CN113801857A - 一种酶活提高的NADH脱氢酶突变体SlNOX及其应用 - Google Patents

一种酶活提高的NADH脱氢酶突变体SlNOX及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN113801857A
CN113801857A CN202111354240.8A CN202111354240A CN113801857A CN 113801857 A CN113801857 A CN 113801857A CN 202111354240 A CN202111354240 A CN 202111354240A CN 113801857 A CN113801857 A CN 113801857A
Authority
CN
China
Prior art keywords
slnox
mutant
seq
glu
nadh dehydrogenase
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202111354240.8A
Other languages
English (en)
Other versions
CN113801857B (zh
Inventor
肖璐
段学武
陈少格
蒋跃明
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
South China Botanical Garden of CAS
Original Assignee
South China Botanical Garden of CAS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by South China Botanical Garden of CAS filed Critical South China Botanical Garden of CAS
Priority to CN202111354240.8A priority Critical patent/CN113801857B/zh
Publication of CN113801857A publication Critical patent/CN113801857A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN113801857B publication Critical patent/CN113801857B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0012—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7)
    • C12N9/0036—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on NADH or NADPH (1.6)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/102—Mutagenizing nucleic acids
    • C12N15/1031—Mutagenizing nucleic acids mutagenesis by gene assembly, e.g. assembly by oligonucleotide extension PCR
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
    • C12P19/28—N-glycosides
    • C12P19/30—Nucleotides
    • C12P19/36—Dinucleotides, e.g. nicotineamide-adenine dinucleotide phosphate
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y106/00—Oxidoreductases acting on NADH or NADPH (1.6)
    • C12Y106/99—Oxidoreductases acting on NADH or NADPH (1.6) with other acceptors (1.6.99)
    • C12Y106/99003—NADH dehydrogenase (1.6.99.3)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2531/00—Reactions of nucleic acids characterised by
    • C12Q2531/10—Reactions of nucleic acids characterised by the purpose being amplify/increase the copy number of target nucleic acid
    • C12Q2531/113—PCR

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本发明公开了一种酶活提高的NADH脱氢酶突变体SlNOX及其应用。NADH脱氢酶的突变体SlNOXR161A，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。本发明提供了一种NADH脱氢酶的突变体SlNOXR161A，所述突变体SlNOXR161A的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。本发明所述突变体SlNOXR161A是对序列如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列进行定点突变，将第161位的Arg突变成Ala，从而提高NADH脱氢酶的活性，使NADH脱氢酶的酶活提高了36%。本发明所得到的NADH脱氢酶突变体SlNOXR161A可以作为一种可以显著提高酶催化活力的突变体材料为NOX的进一步研究提供参考。

Description

一种酶活提高的NADH脱氢酶突变体SlNOX及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种酶活提高的NADH脱氢酶突变体SlNOX及其应用。
背景技术
线粒体呼吸链膜蛋白复合物I（complex I），又称为NADH脱氢酶，是线粒体呼吸链电子传递系统的主要入口，在绝大多数真核生物中是一个很复杂的线粒体电子呼吸链元件，在糖酵解、糖异生、三羧酸循环以及呼吸链中发挥着不可替代的作用。其中间产物通过脱氢，使NAD+还原为NADH，经电子传递氧化磷酸化反应产生大量ATP，该反应作为电子传递链的第一步，对能量代谢起着至关重要的作用。在叶绿体中，NADH脱氢酶通过叶绿体呼吸链参与活性氧代谢，响应氧化胁迫反应。由此可见，NADH脱氢酶在能量代谢和逆境胁迫中均发挥着重要的功能。
发明内容
本发明的第一个目的是提供NADH脱氢酶的突变体SlNOXR161A，其氨基酸序列如SEQID NO.3所示。
本发明的第二个目的是提供编码上述突变体SlNOXR161A的基因。
本发明的第三个目的是提供一种含有编码突变体SlNOXR161A的基因的重组表达质粒。
优选，所述的表达质粒是表达载体pET28a（+）。
本发明的第四个目的是提供一种含有上述重组表达质粒的宿主表达细胞。
优选，所述的宿主表达细胞是大肠杆菌。
本发明的第五个目的是突变体SlNOXR161A在催化NADH获得NAD+中的应用。
本发明的第六个目的是提供一种获得突变体SlNOXR161A的编码基因的方法，其包括以下步骤：
（1）以SlNOX基因为模板，以SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.7所示序列为引物进行PCR，得第一PCR产物，所述的SlNOX基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
（2）以SlNOX基因为模板，以SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示序列为引物进行PCR，得第二PCR产物；
（3）以所述第一PCR产物和第二PCR产物为模板，以SEQ ID NO .4~5所示序列为引物进行PCR，得到含酶切位点的突变体SlNOXR161A的编码基因。
优选，所述的步骤（1）-（3）中的PCR程序为：98℃预变性3 min；98℃变性10s、60℃退火20 s、72℃延伸60 s，35个循环；72℃延伸5 min。
本发明提供了一种NADH脱氢酶的突变体SlNOXR161A，所述突变体SlNOXR161A的氨基酸序列如SEQ ID NO .3所示。本发明所述突变体SlNOXR161A是对序列如SEQ ID NO .2所示的氨基酸序列进行定点突变，将第161位的Arg突变成Ala，从而提高NADH脱氢酶的活性，使NADH脱氢酶的酶活提高了36%。本发明所得到的NADH脱氢酶突变体SlNOXR161A可以作为一种可以显著提高酶催化活力的突变体材料为NOX的进一步研究提供参考。
附图说明
图1是实施例中SlNOX-His及其突变体SlNOXR161A-His纯化蛋白SDS-PAGE；
图2是实施例中分光光度法测定酶活对比图（a和b表示两组酶活测定值有显著性差异，p<0.05）。
具体实施方式
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
本发明的NADH脱氢酶的突变体SlNOXR161A的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。本发明所述的突变体SlNOXR161A是将SlNOX氨基酸序列中第161位的Arg突变成Ala；所述SlNOX的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明突变的方法并没有具体限定，优选为点突变。本发明所述SlNOX来源于番茄，基因序列如SEQ ID NO.1所示，共690个碱基序列，基因编码的蛋白中含有229个氨基酸（如SEQ ID NO.2所示，蛋白大小为26.29kDa），在番茄基因组中对应的基因号是Solyc01g109620.3。
下面详述本发明构建NADH脱氢酶的突变体SlNOXR161A的方法和活性试验。
实施例1
NADH脱氢酶的突变体SlNOXR161A的基因的构建是通过PCR方式获得，所述PCR用引物包括含酶切位点的引物对和含突变位点的引物对；所述的含酶切位点的引物对的序列如SEQ ID NO .4～5所示（酶切位点加粗且通过下横线标出）；所述含突变位点的引物对的序列如SEQ ID NO.6～所示（突变位点加粗）。
1、样品：所选用的番茄品种是为AC（Solanum lycopersicum. Mill. cv. Ailsa-Craig）。
2、SlNOX基因的克隆
通过常规的热硼酸法对番茄果实中总RNA进行提取，将提取的总RNA按照试剂盒PrimeScriptTM RT Master Mix（Perfect Real Time，RR036A，TaKara）提供的方法将RNA反转录成cDNA，反应体系：X μL RNA(<500ng)、2 μL 5×Mix、Y μL RNase Free water混匀，使总体积为10 μL，然后放在37℃恒温水浴锅中水浴15 min，85℃金属浴热激5 s，4℃冷却即可。
根据番茄基因组(https://solgenomics.net/tools/blast)中SlNOX基因序列设计含nde I酶切位点的引物以及突变位点的引物，引物序列如表1所示；
表1克隆SlNOX R161A 基因所需引物
Figure 163002DEST_PATH_IMAGE001
以番茄cDNA为模板，先分别用含酶切位点的上游引物（SEQ ID NO.4）与含突变位点的下游引物（SEQ ID NO.7）进行PCR得到产物1，然后用含突变位点的上游引物（SEQ IDNO.6）与含酶切位点的下游引物（SEQ ID NO.5）进行PCR得到产物2，然后以产物1和产物2为模板，以含酶切位点的上、下游引物进行PCR得到含酶切位点的突变体SlNOX R161A 产物。
以番茄cDNA为模板，用含酶切位点的上游引物（SEQ ID NO.4）和下游引物（（SEQID NO.5）进行PCR扩增获得SlNOX基因的扩增产物。
PCR条件为：98℃预变性3 min，然后进行35个循环(98℃变性10s、60℃退火20s、72℃延伸60s)，72℃延伸5 min。PCR反应结束后，用1％琼脂糖凝胶电泳检测。
3、SlNOX表达菌株的构建
分别将SlNOX R161A 的PCR产物和SlNOX基因的扩增产物回收，与pET28a（+）载体连接构建重组表达质粒，连接选用的反应体系为In-fusion反应体系（TaKara）：Purified RCRfragment，100 ng；Linearized vector：200 ng；5×In-Fusion HD Enzyme Premix，2μL，根据上述体积加Deionized water至10 μL。对应的负对照：Linearized vector：1μL；5×In-Fusion HD Enzyme Premix，2μl；Deionized water，7μL。pUC19阳性对照：Purified RCRfragment，2μL of 2kb control insert；Linearized vector：1μL of pUC19controlvector；5×InFusion HD Enzyme Premix，2μL；Deionized water：5μL。本发明所述连接的程序：将以上反应体系轻轻混匀后放置于50℃孵育15 min，然后置于冰上，即得连接产物，可进行下一步转化或将连接产物储存于-20℃备用。连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，在700 μL LB培养基中培养1h (37℃，200 rpm)，取400 μL菌液涂布于含0.05 mg/mL卡那霉素的固体LB平板，37℃过夜培养，挑取阳性菌落PCR鉴定，并将阳性菌液送广州擎科测序公司进行测序，将测序正确的质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞，通过PCR鉴定阳性菌液按1:1加入50％灭菌甘油低温（-80℃）保存，分别得到SlNOX和SlNOXR161A表达菌株。
4、SlNOX-His和SlNOXR161A-His的原核表达和纯化
（1）原核表达
分别将SlNOX和SlNOXR161A表达菌株进行扩大培养（37℃，200 rpm），当菌液浓度达到OD600为0.4-0.6时，将菌液降温至15℃后加入终浓度为1 mM的蛋白诱导剂IPTG进行低温诱导(15℃，100 rpm)，培养18-20 h后收集菌体。
（2）蛋白纯化
先加入无菌水将菌体悬浮，4℃ 6 000g离心10 min除去培养基，然后加入适量体积的蛋白提取液（20 mM Tris-HCl，500 mM NaCl，pH 7.5）将菌体悬浮，根据菌液体积按1：1000加入Triton-100以提高蛋白的提取效率。充分悬浮菌体后，利用低温超高压连续流细胞破碎机将菌体破碎1 h（超声30 s，停30 s），超声期间要将盛有菌液的容器要保持充分冰浴，以免超声过程中探头发热导致蛋白活性降低。超声破碎完毕后加入终浓度为1 mM的PMSF抑制蛋白降解。4℃ 9 000g离心30 min，将上清液过膜（0.45 μm），然后将已用蛋白提取液平衡好的Ni NTASuperflow Cartridges（QIAGEN）加入到蛋白溶液中，最后加入终浓度为10 mM的咪唑，于4℃低温使蛋白与填料旋转结合2 h以上。
先将静置后的蛋白上清液流过镍柱，最后将填料也一并转移到镍柱中，当上清液全部流过镍柱后，加入40 mM咪唑（含20 mM Tris-HCl，500 mM NaCl，pH 7.5）洗杂蛋白，直至流下的溶液用考马斯亮蓝G250（碧云天）检测无蛋白为止。然后用250 mM咪唑（含20 mMTris-HCl，500 mM NaCl，pH 7.5）洗脱目标蛋白。由于咪唑对蛋白活性有影响，因此要及时将收集的目标蛋白液用50 mM pH7的磷酸钾缓冲液通过Sephadex G-25脱盐柱（GE）)离心（4℃，4 000 g）将蛋白中咪唑置换掉。最后将纯化后的目标蛋白保存在-80℃超低温冰箱，留取部分纯化好的蛋白与未纯化的蛋白进行跑胶检测，由此得到SlNOX-His及其突变体SlNOXR161A -His蛋白。SlNOX-His及其突变体SlNOXR161A-His蛋白的SDS-PAGE如附图1所示。
5.采用分光光度法对蛋白活性进行检测。选用苏州科铭生物技术有限公司的试剂盒测定SlNOX-His及其突变体SlNOXR161A-His的活性，具体的操作步骤见NADH氧化酶（NADHoxidase，NOX）试剂盒说明书（NOX-2-Y）。单位的定义：每mg蛋白在每mL反应体系中每分钟A600变化0.01定义为一个酶活力单位。蛋白活性的计算公式如下：
NOX（U/mg prot）=ΔA×V反总÷（V样×Cpr）÷0.01÷T=2500×ΔA÷Cpr
结果如图2所示，从图2可以看出突变体SlNOXR161A的活性显著高于SlNOX，使NADH脱氢酶的酶活提高了36%。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 中国科学院华南植物园
<120> 一种酶活提高的NADH脱氢酶突变体SlNOX及其应用
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 690
<212> DNA
<213> 番茄(Solanum lycopersicum)
<400> 1
atggccgcta tattagctcg caagtctcta tctgctcttc gttctcgtca gcttgtttta 60
gcaggacaag catggcaagg gactaataca cctaatggaa ctctgcttgg tactcgatca 120
tttgctacca aacattcatt ttcaactgac aaagatgatg aggaaagaga gcagctagca 180
aaggagctat caaaagattg gaattcagtc tttgagcgaa gcataaatac tctctttttg 240
actgaaatgg ttcgaggtct gatgctgacg ctcaagtact tctttgaaaa gaaagtgact 300
attaactatc catttgaaaa gggtccttta agccctcgtt ttcgtggaga acatgccctt 360
cgacgttatg ccacaggaga ggaaagatgc attgcatgta aactttgtga agctatttgc 420
cctgctcaag ctatcacaat cgaggctgag gagcgagaag atggcagtcg tcgaacaact 480
aggtatgata tcgatatgac aaagtgcatc tactgtggat tctgccaaga agcctgccct 540
gttgatgcca ttgttgaggg gcccaacttt gagtttgcaa ctgaaactca tgaggaactt 600
ctttatgaca aggagaagct tcttgagaat ggagatagat gggaaactga gattgcagag 660
aatctgagat ctgaaagcct ctatcgctga 690
<210> 2
<211> 229
<212> PRT
<213> 番茄(Solanum lycopersicum)
<400> 2
Met Ala Ala Ile Leu Ala Arg Lys Ser Leu Ser Ala Leu Arg Ser Arg
1 5 10 15
Gln Leu Val Leu Ala Gly Gln Ala Trp Gln Gly Thr Asn Thr Pro Asn
20 25 30
Gly Thr Leu Leu Gly Thr Arg Ser Phe Ala Thr Lys His Ser Phe Ser
35 40 45
Thr Asp Lys Asp Asp Glu Glu Arg Glu Gln Leu Ala Lys Glu Leu Ser
50 55 60
Lys Asp Trp Asn Ser Val Phe Glu Arg Ser Ile Asn Thr Leu Phe Leu
65 70 75 80
Thr Glu Met Val Arg Gly Leu Met Leu Thr Leu Lys Tyr Phe Phe Glu
85 90 95
Lys Lys Val Thr Ile Asn Tyr Pro Phe Glu Lys Gly Pro Leu Ser Pro
100 105 110
Arg Phe Arg Gly Glu His Ala Leu Arg Arg Tyr Ala Thr Gly Glu Glu
115 120 125
Arg Cys Ile Ala Cys Lys Leu Cys Glu Ala Ile Cys Pro Ala Gln Ala
130 135 140
Ile Thr Ile Glu Ala Glu Glu Arg Glu Asp Gly Ser Arg Arg Thr Thr
145 150 155 160
Arg Tyr Asp Ile Asp Met Thr Lys Cys Ile Tyr Cys Gly Phe Cys Gln
165 170 175
Glu Ala Cys Pro Val Asp Ala Ile Val Glu Gly Pro Asn Phe Glu Phe
180 185 190
Ala Thr Glu Thr His Glu Glu Leu Leu Tyr Asp Lys Glu Lys Leu Leu
195 200 205
Glu Asn Gly Asp Arg Trp Glu Thr Glu Ile Ala Glu Asn Leu Arg Ser
210 215 220
Glu Ser Leu Tyr Arg
225
<210> 3
<211> 229
<212> PRT
<213> 番茄(Solanum lycopersicum)
<400> 3
Met Ala Ala Ile Leu Ala Arg Lys Ser Leu Ser Ala Leu Arg Ser Arg
1 5 10 15
Gln Leu Val Leu Ala Gly Gln Ala Trp Gln Gly Thr Asn Thr Pro Asn
20 25 30
Gly Thr Leu Leu Gly Thr Arg Ser Phe Ala Thr Lys His Ser Phe Ser
35 40 45
Thr Asp Lys Asp Asp Glu Glu Arg Glu Gln Leu Ala Lys Glu Leu Ser
50 55 60
Lys Asp Trp Asn Ser Val Phe Glu Arg Ser Ile Asn Thr Leu Phe Leu
65 70 75 80
Thr Glu Met Val Arg Gly Leu Met Leu Thr Leu Lys Tyr Phe Phe Glu
85 90 95
Lys Lys Val Thr Ile Asn Tyr Pro Phe Glu Lys Gly Pro Leu Ser Pro
100 105 110
Arg Phe Arg Gly Glu His Ala Leu Arg Arg Tyr Ala Thr Gly Glu Glu
115 120 125
Arg Cys Ile Ala Cys Lys Leu Cys Glu Ala Ile Cys Pro Ala Gln Ala
130 135 140
Ile Thr Ile Glu Ala Glu Glu Arg Glu Asp Gly Ser Arg Arg Thr Thr
145 150 155 160
Ala Tyr Asp Ile Asp Met Thr Lys Cys Ile Tyr Cys Gly Phe Cys Gln
165 170 175
Glu Ala Cys Pro Val Asp Ala Ile Val Glu Gly Pro Asn Phe Glu Phe
180 185 190
Ala Thr Glu Thr His Glu Glu Leu Leu Tyr Asp Lys Glu Lys Leu Leu
195 200 205
Glu Asn Gly Asp Arg Trp Glu Thr Glu Ile Ala Glu Asn Leu Arg Ser
210 215 220
Glu Ser Leu Tyr Arg
225
<210> 4
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ccgcgcggca gccatatggc cgctatatta gctcgcaagt 40
<210> 5
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
agtcatgcta gccatatgtc agcgatagag gctttcagat ctc 43
<210> 6
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gctgaacaac tgcgtatgat atcgatatga c 31
<210> 7
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gtcatatcga tatcatacgc agttgttcga c 31

Claims (9)

1.NADH脱氢酶的突变体SlNOXR161A，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
2.一种编码权利要求1所述的突变体SlNOXR161A的基因。
3.一种含有权利要求2所述的编码突变体SlNOXR161A的基因的重组表达质粒。
4.根据权利要求3所述的重组表达质粒，其特征在于，所述的表达质粒是表达载体pET28a（+）。
5.一种含有权利要求3或4所述的重组表达质粒的宿主表达细胞。
6.根据权利要求5所述的宿主表达细胞，其特征在于，所述的宿主表达细胞是大肠杆菌。
7.权利要求1所述的突变体SlNOXR161A在催化NADH获得NAD+中的应用。
8.一种获得权利要求2所述的突变体SlNOXR161A的编码基因的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）以SlNOX基因为模板，以SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.7所示序列为引物进行PCR，得第一PCR产物，所述的SlNOX基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
（2）以SlNOX基因为模板，以SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示序列为引物进行PCR，得第二PCR产物；
（3）以所述第一PCR产物和第二PCR产物为模板，以SEQ ID NO .4~5所示序列为引物进行PCR，得到含酶切位点的突变体SlNOXR161A的编码基因。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述的步骤（1）-（3）中的PCR程序为：98℃预变性3 min；98℃变性10s、60℃退火20 s、72℃延伸60 s，35个循环；72℃延伸5 min。
CN202111354240.8A 2021-11-16 2021-11-16 一种酶活提高的NADH脱氢酶突变体SlNOX及其应用 Active CN113801857B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202111354240.8A CN113801857B (zh) 2021-11-16 2021-11-16 一种酶活提高的NADH脱氢酶突变体SlNOX及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202111354240.8A CN113801857B (zh) 2021-11-16 2021-11-16 一种酶活提高的NADH脱氢酶突变体SlNOX及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN113801857A true CN113801857A (zh) 2021-12-17
CN113801857B CN113801857B (zh) 2022-02-15

Family

ID=78898696

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202111354240.8A Active CN113801857B (zh) 2021-11-16 2021-11-16 一种酶活提高的NADH脱氢酶突变体SlNOX及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN113801857B (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116179589A (zh) * 2022-12-09 2023-05-30 中国科学院华南植物园 SlPRMT5基因及其蛋白在调控番茄果实产量中的应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2352752A1 (en) * 2008-10-16 2011-08-10 Gencia Corporation Transducible polypeptides for modifying mitochondrial metabolism
CN102469770A (zh) * 2009-06-29 2012-05-23 拜尔生物科学公司 通过选择表观遗传学修饰种群改进作物产量
CN107815443A (zh) * 2016-09-14 2018-03-20 清华大学 一种呼吸链超级复合物蛋白

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2352752A1 (en) * 2008-10-16 2011-08-10 Gencia Corporation Transducible polypeptides for modifying mitochondrial metabolism
CN102469770A (zh) * 2009-06-29 2012-05-23 拜尔生物科学公司 通过选择表观遗传学修饰种群改进作物产量
CN107815443A (zh) * 2016-09-14 2018-03-20 清华大学 一种呼吸链超级复合物蛋白

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HYUNG-SEOP YOUN 等: "Structural Insights into the Quaternary Catalytic Mechanism of Hexameric Human Quinolinate Phosphoribosyltransferase, a Key Enzyme in de novo NAD Biosynthesis", 《SCIENTIFIC REPORTS》 *
K. SCHMIDT-BLEEK 等: "The 28.5-kDa iron-sulfur protein of mitochondrial complex I is encoded in the nucleus in plants", 《MOL GEN GENET》 *
SCHMIDT-BLEEK K 等: "Genbank：NP_001275342.1,"NADH dehydrogenase [ubiquinone] iron-sulfur protein 8, mitochondrial-like [Solanum tuberosum]"", 《GENBANK》 *
SHAI NASHILEVITZ 等: "An Orange Ripening Mutant Links Plastid NAD(P)H Dehydrogenase Complex Activity to Central and Specialized Metabolism during Tomato Fruit Maturation[C][W]", 《PLANT CELL.》 *
童建华 等: "茄科作物青枯菌NADH脱氢酶F亚基在细胞运动和致病性中的功能研究", 《微生物学报》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116179589A (zh) * 2022-12-09 2023-05-30 中国科学院华南植物园 SlPRMT5基因及其蛋白在调控番茄果实产量中的应用
CN116179589B (zh) * 2022-12-09 2023-10-10 中国科学院华南植物园 SlPRMT5基因及其蛋白在调控番茄果实产量中的应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN113801857B (zh) 2022-02-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN107012130B (zh) 一种葡萄糖氧化酶突变体及其编码基因和应用
CN108913671B (zh) 一种ω-转氨酶突变体及其应用
WO2006017960A1 (fr) Enzyme de détoxification ayant une activité consistant à transformer l&#39;aflatoxine et gène codant pour celle-ci
WO2020029564A1 (zh) 雷公藤三萜合酶TwOSC1及其编码基因与应用
CN104774813B (zh) 一种亮氨酸脱氢酶及其制备方法和应用
CN113862233B (zh) 提高葡萄糖氧化酶的酸稳定性的方法及突变体q241e/r499e、基因和应用
CN113801857B (zh) 一种酶活提高的NADH脱氢酶突变体SlNOX及其应用
WO2023236638A1 (zh) 热稳定性改善的葡萄糖氧化酶GoxM10突变体E361P及其衍生突变体和应用
CN113403290B (zh) 热稳定性提高的葡萄糖氧化酶突变体及其编码基因和应用
CN113151330B (zh) 一种酸性蛋白酶突变体及其制备方法和应用
WO2024008205A1 (zh) MmBBK2在制备胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶抑制剂中的应用
WO2024008204A1 (zh) MmPI在制备胰蛋白酶抑制剂中的应用
WO2023227137A1 (zh) TaPDIL4-1B基因在植物抗赤霉病中的应用及其转基因植株的构建方法
CN110592084B (zh) 一种rhtA基因启动子改造的重组菌株及其构建方法与应用
CN117467676A (zh) 一种利用平菇MADS-box基因提高酿酒酵母多重胁迫抗性的应用
CN116970067A (zh) 一种提高人血清白蛋白重组表达水平的策略
CN106995809B (zh) 一种低温木聚糖酶Xyn27及其基因和应用
CN113151240B (zh) 一种葡萄糖异构酶、突变体及其编码基因与应用
CN114317474B (zh) 一种酶活提高的谷胱甘肽s-转移酶突变体及其应用
CN111808836B (zh) 耐热的i型普鲁兰酶的突变体酶及其制备方法与应用
CN113667652A (zh) 一种提高sod3可溶性表达及酶活性的方法
CN108690837B (zh) 一种提高多聚体蛋白热稳定性的方法及热稳定性提高的醇脱氢酶
JPH10191984A (ja) 活性型ヒトａｌｔの製造法
CN105985977B (zh) 异戊二烯合成酶基因及其应用
CN108893437B (zh) 一种表达红曲霉菌Mn-SOD的大肠杆菌工程菌株的构建及表达方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant