡茶对淀粉样蛋白形成的抑制作用随六堡茶提取物浓度的增大而加强，尤其当六堡茶提取物的含量大于等于250μg/mL时，淀粉样蛋白的含量相对空白样下降了近70％，即六堡茶提取物对淀粉样蛋白的形成中的羰-氨交联反应过程起显著的抑制作用，进而抑制富含β-sheet结构的淀粉样蛋白形成；当六堡茶提取物的含量大于2000μg/mL时，六堡茶提取物基本能完全抑制淀粉样蛋白的形成中的羰-氨交联反应过程。

由附图1-(B)和(C)可知，六堡茶提取物抑制衰老相关淀粉样蛋白生成的半有效浓度(EC50)为94.83±2.31μg/mL；且当六堡茶提取物的浓度大于等于250μg/mL时，其对淀粉样蛋白的β-sheet结构的形成的抑制作用达到50％以上，且继续增大六堡茶提取物的浓度，其抑制淀粉样蛋白的β-sheet结构形成的作用基本趋于一致。

2)六堡茶提取物体外抗氧化能力的测定

实验方法：ABTS在氧化剂作用下氧化成绿色的ABTS+。准确称取5mg茶提取物溶解于10mL纯水中，稀释一定倍数后，加入ABTS工作液，室温反应6min，在酶标仪406nm波长下检测吸光度。

实验结果：由附图2可知，六堡茶提取物体外的抗氧化能力的平均半有效浓度(EC50)为486±30.4μg/mL。

相对常见的绿茶、白茶和红茶，六堡茶提取物体外抗氧化能力比绿茶、白茶和红茶偏低，但其抑制淀粉样蛋白的活性与绿茶和白茶相当，甚至更优。

3)六堡茶提取物的理化成分分析

实验方法：儿茶素、生物碱含量的HPLC测定方法如下：精确称取0.1g茶提取物于5mL容量瓶中超声溶解，过膜。采用C18色谱柱，流动A：纯水，B：N,N-二甲基甲酰胺:甲醇:冰醋酸＝39.5:2:1.5。波长278nm，柱温30℃，流速1ml/min，梯度洗脱程序如下：9％B(0.01min),14％B(10min),23％B(15min),36％B(27min),36％B(31min),9％B(32min)。

实验结果：不同种类茶的茶提取物理化成分的检测分析结果如表1所示。六堡茶提取物中儿茶素的含量为25.76mg/g，且几乎都为非酯型儿茶素。而绿茶、白茶、红茶均含有酯型儿茶素和非酯型儿茶素，且绿茶和白茶中的酯型儿茶素的含量相对于其非酯型儿茶素含量较高，现有技术中，主要报道了茶叶对淀粉样蛋白形成的抑制作用主要是茶叶富含的儿茶素(尤其是酯型儿茶素)、茶多酚等化合物的作用，而六堡茶提取物中基本不含酯型儿茶素，说明六堡茶提取物和绿茶、白茶等茶叶对淀粉样蛋白形成的抑制机理存在不同，也从某一方面说明了为什么至今没有将六堡茶用于防治淀粉样疾病防治的根本原因。

表1不同种类茶的查提取物理化成分分析

4)六堡茶提取物处理组蛋白质结构的FTIR分析

实验方法：将样品置于冷冻干燥机中，-42℃，24h脱水干燥。取约200mg溴化钾放入玛瑙钵中研碎，加约2mg样品，研匀，溴化钾压片做样；在400～4000cm^-1波数范围扫描，室温条件下采集光谱图，4cm^-1分辨率，64次扫描累加。红外吸收光谱波数(cm^-1)为横坐标，百分透过率为纵坐标，得到红外吸收光谱。

实验结果：参照附图3，与BSA组相比，由于BSA/MDA反应体系制备的衰老相关淀粉样蛋白中存在大量的C＝O键，电子转移增强，其在1800cm^-1至1000cm^-1波段，即蛋白质酰胺I带和蛋白质酰胺II带的红外吸收峰强度明显降低，茶叶处理组的红外扫描光谱与BSA对照组的吸收峰峰形与吸收峰强度基本一致，即，表明六堡茶提取物处理组能够很好的保持蛋白质的天然结构。六堡茶提取物、绿茶、红茶对蛋白质天然结构的保持效果一致。

5)六堡茶提取物抑制早衰性SAMP8高脂建模小鼠脑皮层淀粉样蛋白生成活性分析

动物实验方法：选取SPF级8周龄雄性正常对照组SAM-resistant/1(SAMR1)小鼠10只和快速衰老SAM-prone/8(SAMP8)小鼠40只在清洁级动物房适应性饲养1周，自由摄食和饮水。然后，按照体重随机分为正常对照小鼠SAMR1正常饮食组(R1+正常饮食)、早衰型SAMP8小鼠正常饮食组(P8+正常饮食)、早衰型SAMP8小鼠高脂饮食组(P8+高脂饮食)、早衰型SAMP8小鼠高脂饮食灌胃二甲双胍组(P8+高脂饮食/二甲双胍)、早衰型SAMP8小鼠高脂饮食灌胃六堡茶组(P8+高脂饮食/六堡茶)。除给予R1+正常饮食、P8+正常饮食组普通繁殖饲料外，P8+高脂饮食、P8+高脂饮食/二甲双胍、P8+高脂饮食/六堡茶组均给予60％高脂饲料先高脂建模4周。后续在高脂建模基础上，P8+高脂饮食/二甲双胍组以200mg/kg/d的二甲双胍灌胃，P8+高脂饮食/六堡茶组以200mg/kg/d的六堡茶提取物连续灌胃；R1+正常饮食、P8+正常饮食和P8+高脂饮食组以蒸馏水灌胃。9周后，注射0.01g/mL戊巴比妥钠麻醉小鼠，取其大脑皮层组织于-80℃保存。

绿茶、白茶和红茶不同种类茶叶的处理组的处理方法同六堡茶处理组，仅将不同种类茶叶的茶提取物替代早衰型SAMP8小鼠高脂饮食灌胃六堡茶组中的六堡茶提取物，且茶叶水提取物的用量相同。

①附睾脂肪重量、体脂比分析

对进行不同处理后的小鼠体重和附睾脂肪重量进行统计，对照组(R1+正常饮食组)的小鼠体重相对对照组(P8+正常饮食组)、P8+高脂饮食组以及六堡茶提取物等其他茶叶灌胃组的小鼠体重略高，但差异不明显，其结果如图4所示。

参照图4，与对照组(R1+正常饮食和P8+正常饮食组)相比，P8+高脂饮食组小鼠附睾脂肪重量及体脂比显著升高(p＜0.01)，其中六堡茶提取物灌胃组对小鼠附睾脂肪重量及体脂比的上升有显著抑制作用(p＜0.01)，且优于二甲双胍处理组的抑制效果。

此外，申请人还比较了绿茶、白茶、红茶和六堡茶等4种类型的茶叶提取物对早衰性SAMP8高脂建模小鼠进行处理，方法同六堡茶提取物处理组，试验结果表明：相对常用的绿茶、白茶和红茶，六堡茶提取物对小鼠附睾脂肪重量的抑制作用最大。

②HE染色分析

实验方法：取附睾脂肪组织迅速置于组织固定液中固定，常规石蜡包埋，切片，染色，于20倍显微镜下观察视野中的脂肪细胞形态。

实验结果：由图5可知，附睾脂肪HE染色，与对照组(R1+正常饮食和P8+正常饮食组)相比，P8+高脂饮食组小鼠附睾脂肪细胞直径变大，六堡茶提取物灌胃组小鼠附睾脂肪细胞直径相对P8+高脂饮食组下降，与对照组(R1+正常饮食和P8+正常饮食组)相近，较好地保持了附睾脂肪细胞的形态。

③大脑皮层的超氧化物酶SOD、过氧化氢酶CAT、谷胱甘肽过氧化物酶GSH-Px、丙二醛MDA水平

实验方法：严格按照试剂盒操作说明，准确称取脑皮层组织重量，加入9倍体积的匀浆介质于冰水浴条件下在组织研磨机中机械研磨，离心后取上清液，测定不同处理组大脑皮层的SOD、CAT、GSH-Px、MDA水平，其检测结果如图6所示。

实验结果：由图6可知，与对照组(R1+正常饮食和P8+正常饮食组)相比，P8+高脂饮食组小鼠脑皮层组织的SOD、CAT和GSH-Px的含量下降，MDA显著含量上升。与P8+高脂饮食组小鼠相比，六堡茶灌胃组显著提高了抗氧化应激酶活性，MDA含量显著下降，且六堡茶提取物的效果优于二甲双胍处理组的效果，即，六堡茶体内抗氧化活性相比于二甲双胍更好。

此外，申请人还比较了绿茶、白茶、红茶和六堡茶等4种类型的茶叶提取物对早衰性SAMP8高脂建模小鼠进行处理，方法同六堡茶提取物处理组，不同种类茶叶提取物处理组对大脑皮层的超氧化物酶SOD、过氧化氢酶CAT、谷胱甘肽过氧化物酶GSH-Px、丙二醛MDA水平如图7所示，六堡茶提取物的效果优于绿茶和白茶，即，六堡茶体内抗氧化活性相比于绿茶、白茶更高。

④大脑皮层的蛋白质印迹分析

实验方法：取小鼠大脑皮层组织到含有蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液中，超声裂解，离心(4℃，12000rpm，20min)收集上清液。并使用BCA蛋白质分析试剂盒(Pierce，GrandIsland，NY)测定蛋白质浓度。经8％或10％十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)电泳并转移至PVDF膜后，在含有5％脱脂牛奶的TBS-T封闭溶液中室温下封闭1h，使用一抗稀释液稀释一抗，稀释比例为1:1000，在4℃孵育过夜。使用辣根过氧化物酶缀合的二抗孵育90min，通过Fluor Chem FC2化学发光凝胶成像系统(南京非同中国)检测发光信号，用Image J进行蛋白质条带的灰度扫描。

实验结果：实验结果：Westen-blotting实验结果(如图8所示)表明，与R1+正常饮食和P8+正常饮食组小鼠相比，P8+高脂饮食组小鼠脑皮层内β-amyloid的水平上升；六堡茶灌胃组β-amyloid的水平与R1+正常饮食和P8+正常饮食组相当，相对P8+高脂饮食组，六堡茶灌胃组β-amyloid的水平下降，且优于二甲双胍处理组，即，说明六堡茶灌胃组对P8+高脂饮食组小鼠脑皮层内的淀粉样蛋白(β-amyloid)形成有抑制作用。

此外，申请人还比较了绿茶、白茶、红茶和六堡茶等4种类型的茶叶提取物对早衰型SAMP8高脂建模小鼠进行处理，方法同六堡茶提取物处理组，不同种类茶叶提取物处理组对小鼠大脑皮层内β-amyloid水平的影响如图9所示。

由图9-(a)的凝胶成像图可知，采用红茶提取物和六堡茶提取物处理的P8+高脂饮食组小鼠脑皮层内β-amyloid的水平相对P8+高脂饮食组显著降低，且六堡茶提取物的效果优于绿茶和白茶，即，六堡茶对P8+高脂饮食组小鼠脑皮层内的淀粉样蛋白(β-amyloid)形成的抑制作用相比于绿茶、白茶更强。因此，六堡茶提取物在小鼠体内对淀粉样蛋白的形成起到显著的抑制作用，进而说明六堡茶具备防治淀粉样蛋白疾病的功能。

6)六堡茶提取物抑制ApoE高脂建模小鼠动脉粥样硬化油红O染色分析

实验方法：动物实验严格按照北京大学实验动物福利与动物实验伦理委员会(AW22039102-6)的指导方针批准和实施。选取SPF级7周龄雌性C57BL/6J小鼠10只和ApoE-/-小鼠40只在清洁级动物房适应性饲养1周，自由摄食和饮水。然后，按照体重随机分为正常对照小鼠C57BL/6J正常饮食组(C57+正常饮食)、ApoE-/-小鼠正常饮食组(ApoE+正常饮食)、ApoE-/-小鼠高脂饮食组(ApoE+高脂饮食)、ApoE-/-小鼠高脂饮食灌胃二甲双胍组(ApoE+高脂饮食/二甲双胍)、ApoE-/-小鼠高脂饮食灌胃六堡茶组(ApoE+高脂饮食/六堡茶)。其中，C57BL/6J正常饮食组(C57+正常饮食)、ApoE-/-小鼠正常饮食组(ApoE+正常饮食)喂食基础饲料，其他组均喂食高脂饲料2周，进行高脂建模。后续在高脂建模基础上，ApoE-/-小鼠高脂饮食灌胃二甲双胍组(ApoE+高脂饮食/二甲双胍)以50mg/kg/d二甲双胍灌胃，ApoE-/-小鼠高脂饮食灌胃六堡茶组(ApoE+高脂饮食/六堡茶)以266mg/kg/d六堡茶提取物灌胃。3个月后，注射0.01g/mL戊巴比妥钠麻醉小鼠，取其主动脉进行大体油红染色。

实验结果：小鼠主动脉大体油红O染色可准确测定动脉粥样硬化小鼠主动脉壁斑块面积。与对照组(C57+正常饮食和ApoE+正常饮食组)相比，ApoE+高脂饮食组小鼠主动脉斑块面积有明显增加。与ApoE+高脂饮食组小鼠相比，ApoE+高脂饮食/二甲双胍和ApoE+高脂饮食/六堡茶组小鼠主动脉板斑块面积均减少，且ApoE+高脂饮食/六堡茶组小鼠对动脉粥样硬化的抑制程度显著优于二甲双胍，六堡茶对ApoE+高脂饮食小鼠的主动脉板斑块面积与ApoE+正常饮食组的相当，说明，六堡茶能够有效抑制高脂饮食对小鼠主动脉发生动脉粥样硬化的影响，即，六堡茶能够抑制高脂饮食ApoE小鼠动脉粥样硬化的发生。

综上所述，本发明六堡茶在制备防治淀粉样蛋白疾病的功能性产品中的应用的作用机制为：六堡茶(T4)为后发酵茶，经渥堆后，茶叶中的多酚类物质发生氧化聚合会形成一类高分子聚合物，其儿茶素含量低，体外抗氧化活性低于绿茶、白茶，但六堡茶具有较强的体内抗氧化活性，能有效抑制体内羰-氨交联反应及衰老相关的淀粉样蛋白的形成，进而使β-amyloid的水平显著下降；且六堡茶提取物还能有效抑制ApoE+高脂饮食小鼠的主动脉斑块的形成，进而减小小鼠主动脉发生动脉粥样硬化的可能性，达到对机体内因淀粉样蛋白形成、沉积而引发的疾病的防防及治疗。

基于六堡茶的强体内抗氧化活性而产生对淀粉样蛋白形成的抑制作用，因此，本发明的六堡茶在制备防治淀粉样蛋白疾病的功能性产品中的应用，其功能性产品优选为具有预防或治疗淀粉样蛋白疾病作用且含六堡茶或含六堡茶有效成分的药品或保健食品、或采用六堡茶或其粉末制成的饮料，其中药物可以采用口服剂型，如片剂、颗粒剂、胶囊剂、口服液等，也可以加入食物中食用，进而提高六堡茶在人体内的抗氧化活性，增强其对淀粉样蛋白形成的抑制作用，达到对淀粉样蛋白疾病的防治效果。

需要说明的是：本实施例中的六堡茶提取物采用热水浸提时，其浸提的时间和重复次数可以根据六堡茶的保存年龄、叶片大小等进行适当调整，比如，采用茶水比为1:8进行浸提60min，重复浸提3次，合并浸提滤液，然后再预冻，真空冷冻干燥获得六堡茶提取物；或者，采用茶水比为1:12进行浸提50min，重复浸提2次，合并浸提滤液，然后再预冻，真空冷冻干燥获得六堡茶提取物。

实施例2

六堡茶在制备防治淀粉样蛋白疾病的功能性产品中的应用，具体应用方法为：六堡茶以六堡茶干粉末添加至功能性产品中，功能性产品为含六堡茶干粉末的保健食品。

实施例3

六堡茶在制备防治淀粉样蛋白疾病的功能性产品中的应用，具体应用方法为：六堡茶以六堡茶提取物的浓缩物添加至功能性产品中，功能性产品为添加有六堡茶提取物的浓缩物的饮料。

实施例4

六堡茶在制备防治淀粉样蛋白疾病的功能性产品中的应用，具体应用方法为：六堡茶以六堡茶提取物添加至功能性产品中，并与西药如胆碱酯酶抑制剂(他克林)制成复方制剂。

实施例6

六堡茶在制备防治淀粉样蛋白疾病的功能性产品中的应用，具体应用方法为：六堡茶直接添加至功能性产品中，并与防治淀粉样蛋白疾病的中药如当归药散复方制成复方制剂。

Claims (10)

1.六堡茶在制备防治淀粉样蛋白疾病的功能性产品中的应用。

2.如权利要求1所述六堡茶在制备防治淀粉样蛋白疾病的功能性产品中的应用，其特征在于，所述六堡茶以六堡茶茶叶及其干粉末、六堡茶提取物或其浓缩物添加至功能性产品中。

3.如权利要求2所述六堡茶在制备防治淀粉样蛋白疾病的功能性产品中的应用，其特征在于，所述六堡茶提取物采用热水浸提法制备，所述热水浸提法的具体操作为：取定量的六堡茶茶叶，按茶水比为1:8～1:12(w/w)注入沸水，然后，将茶水煮沸并维持微沸或在100℃水浴锅中保温浸提45～60min，过滤，重复浸提2～3次，合并茶汤；茶汤冷却后预冻，再冷冻干燥得到六堡茶提取物，备用。

4.如权利要求3所述六堡茶在制备防治淀粉样蛋白疾病的功能性产品中的应用，其特征在于，所述六堡茶提取物的用量≥50μg/mL。

5.如权利要求4所述六堡茶在制备防治淀粉样蛋白疾病的功能性产品中的应用，其特征在于，所述六堡茶提取物的用量为250～500μg/mL。

6.如权利要求2或3所述六堡茶在制备防治淀粉样蛋白疾病的功能性产品中的应用，其特征在于，所述六堡茶提取物的体外抗氧化能力的平均半有效浓度EC50值为486±30.4μg/mL。

7.如权利要求1或2所述六堡茶在制备防治淀粉样蛋白疾病的功能性产品中的应用，其特征在于，防治淀粉样蛋白疾病的功能性产品为含六堡茶或含六堡茶有效成分的药品或保健食品、或采用六堡茶或其粉末制成的饮料，且具有预防或治疗淀粉样蛋白疾病作用。

8.如权利要求1或2所述六堡茶在制备防治淀粉样蛋白疾病的功能性产品中的应用，其特征在于所述药品可以采用口服剂型，所述口服剂型包括片剂、颗粒剂、胶囊剂或口服液。

9.如权利要求1或2所述六堡茶在制备防治淀粉样蛋白疾病的功能性产品中的应用，其特征在于，所述六堡茶与防治淀粉样蛋白疾病的西药复方制成复方制剂。

10.如权利要求1或2所述六堡茶在制备防治淀粉样蛋白疾病的功能性产品中的应用，其特征在于，所述六堡茶与防治淀粉样蛋白疾病的中药复方制成复方制剂。

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