CN113788889A - 突变的della蛋白及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种相对于亲本DELLA蛋白具有氨基酸突变的DELLA突变蛋白，所述亲本DELLA蛋白来源于玉米，所述DELLA突变蛋白相对于亲本DELLA蛋白在对应于SEQ ID No.1所示序列的若干个氨基酸存在突变。所述DELLA突变蛋白可以导致玉米的株高降低，在玉米矮化育种中具有重要的应用价值。

Description

突变的DELLA蛋白及其应用

技术领域

本发明属于生物技术、作物遗传育种领域，涉及突变的DELLA蛋白及其应用，尤其玉米中突变的DELLA蛋白以及在降低玉米株高中的应用。

背景技术

玉米是全世界种植面积最大的作物，其全球年种植面积在20亿亩以上，总产量已达10亿吨，其食用价值、工业价值、饲用价值使之在我国粮食安全保障体系中占据了重要地位。目前玉米产量的提高得益于种植密度的增大，高密度条件下植物产生避荫反应，株高增加就是其中之一。玉米株高过高容易引发玉米的倒伏，给机械化收割造成一定困难，进而导致产量难以提升甚至降低。因此通过适度的降低株高，进而降低避荫反应，增加玉米的抗倒性是目前玉米育种的重要方向之一。

自从植物激素赤霉素(GAs)被发现能够在植物生长与发育的各个阶段发挥作用后，探索理解其潜在的分子机制成为研究人员的主要探究方向。DELLA蛋白在赤霉素信号转导通路中居于关键的一环，也因而被深入研究。DELLA蛋白由N端DELLA调控结构域与C端GRAS(GAI、RGA、SCARECROW)功能结构域构成。GRAS结构域转录因子家族在拟南芥、水稻以及苔藓中高度保守。C末端的GRAS结构域包含一段核定位序列(NLS)、PFYRE与SAW基序、VHIID氨基酸基序以及位于其两侧的两个亮氨酸七肽重复基序(LHR1、LHR2)。N末端DELLA结构域包含DELLA基序、LExLE基序、VHYNP(也称为TVHYNP)基序以及多聚S/T/V基序，多聚S/T/V基序中含有L(K/R)XI基序，该基序可能可以结合未确定的其他GA信号成分。在玉米中，DELLA蛋白由D8(Dwarf8)基因编码。

本发明的目的在于利用CRISPR/Cas基因编辑技术对玉米DELLA蛋白包含DELLA基序和VHYNP基序的氨基(N)末端进行编辑，使之发生部分氨基酸的删除或突变，期望获得蛋白稳定性增强的DELLA突变蛋白，产生的DELLA突变蛋白可能与GA-GID1蛋白复合体识别结合的能力降低，阻遏了生长相关基因的转录表达，从而使得玉米的生长受到抑制，最终达到降低玉米株高的目的。

发明内容

本发明提供了一种突变的DELLA蛋白以及该突变蛋白在降低玉米株高中的应用。

一方面，本发明提供了一种相对于亲本DELLA蛋白具有氨基酸突变的DELLA突变蛋白，所述亲本DELLA蛋白来源于玉米，其特征在于，所述DELLA突变蛋白相对于亲本DELLA蛋白在对应于SEQ ID No.1所示序列的若干个氨基酸存在突变。

在一个实施方式中，所述DELLA突变蛋白选自如下任意一种或任意几种组合：

(1)缺失对应于SEQ ID No.1所示序列的第1-80位氨基酸；

(2)缺失对应于SEQ ID No.1所示序列的第1-40位氨基酸；

(3)对应于SEQ ID No.1所示序列的第80-84位氨基酸序列替换为ERVRV，并且缺失对应于SEQ ID No.1所示序列的第85位-105位氨基酸；

(4)缺失对应于SEQ ID No.1所示序列的第66-72位氨基酸；

(5)缺失对应于SEQ ID No.1所示序列的第1-4位和第17位氨基酸；

(6)缺失对应于SEQ ID No.1所示序列的第11-18位氨基酸；

(7)对应于SEQ ID No.1所示序列的第42位和43位氨基酸分别突变为E和M，并且，缺失对应于SEQ ID No.1所示序列的第44-60位氨基酸。

所述亲本DELLA蛋白包含DELLA基序和/或VHYNP基序。

在一个实施方式中，所述亲本DELLA蛋白来源于天然存在的玉米株系(例如，天然存在的玉米自交系)，并且所述亲本DELLA蛋白的N端第1-105位氨基酸序列与SEQ ID No.1所示的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％的序列同一性。

在一个实施方式中，所述亲本DELLA蛋白为来源于玉米自交系的DELLA蛋白。在一个实施方式中，所述玉米包括玉米自交系B73、郑58(Z58)、齐319(Q319)、XCW175、PH4CV、PH6WC、昌7-2等中的一种或任意几种。

在一个实施方式中，所述亲本DELLA蛋白的N端第1-105位氨基酸序列如SEQ IDNo.1所示。

在一个实施方式中，所述DELLA突变蛋白与亲本DELLA蛋白相比，具有以下任意一种或任意几种突变：

(1)缺失SEQ ID No.1所示序列的第1-80位氨基酸；

(2)缺失SEQ ID No.1所示序列的第1-40位氨基酸；

(3)SEQ ID No.1所示序列的第80-84位氨基酸序列替换为ERVRV，并且缺失SEQ IDNo.1所示序列的第85位-105位氨基酸；

(4)缺失SEQ ID No.1所示序列的第66-72位氨基酸；

(5)缺失SEQ ID No.1所示序列的第1-4位和第17位氨基酸；

(6)缺失SEQ ID No.1所示序列的第11-18位氨基酸；

(7)SEQ ID No.1所示序列的第42位和43位氨基酸分别突变为E和M，并且，缺失SEQID No.1所示序列的第44-60位氨基酸。

本发明另一方面，提供了一种融合蛋白，包含上述的突变蛋白或其生物活性片段；进一步的，所述融合蛋白还包括与所述的突变蛋白融合的蛋白，例如，标签肽、质体引导肽或调控元件。其中，标签肽如，组氨酸标签，6×His；质体引导肽，例如引导到叶绿体内的肽；调控元件，例如启动子序列、终止子序列、前导序列、多聚腺苷酸化序列、标记基因等。

另一方面，本发明提供了一种多核苷酸，编码所述DELLA突变蛋白或融合蛋白。

在另一优选例中，所述的多核苷酸选自下组：基因组序列、cDNA序列、RNA序列、或其组合。

在另一优选例中，所述的多核苷酸优选是单链的或双链的。

在另一优选例中，所述的多核苷酸在所述突变多肽的ORF的侧翼还额外含有选自下组的辅助元件：信号肽、分泌肽、标签序列(如6His)、核定位信号或其组合。

在另一优选例中，该多核苷酸还包含与所述突变多肽的ORF序列操作性连接的启动子。

在另一优选例中，所述的启动子选自下组：组成型启动子、组织特异性启动子、诱导型启动子、或者强启动子。

本发明另一方面，提供一种核酸构建体，含有所述的多核苷酸以及与之可操作连接的调控元件。

在另一优选例中所述的调控元件选自下组中的一种或多种：增强子、转座子、启动子、终止子、前导序列、多腺苷酸序列、标记基因。

另一方面，本发明还提供了一种载体，所述载体包含有编码本发明的DELLA突变蛋白的核酸序列，优选的，所述载体还包括与上述核酸序列可操作连接的表达调控元件。

在另一优选例中，所述的载体包括克隆载体、表达载体、穿梭载体或整合载体。

在一个实施方式中，载体可以是对宿主细胞内源性的DELLA蛋白编码基因进行基因编辑的载体。

在一个实施方式中，所述表达载体中还至少含有一个复制起点，以实现自我复制。

在一个实施方式中，所述载体可以是当引入宿主细胞时被整合入基因组中并与其所整合入的染色体一起复制的载体。

载体可以是质粒、病毒、粘粒、噬菌体等类型，它们是本领域技术人员所熟知的。

优选地，本发明中的载体是质粒。

另一方面，本发明提供了一种编辑载体系统，所述编辑载体系统包含一种或多种载体，所述一种或多种载体至少包含靶向亲本DELLA蛋白编码基因的引导序列。所述引导序列含有部分亲本型DELLA蛋白编码基因的核苷酸序列，优选的至少含有15bp的DELLA蛋白编码基因的核苷酸序列，更优选的至少包括20bp的DELLA蛋白编码基因的核苷酸序列。在一种实施方式中，该编辑载体系统还包括基因编辑酶。所述基因编辑酶包括CRISPR(规律成簇间隔短回文重复序列Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)、TALEN(转录激活因子样效应物核酸酶技术Tanscription Activator-like(TAL)effectornucleases)、ZFN(锌指核酸技术，Zinc finger nuclease)编辑工具的核酸酶。

优选地，所述基因编辑酶为Cas蛋白，又名CRISPR酶或Cas效应蛋白，其种类包括但并不限于：Cas9蛋白、Cas12蛋白、Cas13蛋白、Cas14蛋白、Csm1蛋白、FDK1蛋白。

优选的，Cas蛋白可操作的连接第一调节元件。

在一个实施方式中，所述基因编辑酶为Cas9蛋白，所述载体中还包括与该Cas9蛋白可以特异性结合的Scaffold序列。Scaffold序列与引导序列可操作连接后，构成引导指导序列(gRNA)。优选的，gRNA可操作的连接第二调节元件。

在其他的实施方式中，所述基因编辑酶为Cas12蛋白，例如，Cas12a、Cas12b、Cas12i，所述载体中还包括与该所述Cas12蛋白特异性结合的单向重复序列(DirectRepeat)。单向重复序列与引导序列可操作连接后，构成引导指导序列(gRNA)。优选的，gRNA可操作的连接第二调节元件。

上述调节元件包括启动子、终止子序列、前导序列、多聚腺苷酸化序列、信号肽编码区、标记基因、增强子、内部核糖体进入位点(IRES)、和其他表达控制元件(例如转录终止信号，如多聚腺苷酸化信号和多聚U序列)。

优选的，所述编辑载体系统还包括碱基编辑元件，所述碱基编辑元件选自腺嘌呤脱氨酶和/或胞嘧啶脱氨酶。

在一种实施方式中，编辑载体中还包含抗性基因以便于筛选，所述抗性基因包括hyg、bar、kana、rif、spec、amp，所述抗性基因是本领域技术人员所熟知的。

优选的，Cas蛋白选用nCas9或其他有nick活性的Cas9蛋白。其中“n”表示nick，即只具有单链切割活性的Cas蛋白。

另一方面，本发明提供了一种基因编辑试剂，所述基因编辑试剂能够在植物中产生上述突变多肽；所述基因编辑试剂包括CRISPR/Cas蛋白和gRNA，所述gRNA可以靶向植物内源性的DELLA蛋白编码基因；任选的，所述基因编辑试剂还包括碱基编辑元件，所述碱基编辑元件选自腺嘌呤脱氨酶和/或胞嘧啶脱氨酶。

在另一个实施方式中，所述基因编辑试剂包括上述编辑载体系统。

本发明另一方面，提供一种宿主细胞，所述的宿主细胞含有所述DELLA突变蛋白、所述编码基因、所述融合蛋白、核酸构建体、载体中的一种或多种；或者，所述的宿主细胞基因组中整合有所述的多核苷酸。

在另一优选例中，所述的宿主细胞为真核细胞，如酵母细胞或动物细胞或植物细胞。

在另一优选例中，所述的宿主细胞为原核细胞，如大肠杆菌。

在另一优选例中，所述植物包括被子植物和裸子植物。

在另一优选例中，所述植物包括单子叶植物和双子叶植物。

在另一优选例中，所述植物包括草本植物和木本植物。

在另一优选例中，所述植物包括拟南芥、烟草、水稻、玉米、高粱、大麦、小麦、小米、大豆、番茄、马铃薯、藜麦、生菜、油菜、白菜、草莓。

另一方面，本发明提供了一种降低植物的株高的方法，或者，制备株高降低的植物的方法，所述方法包括在植物细胞、植物种子、植物组织、植物部分或植物中引入上述DELLA突变蛋白的步骤，所述植物为玉米。

在一个实施方式中，所述引入DELLA突变蛋白包括将DELLA突变蛋白在植物细胞、植物组织、植物部分或植物中进行表达的步骤，例如，通过表达载体对所述突变蛋白进行表达的，或者将所述编码突变蛋白的多核苷酸整合到植物基因组上进行表达。

在另一优选例中，所述引入DELLA突变蛋白包括将植物的内源性DELLA蛋白编码基因(例如，玉米中的D8基因)进行突变从而引入所述突变蛋白的步骤。

在另一优选例中，所述引入DELLA突变蛋白包括将植物的内源性DELLA蛋白编码基因(例如，玉米中的D8基因)进行突变并表达从而引入所述突变蛋白的步骤。

在另一优选例中，所述的方法中，引入突变的方法包括自然变异、物理诱变(如紫外线诱变、X射线或Y射线诱变)、化学诱变(如亚硝酸、羟胺、EMS、亚硝基胍等)、生物诱变(如病毒或细菌介导的诱变)、基因编辑。

在另一优选例中，所述的方法包括将以下步骤：

(1)在植物细胞、植物组织、植物部分中引入含有基因编辑工具的表达载体；

(2)使基因编辑工具作用于其内源性DELLA蛋白编码基因(例如，玉米中的D8基因)，并使其在相应于SEQ ID No.1的上述突变位点发生突变；

(3)筛选突变的植物细胞、植物组织、植物部分；

(4)分离所述的基因编辑工具。

在另一优选例中，所述的基因编辑工具包括CRISPR、TALEN和ZFN。

另一方面，本发明还提供了上述DELLA突变蛋白、核酸、载体、核酸构建体，基因编辑试剂或宿主细胞在制备株高降低的植物中的用途，所述植物为玉米；或者，在制备降低植物的株高的试剂或试剂盒中的用途。

本发明还提供了一种株高降低的玉米植株，所述玉米植株中含有上述DELLA突变蛋白、核酸、载体、基因编辑试剂或宿主细胞。

所述降低植物的株高，或者株高降低，是指，含有述DELLA突变蛋白、核酸、核酸构建体、载体、基因编辑试剂或宿主细胞的玉米植株的株高要低于含有亲本DELLA蛋白的玉米植株的株高。

所述株高是指从地面至玉米最高处的高度。

在一个实施方式中，含有本发明的DELLA突变蛋白的玉米植株与野生型相比，株高降低约10％-90％，例如，15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％。

本发明还提供了一种降低植物的株高的方法，或者，制备株高降低的植物的方法，所述方法包括利用上述基因编辑试剂对植物的内源性的DELLA蛋白编码基因进行基因编辑的步骤，所述植物为玉米。

本发明另一方面，提供一种试剂或试剂盒，所述试剂或试剂盒可用于降低植物的株高，所述的试剂含有本发明所述的突变蛋白、编码突变蛋白的核苷酸、载体、核酸构建体，基因编辑试剂或宿主细胞。

除非另有定义，否则本文所用的技术和科学术语具有与所属领域的普通技术人员之一通常理解的相同的含义。

术语“载体”是包含允许载体整合入宿主细胞基因组或在细胞内不依赖于基因组而自主复制的元件。该载体可能包含保证自我复制的任何元件。其通常携带不是细胞中心代谢的一部分的基因，并且通常是双链DNA的形式。载体的选择通常取决于载体与该载体待引入之宿主细胞的相容性。如果使用载体，则载体的选择取决于本领域技术人员众所周知的用于转化宿主细胞的方法。例如，可以使用质粒载体。

“DELLA蛋白”，在玉米中由D8(Dwarf8)基因编码；不同玉米株系的Della蛋白可以通过基因工程技术来获得，如基因组测序、聚合酶链式反应(PCR)等。

如本文中所使用的，术语“同一性”用于指两个多肽之间或两个核酸之间序列的匹配情况。当两个进行比较的序列中的某个位置都被相同的碱基或氨基酸单体亚单元占据时(例如，两个DNA分子的每一个中的某个位置都被腺嘌呤占据，或两个多肽的每一个中的某个位置都被赖氨酸占据)，那么各分子在该位置上是同一的。两个序列之间的“百分数同一性”是由这两个序列共有的匹配位置数目除以进行比较的位置数目×100的函数。例如，如果两个序列的10个位置中有6个匹配，那么这两个序列具有60％的同一性。例如，DNA序列CTGACT和CAGGTT共有50％的同一性(总共6个位置中有3个位置匹配)。通常，在将两个序列比对以产生最大同一性时进行比较。这样的比对可通过使用，例如，可通过计算机程序例如Align程序(DNAstar,Inc.)方便地进行的Needleman等人(1970)J.Mol.Biol.48：443-453的方法来实现。还可使用已整合入ALIGN程序(版本2.0)的E.Meyers和W.Miller(Comput.ApplBiosci.，4:11-17(1988))的算法，使用PAM120权重残基表(weight residue table)、12的缺口长度罚分和4的缺口罚分来测定两个氨基酸序列之间的百分数同一性。此外，可使用已整合入GCG软件包(可在www.gcg.com上获得)的GAP程序中的Needleman和Wunsch(J MoIBiol.48:444-453(1970))算法，使用Blossum 62矩阵或PAM250矩阵以及16、14、12、10、8、6或4的缺口权重(gap weight)和1、2、3、4、5或6的长度权重来测定两个氨基酸序列之间的百分数同一性。

可以通过包括但不限于以下的已知方法计算“同源性”或“同一性”：Computational Molecular Biology[计算分子生物学](Lesk,A.M.编辑)OxfordUniversity Press[牛津大学出版社],纽约(1988)；Biocomputing:Informatics andGenome Projects[生物运算：信息学和基因组项目](Smith,D.W.编辑)Academic Press[学术出版社],纽约(1993)；Computer Analysis of Sequence Data,Part I[序列数据的计算机分析，第I部分](Griffin,A.M.和Griffin,H.G.编辑)Humana Press[胡马纳出版社],新泽西州(1994)；Sequence Analysis in Molecular Biology[分子生物学中的序列分析](von Heinje,G.编辑)Academic Press[学术出版社](1987)；以及Sequence AnalysisPrimer[序列分析引物](Gribskov,M.和Devereux,J.编辑)Stockton Press[斯托克顿出版社],纽约(1991)。

本发明所述Della蛋白的特定氨基酸位置(编号)是利用标准序列比对工具通过将目标氨基酸序列进行比对而确定的，譬如用Smith-Waterman运算法则或用CLUSTALW2运算法则比对两个序列，其中当比对得分最高时认为所述序列是对准的。比对得分可依照Wilbur,W.J.and Lipman,D.J.(1983)Rapid similarity searches ofnucleic acid andprotein data banks.Proc.Natl.Acad.Sci.USA,80:726-730中所述的方法进行计算。在ClustalW2(1.82)运算法则中优选使用默认参数：蛋白质缺口开放罚分＝10.0；蛋白质缺口延伸罚分＝0.2；蛋白质矩阵＝Gonnet；蛋白质/DNA端隙＝-1；蛋白质/DNAGAPDIST＝4。优选采用AlignX程序(vectorNTI组中的一部分)，以适于多重比对的默认参数(缺口开放罚分:10og缺口延伸罚分0.05)。通过将不同玉米自交系或品种的Della蛋白的氨基酸序列进行对比，从而确定不同亲本Della蛋白的氨基酸与SEQ ID No.1所对应的特定位置；通过本领域公知的序列比对方式，本领域技术人员可以获知不同品种的玉米的Della蛋白序列与SEQID No.1的氨基酸对应关系。

术语“植物组织”或“植物部分”包括植物细胞、原生质体、植物组织培养物、植物愈伤组织、植物块以及植物胚、花粉、胚珠、种子、叶、茎、花、枝、幼苗、果实、核、穗、根、根尖、花药等。

术语“植物细胞”应理解为来自或发现于植物的任何细胞，其能够形成例如：未分化组织如愈伤组织，分化组织如胚胎，植物的组成部分，植物或种子。

术语“基因编辑”技术包括CRISPR技术、TALEN技术、ZFN技术。CRISPR技术是指成簇、规律间隔的短回文重复序列(Clustered regularly interspaced short palindromicrepeats)，其来自微生物的免疫系统。其中基因编辑工具包括guideRNA、Cas蛋白(如Cas9、Cpf1、Cas12b等)。TALEN技术中所指的基因编辑工具是可以切割特定DNA序列的限制酶，其包括一个TAL效应子DNA结合结构域和一个DNA切割结构域。ZFN技术中所指的基因编辑工具也是可以切割特定DNA序列的限制酶，其包括一个锌指DNA结合结构域与一个DNA切割结构域。本领域技术人员熟知，将编码基因编辑工具的核苷酸及其他调控元件构建于适宜的载体中，再转化细胞，可以实现对细胞内基因组的编辑，所述编辑的类型包括基因敲除、插入、碱基编辑。

本领域技术人员清楚，可以改变蛋白质的结构而不对其活性和功能性产生不利影响，例如可以在蛋白质氨基酸序列中引入一个或多个保守性氨基酸取代，而不会对蛋白质分子的活性和/或三维结构产生不利影响。本领域技术人员清楚保守性氨基酸取代的实例以及实施方式。具体的说，可以用与待取代位点属于相同组的另一氨基酸残基取代该氨基酸残基，即用非极性氨基酸残基取代另一非极性氨基酸残基，用极性不带电荷的氨基酸残基取代另一极性不带电荷的氨基酸残基，用碱性氨基酸残基取代另一碱性氨基酸残基，和用酸性氨基酸残基取代另一酸性氨基酸残基。这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的。只要取代不导致蛋白质生物活性的失活，则一种氨基酸被属于同组的其他氨基酸替换的保守取代落在本发明的范围内。因此，本发明的蛋白可以在氨基酸序列中包含一个或多个保守性取代,这些保守性取代最好根据表1进行替换而产生。另外，本发明也涵盖还包含一个或多个其他非保守取代的蛋白，只要该非保守取代不显著影响本发明的蛋白质的所需功能和生物活性即可。保守氨基酸置换可以在一个或多个预测的非必需氨基酸残基处进行。“非必需”氨基酸残基是可以发生改变(缺失、取代或置换)而不改变生物活性的氨基酸残基，而“必需”氨基酸残基是生物活性所需的。“保守氨基酸置换”是其中氨基酸残基被具有类似侧链的氨基酸残基替代的置换。氨基酸置换可以在Della蛋白的非保守区域中进行。一般而言，此类置换不对保守的氨基酸残基，或者不对位于保守基序内的氨基酸残基进行，其中此类残基是蛋白质活性所需的。然而，本领域技术人员应当理解，功能变体可以具有较少的在保守区域中的保守或非保守改变。

本领域熟知，可以从蛋白质的N和/或C末端改变(置换、删除、截短或插入)一或多个氨基酸残基而仍保留其功能活性。因此，从Della蛋白的N和/或C末端改变了一或多个氨基酸残基、同时保留了其所需功能活性的蛋白，也在本发明的范围内。这些改变可以包括通过现代分子方法例如PCR而引入的改变，所述方法包括借助于在PCR扩增中使用的寡核苷酸之中包含氨基酸编码序列而改变或延长蛋白质编码序列的PCR扩增。

应认识到，蛋白质可以以各种方式进行改变，包括氨基酸置换、删除、截短和插入，用于此类操作的方法是本领域通常已知的。例如，可以通过对DNA的突变来制备Della蛋白的氨基酸序列变体。还可以通过其他诱变形式和/或通过定向进化来完成，例如，使用已知的诱变、重组和/或改组(shuffling)方法，结合相关的筛选方法，来进行单个或多个氨基酸取代、缺失和/或插入。

领域技术人员能够理解，本发明Della蛋白中的这些微小氨基酸变化可以出现(例如天然存在的突变)或者产生(例如使用r-DNA技术)而不损失蛋白质功能或活性。如果这些突变出现在蛋白的催化结构域、活性位点或其它功能结构域中，则多肽的性质可改变，但多肽可保持其活性。如果存在的突变不接近催化结构域、活性位点或其它功能结构域中，则可预期较小影响。

本领域技术人员可以根据本领域已知的方法，例如定位诱变或蛋白进化或生物信息系的分析，来鉴定Della蛋白的必需氨基酸。蛋白的催化结构域、活性位点或其它功能结构域也能够通过结构的物理分析而确定，如通过以下这些技术：如核磁共振、晶体学、电子衍射或光亲和标记，结合推定的关键位点氨基酸的突变来确定。

表1

术语“蛋白”、“多肽”和“肽”在本发明中可以互换使用，指的是氨基酸残基聚合物，包括其中一个或多个氨基酸残基是天然氨基酸残基的化学类似物的聚合物。本发明的蛋白和多肽可以重组产生，也可以通过化学合成。术语“突变蛋白”或“突变型蛋白”指的是这样的蛋白质，其与亲本蛋白质的氨基酸序列相比，具有一个或多个氨基酸残基的取代、插入、缺失和/或添加。如本文所用，术语“DELLA突变蛋白”、“突变的DELLA多肽”、“突变型DELLA多肽”、“突变DELLA蛋白”、“突变蛋白”、“突变多肽”等可互换使用。

术语“编码”是指多核苷酸中特定核苷酸序列的固有特性，例如基因，cDNA或mRNA，作为在具有限定的核苷酸序列(即rRNA，tRNA和mRNA)或限定的氨基酸序列及其产生的生物学特性的生物学过程中合成其它聚合物和大分子的模板。因此，如果对应于该基因的mRNA的转录和翻译在细胞或其它生物系统中产生蛋白质，则该基因编码该蛋白质。

术语“氨基酸”是指含有氨基的羧酸。生物体内的各种蛋白质是由20种基本氨基酸构成的。

术语“植物”应理解为能够进行光合作用的任何分化的多细胞生物，在包括处于任何成熟或发育阶段的作物植物，特别是单子叶或双子叶植物，蔬菜作物，包括洋蓟、球茎甘蓝、芝麻菜、韭葱、芦笋、莴苣(例如，结球莴苣、叶莴苣、长叶莴苣)、小白菜(bok choy)、黄肉芋、瓜类(例如，甜瓜、西瓜、克伦肖瓜(crenshaw)、白兰瓜、罗马甜瓜)、油菜作物(例如，球芽甘蓝、卷心菜、花椰菜、西兰花、羽衣甘蓝、无头甘蓝、大白菜、小白菜)、刺菜蓟、胡萝卜、洋白菜(napa)、秋葵、洋葱、芹菜、欧芹、鹰嘴豆、欧洲防风草、菊苣、胡椒、马铃薯、葫芦(例如，西葫芦、黄瓜、小西葫芦、倭瓜、南瓜)、萝卜、干球洋葱、芜菁甘蓝、紫茄子(也称为茄子)、婆罗门参、苣菜、青葱、苦苣、大蒜、菠菜、绿洋葱、倭瓜、绿叶菜类(greens)、甜菜(糖甜菜和饲料甜菜)、甘薯、唐莴苣、山葵、西红柿、芜菁、以及香辛料；水果和/或蔓生作物，如苹果、杏、樱桃、油桃、桃、梨、李子、西梅、樱桃、榅桲、杏仁、栗子、榛子、山核桃、开心果、胡桃、柑橘、蓝莓、博伊增莓(boysenberry)、小红莓、穗醋栗、罗甘莓、树莓、草莓、黑莓、葡萄、鳄梨、香蕉、猕猴桃、柿子、石榴、菠萝、热带水果、梨果、瓜、芒果、木瓜、以及荔枝；大田作物，如三叶草、苜蓿、月见草、白芒花、玉米/玉蜀黍(饲料玉米、甜玉米、爆米花)、啤酒花、荷荷芭、花生、稻、红花、小粒谷类作物(大麦、燕麦、黑麦、小麦等)、高粱、烟草、木棉、豆科植物(豆类、小扁豆、豌豆、大豆)、含油植物(油菜、芥菜、罂粟、橄榄、向日葵、椰子、蓖麻油植物、可可豆、落花生)、拟南芥属、纤维植物(棉花、亚麻、大麻、黄麻)、樟科(肉桂、莰酮)、或一种植物如咖啡、甘蔗、茶、以及天然橡胶植物；和/或花坛植物，如开花植物、仙人掌、肉质植物和/或观赏植物，以及树如森林(阔叶树和常绿树，如针叶树)、果树、观赏树、以及结坚果的树(nut-bearing tree)、以及灌木和其他苗木。

本发明的主要优点：

1、本发明筛选出了一组突变的DELLA蛋白。

2、含有本发明突变的DELLA蛋白的玉米植株相比野生型玉米植株相比，其株高显著降低。

附图说明

图1为本实施方式中利用的基因编辑载体示意图。

图2不同玉米编辑植株与野生型的DELLA蛋白氨基酸序列比对结果。

图3不同编辑植株相对于野生型的高度变化比例。

图4部分编辑植株与野生型玉米植株株高对比图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的说明，以下所述，仅是对本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明的技术实质对以下实施例所做的任何简单修改或等同变化，均落在本发明的保护范围内。

实施例1、靶点设计和载体构建

首先通过玉米基因与基因组数据库(maizeGDB)和NCBI进行玉米中编码DELLA蛋白的基因D8(Dwarf8)基因的分析，获取D8基因的序列，标记出相关的基因序列信息，在下载的D8基因序列上注明各个结构域基序以及外显子、内含子范围。

本研究旨在对DELLA蛋白DELLA结构域氨基酸序列进行改变，故选择对DELLA蛋白N端第1-105位氨基酸(包含DELLA基序和VHYNP基序)区域进行编辑。NCBI提供的玉米B73自交系D8基因所编码的DELLA蛋白N端第1-105位氨基酸序列如下所示：MKREYQDAGGSGGDMGSSKDKMMAAAAGAGEQEEEDVDELLAALGYKVRSSDMADVAQKLEQLEMAMGMGGVGGAGATADDGFVSHLATDTVHYNPSDLSSWVES，见序列表中SEQ ID No.1所。对不同的玉米自交系进行测序，结果显示，玉米自交系郑58、齐319、XCW175中的DELLA蛋白N端第1-105位氨基酸序列与B73中的一致。

为了在上述区域进行基因编辑，根据sgRNA设计原则设计了5条sgRNA，分别命名为sgRNA1(GTACTCGCGCTTCATGATTTCGG)、sgRNA2(CGGCGACATGGGCTCCTCCAAGG)、sgRNA3(GGAGGACGTGGATGAGCTGCTGG)、sgRNA(GAGATGGCCATGGGGATGGGCGG)、sgRNA5(GCCGGCGCTACCGCTGATGACGG)。

本实施例中利用Cas9和靶向D8基因的sgRNA在不同的玉米自交系中针对D8基因进行编辑，具体操作方法可按照本领域常规的方式进行；本实施方式中，所构建的基因编辑载体的示意图如图1所示；其中，ZmU6pro为U6启动子，Gly-tRNA为甘氨酸tRNA，ZmU6Ter为终止子，UBIpro为UBI启动子，NLS为核定位信号；载体构建亦可借鉴参考文献(“High-efficiency CRISPR/Cas9 multiplex gene editing using the glycine tRNA-processing system-based strategy in maize”，Weiwei Qi等，《BMC Biotechnology》，2016)；本实施例中，Cas9采用植物密码子优化的Cas9，在其他的实施方式中，也可以采用其他方式优化的Cas9。

具体而言，根据玉米D8基因中编码DELLA结构域的基因序列与所设计的5条sgRNA，分别构建命名为D8-1、D8-2、D8-3、D8-4的基因编辑载体。具体构建方法如下：

设计克隆靶标序列的引物，此引物需涵盖目标片段特异性引物序列与部分重叠序列，以Gly-tRNA为模板，分别用D8-g1-F(TAGGTCTCTTGCAGTACTCGCGCTTCATGATTTgttttagagctagaaatagcaagt)和D8-g2-R(TAGGTCTCTAAACTGGAGGAGCCCATGTCGCCGtgcaccagccgggaatcg)、D8-g1-F和D8-g3-R(TAGGTCTCTAAACGCAGCTCATCCACGTCCTCCtgcaccagccgggaatcg)、D8-g1-F和D8-g4-R(TAGGTCTCTAAACCCCATCCCCATGGCCATCTC tgcaccagccgggaatcg)、D8-g1-F/和D8-g5-R(TAGGTCTCTAAACTCATCAGCGGTAGCGCCGGC tgcaccagccgggaatcg)这4对引物进行PCR扩增。

将以上片段的克隆各使用高保真的Pfu DNA聚合酶进行扩增，将所需要DNA片段使用纯化试剂盒进行纯化。

纯化后的Gly-tRNA-gRNA片段与中间载体PGH均含有限制性内切酶BsaI的酶切位点，因此选用BsaI对DNA片段与中间载体PGH进行酶切处理，酶切后DNA片段回收约200bp左右片段，中间载体PGH回收约3.7kb的片段。

将各自两组片段用T4 DNA连接酶进行连接，加T4连接后所得产物于DH5α感受态细胞中，涂布于Kan平板培养，挑8个菌落液体培养2h，PCR菌液检测，选择正确的单克隆2个，进行菌液送测。

选择测序正确的单克隆进行扩繁、保菌、提质粒，转化农杆菌EHA105，挑取5个单菌落培养，PCR检测正确后保菌备用。

经过以上步骤，D8-1、D8-2、D8-3、D8-4四个载体构建完成；其中，D8-1以sgRNA1+sgRNA2为靶点；D8-2以sgRNA1+sgRNA3为靶点的载体；D8-3以sgRNA1+sgRNA4为靶点；D8-4以sgRNA1+sgRNA5为靶点。

实施例2、遗传转化

本实施例中，选择玉米自交系郑58、齐319、XCW175，分别利用实施例1中的载体进行基因编辑。

2.1转化农杆菌

将实施例1中的载体利用热击法转入农杆菌菌株EHA105中，挑取单克隆经液体培养以及PCR鉴定后保存于-80℃冰箱中备用。

2.2菌种活化

从冰箱取出菌，在YEP固体培养基上划线培养。

2.3准备农杆菌侵染液

从新活化的菌板上刮取新鲜菌体，重悬到侵染液中。

2.4取玉米幼胚

取授粉后10天左右的玉米果穗，拨去苞叶和花丝，挑取幼胚，放入加有AS的侵染培养基(不含农杆菌)中。

2.5侵染

将待转化幼胚用侵染液洗3遍，至侵染液澄清，将侵染液倒干净加入1ml菌液，温和颠倒10下，静置5～10min。取干净培养皿，放3张灭菌滤纸，侵染完毕后颠倒几下后迅速将菌液倒在滤纸上，手持培养皿，变换方向使携带幼胚的菌液在滤纸上均匀分布。

2.6共培养

待最上一层滤纸看不到菌液时用镊子将上层滤纸夹起，沾有幼胚的一面贴在共培养培养基上，用镊子驱赶滤纸和培养基之间的气泡后，用镊子夹住滤纸一角快速揭下，留在滤纸上的幼胚用剥胚刀转移到培养基上，幼胚盾面朝上，22℃暗培养3天。

2.7恢复培养

共培养3天后，将幼胚转移到恢复培养基。

2.8分化

将幼胚转移至分化培养基，开始光照培养两周，然后更换新的分化培养基，继续分化光照培养两周。

2.9生根

将分化产生的小苗转接到生根培养基，每瓶3～4个小苗，25～28℃光照培养直至长成完整植株，生根培养7天后将有白色小根长出，可取样检测。

实施例3、阳性苗的筛选

对于再生苗，取少量叶片以CTAB法提取基因组DNA。鉴定所构建的玉米D8基因编辑载体是否转入玉米幼胚，对玉米基因组中没有而载体上含有的元件设计引物进行PCR鉴定，用引物对Cas-jc-F1(AAGAAGCGGAAGGTCGGTAT)和Cas-jc-R1(CTCAGGTGGTAGATGGTGGG)，Cas-jc-F2(CAGAAAGAGCGAGGAAACCA)和Cas-jc-R2(CCTCAAACAGTGTCAGGGTCA)，ZmU6P-F(AAACAGCAGTCCGTAGGTG)和ZmU6T-R(AGAATTGGCGAGGACTGA)等3对引物分别检测，任何一对引物可以扩增到目的产物，则该再生苗即为转基因阳性苗。

对于转基因阳性苗以引物对ZmD8-jc-F1(CCCTCCCCTACCCTTTCCT)和ZmD8-jc-R1(TGTGACGGTGGACGATGTGG)扩增D8基因的相应片段。扩增产物经sanger法进行测序，确认编辑形式。

结果显示，利用载体D8-1转化郑58(Z58)幼胚获得了编辑植株B19，转化齐319(Q319)幼胚获得了编辑植株B24-12；转化XCW175幼胚获得了编辑植株156-37；转化郑58幼胚获得了编辑植株D3；转化XCW175幼胚获得了编辑植株121-13。

利用载体D8-2转化XCW175幼胚获得了编辑植株1-52；转化XCW175幼胚获得了编辑植株89-1。

利用载体D8-3转化Q319幼胚获得了编辑植株D41-4-16；转化Q319幼胚获得了编辑植株J8。

利用载体D8-4转化Q319幼胚获得了编辑植株R13；转化郑58幼胚获得了编辑植株N2；转化郑58幼胚获得了编辑植株Q4；转化Q319幼胚获得了编辑植株Q15；转化郑58幼胚获得了编辑植株N17；转化郑58幼胚获得了编辑植株N9。

测序结果显示，上述不同编辑植株的DELLA蛋白的编辑形式如表1所示。

表1.不同编辑植株的DELLA蛋白编辑类型

上述不同编辑植株的DELLA蛋白N端1-105位氨基酸编辑后的突变体与野生型DELLA蛋白N端1-105位氨基酸(SEQ ID No.1)的序列对比结果如图2所示。

对上述编辑植株的植株高度进行测量并与野生型玉米植株进行对比(在授粉结束后一周测量，此时玉米株高不会再有显著变化)。结果显示，不同的编辑类型相对于野生型植株，产生了不同的株高矮化表型，如图3所示。对DELLA蛋白N端1-105位氨基酸的编辑所造成的不同的编辑形式对于株高的影响也各不相同。具体而言：

N17、B24-12、B19相对于野生型植株，株高几乎没有变化。

R13、J8、Q4和Q15相对于野生型植株并没有导致矮化的表型，反倒提高了植株的株高。其中，株系R13、J8、Q4与Q15的株高增高的程度分别约为5％、6％、8％与12％。

121-13、156-37、156-29、N2、D41-4-16、N9、D3、1-52、N11和89-1相对于野生型植株，株高呈现了不同程度的降低。其中，121-13、156-29、156-37株系的株高相对于野生型分别降低约11％、14％、15％；株系N2、N9、D3则表现出了显著的矮化表型，这三个株系株高降低程度分别为野生型的47％、55％、56％左右；D41-4-16株系的株高相比于野生型株高降低了约48％，显现出明显的半矮化表型；1-52株系表现出了明显矮化的表型，株高相对于野生型降低近60％；N11株系相对于野生型也产生了显著的矮化表型，株高降低约62％；89-1株系表现出了极端矮化的表型，此突变株的株高相对于野生型降低了近80％。

根据上述基因编辑后代材料的株高以及对其表型的观察可知，对玉米D8基因进行编辑后获得多种编辑类型的突变体，这些编辑类型不同的突变体会导致植株的株高产生不同的改变，可能会导致株高增加、株高的变化并不显著以及植株高度的明显矮化、茎秆高度变得极矮等表型，所获得的突变体中部分突变体株高增加且范围在5％-15％之间，部分突变体株高降低程度在10％-80％范围内，图4示出了部分编辑植株与野生型玉米植株株高对比结果。本发明中获得的株高降低程度不同的矮化突变体与种质资源，会极大的丰富玉米育种的种质资源。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东舜丰生物科技有限公司

<120> 突变的DELLA蛋白及其应用

<130> SF085

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 105

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> della

<400> 1

Met Lys Arg Glu Tyr Gln Asp Ala Gly Gly Ser Gly Gly Asp Met Gly

1 5 10 15

Ser Ser Lys Asp Lys Met Met Ala Ala Ala Ala Gly Ala Gly Glu Gln

20 25 30

Glu Glu Glu Asp Val Asp Glu Leu Leu Ala Ala Leu Gly Tyr Lys Val

35 40 45

Arg Ser Ser Asp Met Ala Asp Val Ala Gln Lys Leu Glu Gln Leu Glu

50 55 60

Met Ala Met Gly Met Gly Gly Val Gly Gly Ala Gly Ala Thr Ala Asp

65 70 75 80

Asp Gly Phe Val Ser His Leu Ala Thr Asp Thr Val His Tyr Asn Pro

85 90 95

Ser Asp Leu Ser Ser Trp Val Glu Ser

100 105

Claims (13)

1.一种相对于亲本DELLA蛋白具有氨基酸突变的DELLA突变蛋白，所述亲本DELLA蛋白来源于玉米，其特征在于，所述DELLA突变蛋白相对于亲本DELLA蛋白在对应于SEQ ID No.1所示序列的若干个氨基酸存在突变。

2.如权利要求1所述的DELLA突变蛋白，其特征在于，所述DELLA突变蛋白选自如下任意一种或任意几种组合：

(1)缺失对应于SEQ ID No.1所示序列的第1-80位氨基酸；

(2)缺失对应于SEQ ID No.1所示序列的第1-40位氨基酸；

(3)对应于SEQ ID No.1所示序列的第80-84位氨基酸序列替换为ERVRV，并且缺失对应于SEQ ID No.1所示序列的第85位-105位氨基酸；

(4)缺失对应于SEQ ID No.1所示序列的第66-72位氨基酸；

(5)缺失对应于SEQ ID No.1所示序列的第1-4位和第17位氨基酸；

(6)缺失对应于SEQ ID No.1所示序列的第11-18位氨基酸；

(7)对应于SEQ ID No.1所示序列的第42位和43位氨基酸分别突变为E和M，并且，缺失对应于SEQ ID No.1所示序列的第44-60位氨基酸。

3.如权利要求1或2所述的DELLA突变蛋白，其特征在于，所述亲本DELLA蛋白来源于天然存在的玉米自交系，并且所述亲本DELLA蛋白的N端第1-105位氨基酸序列与SEQ ID No.1所示的氨基酸序列具有至少95％的序列同一性。

4.一种融合蛋白，其包含权利要求1-3任一所述的DELLA突变蛋白。

5.一种多核苷酸，其编码权利要求1-3任一所述的DELLA突变蛋白，或编码权利要求4所述的融合蛋白。

6.一种载体，所述载体包含权利要求5所述的多核苷酸。

7.一种宿主细胞，其含有权利要求1-3任一所述的DELLA突变蛋白，或权利要求5所述的多核苷酸，或权利要求6所述的载体。

8.一种基因编辑试剂，其特征在于，所述基因编辑试剂能够在植物中产生权利要求1-3任一所述的突变蛋白；所述基因编辑试剂包括CRISPR/Cas蛋白和gRNA，所述gRNA可以靶向植物内源性的DELLA蛋白编码基因，所述植物为玉米。

9.一种降低植物的株高的方法，或者，一种制备株高降低的植物的方法，所述方法包括在植物细胞、植物种子、植物组织、植物部分或植物中引入权利要求1-3任一所述的DELLA突变蛋白的步骤，所述植物为玉米。

10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述引入权利要求1-3任一所述的DELLA突变蛋白包括将植物的内源性的DELLA蛋白编码基因进行突变从而引入所述突变蛋白步骤；优选的，通过基因编辑的方式在植物中引入所述DELLA突变蛋白。

11.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述引入权利要求1-3任一所述的DELLA突变蛋白包括将所述突变蛋白在植物细胞、植物种子、植物组织、植物部分或植物中进行表达的步骤。

12.权利要求1-3任一所述的突变蛋白，权利要求4所述的融合蛋白，权利要求5所述的多核苷酸，权利要求6所述的载体，权利要求7所述的宿主细胞，或权利要求8所述的基因编辑试剂在制备株高降低的植物中的用途；或者，在制备降低植物株高的试剂或试剂盒中的用途；所述植物为玉米。

13.一种株高降低的玉米植株，所述玉米植株中含有权利要求1-3任一所述的突变蛋白，权利要求4所述的融合蛋白，权利要求5所述的多核苷酸，权利要求6所述的载体，权利要求7所述的宿主细胞，或权利要求8所述的基因编辑试剂；或者，所述玉米植株由权利要求9-11任一所述的方法制备得到。

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