CN113786499A - 一种基于纳米马达的细菌生物被膜清除方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于纳米马达的细菌生物被膜清除方法，在低浓度双氧水的存在下，管状纳米马达FMM进行高速运动，从而钻入细菌生物被膜破坏其完整性，并将低抗菌活性的双氧水转化为高抗菌活性的羟基自由基，高效杀死被膜菌。本发明采用的纳米马达制备方法简单，成本低，运行速度快，且具有磁靶向能力；将物理破坏和化学降解相结合，细菌生物被膜破坏完全，被膜菌可被完全杀死。

Description

一种基于纳米马达的细菌生物被膜清除方法

技术领域

本发明属于纳米生物医学领域领域，具体涉及一种基于纳米马达的细菌生物被膜清除方法。

背景技术

在过去几十年以来，细菌感染性疾病已经成为世界上最大的健康问题之一，引起了人们持续而广泛的关注。一方面，抗生素的滥用增加了细菌的耐药性，这将降低其治疗效率，进而导致高的死亡率。另一方面，细菌能够形成生物被膜，被膜菌无论其形态结构、生理生化特性、致病性还是对环境因子的敏感性等都与浮游细菌有显著的不同，尤其对抗生素和宿主免疫系统具有很强的抵抗力，从而导致严重的临床问题，引起许多慢性和难治性感染疾病的反复发作。研究表明，80％以上的细菌性感染疾病过程中细菌是以生物被膜状态存在的，每年全球约有百万人因生物被膜感染发病或死亡。按常规的经验疗法治疗生物被膜感染时大多难以达到理想的疗效，这已成为临床治疗上的一个难点。此外，细菌生物被膜能造成设备损坏、产品污染和能量损耗，每年对世界经济的损失达数十亿美元。生物被膜的三维结构是清洁剂和抗菌药物的天然屏障，与普通细菌相比，能够形成生物被膜的细菌对清洗和消毒剂的耐受力更强，为浮游菌的10～1000倍，导致加工设备表面无法严格清洗消毒，被膜所含的细胞及孢子不断分离成为食品潜在的污染源。常规的治疗如消毒和清洗策略只能根除未吸附的和未聚集的浮游菌，而不能有效地解决与生物被膜相关的问题。

人工微纳米马达是模仿自然界中的生物马达制备而成的微纳尺度动力装置，具有稳定性高、制备工艺简单和可大批量生产等优点，在生物传感、环境治理、药物靶向运输和疾病诊断等领域有重要应用。2002年，哈佛大学Whitesides等报道了一个通过铂催化过氧化氢分解驱动的圆盘。2004年，Sen等报道了不对称分解过氧化氢驱动的Au/Pt纳米马达，引领了微纳米马达的研究热潮。在此后的十几年，对该领域的研究呈指数型增长，多种形貌的微纳米马达如棒/线状、管状、球状和螺旋状被成功合成。目前，微/纳米马达也已成功应用于细菌检测和分离领域。

发明内容

发明目的：本发明提供一种基于纳米马达的细菌生物被膜清除方法，纳米马达制备方法简单，成本低，运行速度快，具有磁靶向能力。在低浓度双氧水的存在下，可以高速运动，从而钻入细菌生物被膜破坏其完整性，并将低抗菌活性的双氧水转化为高抗菌活性的羟基自由基，高效杀死被膜菌。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种基于纳米马达的细菌生物被膜清除方法，在低浓度双氧水的存在下，管状纳米马达FMM进行高速运动，从而钻入细菌生物被膜破坏其完整性，并将低抗菌活性的双氧水转化为高抗菌活性的羟基自由基，高效杀死被膜菌。

进一步的，所述方法具体包括以下步骤：

将200-500μL 含有500μg/ml的管状纳米马达FMM和1％双氧水的混合溶液加入到细菌被膜感染部位，通过控制磁铁的缓慢移动，引导管状纳米马达FMM精准运动至目标微生物污垢聚集的地方，完全清除细菌生物被膜并杀死被膜菌。

进一步的，所述管状纳米马达的制备方法，包括以下步骤：

S1、利用商品化的聚碳酸酯膜为模板，制备介孔硅管；

S2、然后，在步骤S1所得介孔硅管内部原位合成Mn-Motor；

S3、再在步骤S2所得介孔硅管外面键合Fe₃O₄制备出管状纳米马达FMM。

进一步的，步骤S1所述介孔硅管的制备方法包括以下步骤：

S11、采用聚碳酸酯膜作为模板，将聚碳酸酯膜的一端喷金，保证孔的一端完全堵塞；

S12、将十六烷基三甲基溴化铵10-15mg和三乙醇胺10-20mg溶于4-6mL去离子水中，置于装有聚碳酸酯膜的玻璃瓶中；

S13、将玻璃瓶中的混合物加热到80℃时，在搅拌条件下加入5-10μL 3-氨基丙基三乙氧基硅烷，在80℃恒温下反应30分钟后，加入15-30μL 3-氨基丙基三乙氧基硅烷和50-100μL正硅酸四乙酯，并在80℃下搅拌2-5h；最后，远离热源，室温下持续搅拌20-30分钟，得到介孔硅管，用水清洗，并用棉签擦拭硅管两面。

进一步的，步骤S2所述Mn-Motor的制备方法包括以下步骤：

S21、将步骤S1所得介孔硅管置于30-50mL的20mM KMnO₄中，再转移到100mL特氟龙内衬的不锈钢高压釜中，在160℃加热8-10h；冷却到室温后，用去离子水冲洗介孔硅管产生的黑色物质，并用棉签擦拭两面，去除过量的MnO₂；

S22、将步骤S21所得介孔硅管在1-3mL二氯甲烷中溶解10-15min，14000rpm离心3-5min后释放游离的Mn-Motor，在CH₂Cl₂中洗涤2-3次，在乙醇中洗涤2-3次，在去离子水中洗涤2-3次；游离Mn-Motor被储存在室温的去离子水中。

进一步的，步骤S3所述管状纳米马达FMM的制备方法包括以下步骤：

S31、将30-50mg Fe₃O₄纳米颗粒分散在3-5mL氯仿中，将得到的溶液加入30-50mL0.1M 2-溴代异丁酸溶液中，在室温下搅拌36-48h后，2-溴代异丁酸稳定的纳米颗粒通过加入过量的乙醇进行沉淀，沉淀的纳米颗粒用离心法回收；

S32、将2-溴代异丁酸稳定的Fe₃O₄纳米颗粒分散在3-5mL四氢呋喃中，然后把它们加入到含有0.1-0.2g Mn-Motor的20-30mL四氢呋喃中，加热回流3-5h；最后，管状纳米马达FMM组装体通过磁分离收集。

有益效果：本发明的具体优势如下：

(1)本发明采用的纳米马达制备方法简单，成本低，运行速度快，具有磁靶向能力；

(2)本发明中将物理破坏和化学降解相结合，细菌生物被膜破坏完全；(图3)

(3)本发明中将低抗菌活性的双氧水转化为高抗菌活性的羟基自由基，能够高效杀死被膜菌；(图4)

(4)本发明材料可回收利用；

(5)本发明使用操作简单，可控性强。

附图说明

图1是本发明的马达FMM的TEM图；

图2马达FMM在1％双氧水中的运行轨迹；

图3是本发明的马达对细菌生物被膜的破坏程度示意图。紫色为结晶紫染色的残留细菌被膜；

图4是本发明马达清除细菌生物被膜效果的活/死细菌荧光显微镜图片。绿色和红色分别代表活菌和死菌；

图5是本发明应用实例1中直形微流控芯片通道中细菌生物被膜清除效果示意图；

图6是本发明应用实例2中螺旋形微流控芯片通道中细菌生物被膜清除效果示意图。

具体实施方式

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，以使本领域的技术人员能够更好的理解本发明的优点和特征，从而对本发明的保护范围做出更为清楚的界定。本发明所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

具体实施例1

(1)介孔二氧化硅微管的制备；采用聚碳酸酯膜(Whatman，圆锥形微孔，直径2微米)作为模板，将薄膜的一端喷金，保证孔的一端完全堵塞。将十六烷基三甲基溴化铵10mg和三乙醇胺10mg溶于4mL去离子水中，置于装有聚碳酸酯膜的玻璃瓶中。混合物加热到80℃时，在搅拌条件下加入5μL 3-氨基丙基三乙氧基硅烷。在80℃恒温下反应30分钟后，加入15μL 3-氨基丙基三乙氧基硅烷和50μL正硅酸四乙酯，并在80℃下搅拌2h。最后，远离热源，室温下持续搅拌20分钟。膜用水清洗，并用棉签擦拭两面。

(2)Mn-Motor的制备；合出介孔二氧化硅管后，将其置于30mL的20mM KMnO₄中，转移到100mL特氟龙内衬的不锈钢高压釜中，在160℃加热8h。冷却到室温后，用去离子水冲洗膜产生的黑色物质，并用棉签擦拭两面，去除过量的MnO₂。将聚碳酸酯膜模板在1mL二氯甲烷中溶解10min，14000rpm离心3min后释放游离的Mn-Motor，在CH₂Cl₂中洗涤2次，在乙醇中洗涤2次，在去离子水中洗涤2次。游离Mn-Motor被储存在室温的去离子水中。

(3)FMM的制备；将30mg Fe₃O₄纳米颗粒分散在3mL氯仿中，将得到的溶液加入30mL0.1M 2-溴代异丁酸(BMPA)溶液中。在室温下搅拌36h后，纳米颗粒通过加入过量的乙醇进行沉淀。沉淀的纳米颗粒用离心法回收。BMPA稳定的Fe₃O₄纳米颗粒分散在3mL四氢呋喃中，然后把它们加入到含有0.1g Mn-Motor分散在20mL四氢呋喃中，加热回流3h。最后，FMM组装体通过磁分离收集。

(4)直形微流控芯片通道中细菌生物被膜的清除；

用10⁹cfu/mL的金黄色葡萄球菌菌液充满直形微流控通道(直径700μm)，37℃下培养72h以形成细菌生物被膜。随后，将200μL含有500μg/ml的FMM和1％双氧水的混合溶液注入通道中，通过控制磁铁的缓慢移动，引导FMM精准穿过微流控通道。结果表明，通道内细菌生物被膜被完全清除，被膜菌也被完全杀死。(图5)

具体实施例2

(1)介孔二氧化硅微管的制备；采用聚碳酸酯膜(Whatman，圆锥形微孔，直径2微米)作为模板，将薄膜的一端喷金，保证孔的一端完全堵塞。将十六烷基三甲基溴化铵15mg和三乙醇胺20mg溶于6mL去离子水中，置于装有聚碳酸酯膜的玻璃瓶中。混合物加热到80℃时，在搅拌条件下加入10μL 3-氨基丙基三乙氧基硅烷。在80℃恒温下反应30分钟后，加入30μL 3-氨基丙基三乙氧基硅烷和100μL正硅酸四乙酯，并在80℃下搅拌5h。最后，远离热源，室温下持续搅拌30分钟。膜用水清洗，并用棉签擦拭两面。

(2)Mn-Motor的制备；合出介孔二氧化硅管后，将其置于50mL的20mM KMnO₄中，转移到100mL特氟龙内衬的不锈钢高压釜中，在160℃加热10h。冷却到室温后，用去离子水冲洗膜产生的黑色物质，并用棉签擦拭两面，去除过量的MnO₂。将聚碳酸酯膜模板在3mL二氯甲烷中溶解15min，14000rpm离心5min后释放游离的Mn-Motor，在CH₂Cl₂中洗涤3次，在乙醇中洗涤3次，在去离子水中洗涤3次。游离Mn-Motor被储存在室温的去离子水中。

(3)FMM的制备；将50mg Fe₃O₄纳米颗粒分散在5mL氯仿中，将得到的溶液加入50mL0.1M 2-溴代异丁酸(BMPA)溶液中。在室温下搅拌48h后，纳米颗粒通过加入过量的乙醇进行沉淀。沉淀的纳米颗粒用离心法回收。BMPA稳定的Fe₃O₄纳米颗粒分散在5mL四氢呋喃中，然后把它们加入到含有0.2g Mn-Motor分散在30mL四氢呋喃中，加热回流5h。最后，FMM组装体通过磁分离收集。

(4)螺旋形微流控芯片通道中细菌生物被膜的清除；

用10⁹cfu/mL的金黄色葡萄球菌菌液充满螺旋形微流控通道(直径700μm)，37℃下培养72h以形成细菌生物被膜。随后，将500μL含有500μg/ml的FMM和1％双氧水的混合溶液注入通道中，通过控制磁铁的缓慢移动，引导FMM精准穿过微流控通道。结果表明，通道内细菌生物被膜被完全清除，被膜菌也被完全杀死。(图6)

显然，上述实施例仅仅是为了清楚地说明所做的举例，而非对实施方式的限制。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此引出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之内。

Claims (3)

1.一种基于纳米马达的细菌生物被膜清除方法，其特征在于，在低浓度双氧水的存在下，管状纳米马达FMM进行高速运动，从而钻入细菌生物被膜破坏其完整性，并将低抗菌活性的双氧水转化为高抗菌活性的羟基自由基，高效杀死被膜菌。

2.根据权利要求1所述一种基于纳米马达的细菌生物被膜清除方法，其特征在于，具体包括以下步骤：

将200-500μL含有500μg/ml的管状纳米马达FMM和1％双氧水的混合溶液加入到细菌被膜感染部位，通过控制磁铁的缓慢移动，引导管状纳米马达FMM精准运动至目标微生物污垢聚集的地方，完全清除细菌生物被膜并杀死被膜菌。

3.根据权利要求1所述一种基于纳米马达的细菌生物被膜清除方法，其特征在于，所述管状纳米马达的制备方法包括以下步骤：

S1、利用商品化的聚碳酸酯膜为模板，制备介孔硅管；

S2、然后，在步骤S1所得介孔硅管内部原位合成Mn-Motor；

S3、再在步骤S2所得介孔硅管外面键合Fe₃O₄制备出管状纳米马达FMM。

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