CN113786398B - 毛蕊异黄酮在制备aldh2激动剂的药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了毛蕊异黄酮在制备ALDH2激动剂的药物中的应用，属于医药领域。本发明具体公开毛蕊异黄酮在制备ALDH2激动剂的药物中的应用、在制备防治酒精性心肌病的药物中的应用以及在制备抑制酒精诱导的心肌细胞凋亡药物中的应用。本发明公开的毛蕊异黄酮通过提高心肌细胞ALDH2活性增加活化性醛类，抑制酒精诱导的心肌细胞凋亡，进而为毛蕊异黄酮用于ALDH2激动剂以及防治酒精性心肌病药物制备提供可科学依据，并且毛蕊异黄酮对正常细胞的毒性低，来源于传统中药黄芪、甘草，具有一定安全性，制备成本亦较低，具有临床应用前景。

Description

毛蕊异黄酮在制备ALDH2激动剂的药物中的应用

技术领域

本发明涉及医药领域，特别是涉及一种毛蕊异黄酮在制备ALDH2激动剂的药物中的应用。

背景技术

乙醛脱氢酶2(Acetaldehyde dehydrogenase 2,ALDH2)是乙醛脱氢酶家族的一员，广泛存在于线粒体中，是醛类物质代谢的关键酶。醛类物质是机体重要的代谢产物，在很多病理过程中发挥关键作用，包括4-羟基壬烯醛(4-Hydroxynonenal，4-HNE)、丙二醛(Malonaldehyde，MDA)等。当机体处于氧化应激状态下，如缺血、缺氧，可产生大量的活化性醛类，对机体造成损伤。ALDH2可将对细胞组织有毒性的活化性醛类分解成无毒的酸类，通过加速活化性醛类物质的清除而保护机体。大量研究已证实ALDH2在糖尿病心肌病变、酒精性心肌病、心肌缺血再灌注损伤、心律失常等病理过程中等对心脏起保护作用。

毛蕊异黄酮(Calycosin)是中药黄芪、甘草主要活性成分之一。黄芪、甘草是临床上最常见的益气类中药，目前报道具有心血管保护作用、抗纤维化等作用。目前未见报道其与ALDH2的关系。

发明内容

本发明的目的是提供毛蕊异黄酮在制备ALDH2激动剂的药物中的应用，以解决上述现有技术存在的问题，毛蕊异黄酮可以激活ALDH2的活性，保护心肌细胞，进而可用于防治酒精性心肌病的药物制备中，为临床医学提供新的治疗方向。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供毛蕊异黄酮在制备ALDH2激动剂的药物中的应用。

本发明还提供毛蕊异黄酮在制备防治酒精性心肌病的药物中的应用，所述毛蕊异黄酮提高心肌细胞中ALDH2活性，保护心机细胞，以防治酒精性心肌病。

本发明还提供毛蕊异黄酮在制备抑制乙醇诱导的心肌细胞凋亡药物中的应用。

优选的是，所述毛蕊异黄酮通过提高心肌细胞ALDH2活性，抑制乙醇诱导的心肌细胞凋亡。

优选的是，所述毛蕊异黄酮通过提高心肌细胞ALDH2活性增加活化性醛类，抑制乙醇诱导的心肌细胞凋亡。

本发明公开了以下技术效果：

本发明发现毛蕊异黄酮体外可以激活ALDH2的活性，该效应具有浓度依赖性，而毛蕊异黄酮来源于传统中药黄芪、甘草，具有一定安全性，而且制备成本亦较低，可作为一种有前景的ALDH2激动剂药物。同时，通过试验还验证毛蕊异黄酮能够抑制酒精诱导的心肌细胞凋亡，提高心肌细胞活力，这也为防治酒精性心肌病药物的制备提供了科学依据。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为毛蕊异黄酮抑制乙醇诱导的心肌细胞凋亡图，其中，A：毛蕊异黄酮对心肌细胞活性的影响；B：毛蕊异黄酮抑制乙醇诱导的心肌细胞活力下降；**P＜0.05；

图2为毛蕊异黄酮提高ALDH2的活性图；其中，A：毛蕊异黄酮对心肌细胞内ALDH2表达的影响；B：ALDH2的相对表达量；C：毛蕊异黄酮对心肌细胞内ALDH2活性的影响；D：毛蕊异黄酮在体外酶活性实验中对ALDH2活性的影响；***P＜0.01；

图3为ALDH2与毛蕊异黄酮结合分子动力学模拟结果；其中，A：0ns后表面可视化模型；B：20ns后表面可视化模型；C：重原子均方根偏差(RMSD)变化曲线；

图4为不同浓度的毛蕊异黄酮(10μM、20μM和40μM)对ALDH2的表面等离子共振拟合曲线，表面等离子共振信号以共振单位(RU)表示；

图5为不同浓度毛蕊异黄酮对乙醇诱导的心肌细胞内丙二醛浓度的影响。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。

关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

本发明发现毛蕊异黄酮体外可以激活ALDH2的活性，该效应具有浓度依赖性；基于计算机模拟辅助筛选技术分子对接及分子动力学揭示毛蕊异黄酮在空间上能够稳定的结合ALDH2的活性区域，结合表面等离子共振实验的结果，其可能是一种天然的ALDH2的激动剂。进一步的，发现毛蕊异黄酮作为防治酒精性心肌病药物的应用。

本发明涉及的毛蕊异黄酮的分子式为C₁₆H₁₂O₅，分子量284.26，结构式如下所示：

以下将以具体实施例对上述毛蕊异黄酮具体的功能和应用进一步说明。

实施例1毛蕊异黄酮抑制酒精诱导的心肌细胞活力下降

先采用MTS法探索不同剂量的毛蕊异黄酮对心肌细胞活性的影响，以选择合适的剂量。

调整细胞密度至1.5×10⁵/mL，每孔100μL，每孔设5个复孔。培养24h待细胞贴壁后，更换10％FBS的DMED继续培养24h，观察细胞形态良好。分别加入不同浓度的毛蕊异黄酮(2.5、5、10、20μM)刺激细胞12h。随后去掉培养基，每孔加入100μL含MTS的工作液(0％FBS的DMEM:MTS＝100:20)，MTS工作液注意应避光，现配现用。37℃恒温箱内避光培育2h后，在酶联免疫检测仪490nm波长处测量吸光度值。

细胞活性率＝[OD(药物组)-OD(空白组)]/[OD(对照组)-OD(空白组)]×100％

结果发现：毛蕊异黄酮在10μM以上能显著提高心肌细胞的活力(图1A)。

因此，选择2.5μM、5μM、10μM的有效成分用于后续试验，实验分组如下：

药物组：分别加入2.5μM、5μM、10μM浓度毛蕊异黄酮的10％FBS的DMEM孵育12h后，去掉旧培养基，再加入300μM乙醇的10％FBS的DMEM孵育1h，检测方法同上。

模型组：加入300μM乙醇的10％FBS的DMEM孵育1h，检测方法同上。

结果发现：乙醇显著降低心肌成纤维细胞的细胞活力，与对照组比较差异有统计学意义，不同剂量的毛蕊异黄酮能浓度依赖性地升高乙醇诱导的细胞活力降低，与乙醇组比较差异有统计学意义(图1B)。

实施例2毛蕊异黄酮提高ALDH2的活性。

为了探讨毛蕊异黄酮对ALDH2活性的影响，发明人进行了细胞内及细胞外的活性实验研究。

细胞内实验：用不同浓度的毛蕊异黄酮(2.5μM、5μM、10μM)处理心肌细胞12小时，并设立空白对照组，接着按照说明书使用组织乙醛脱氢酶2活性光度法定量检测试剂盒(GENMED)检测ALDH2的活性和使用Western Blot检测蛋白表达(细胞接种及Western Blot方法同例2)。

Western Blot结果显示(图2A)，各组之间比较差异无统计学意义(P＝0.9567)(图2B)。活性实验结果显示，不同分组之间的ALDH2的活性比较有显著性差异。与空白对照组对比，不同剂量毛蕊异黄酮组ALDH2的活性不同程度地升高，呈剂量依赖性(图2C)。结果说明毛蕊异黄酮可以提高ALDH2的活性，但并不影响ALDH2蛋白的表达。

细胞外实验：首先，按不同浓度的毛蕊异黄酮与重组人ALDH2蛋白在室温下共同孵育1小时，接着按照说明书使用组织乙醛脱氢酶2活性光度法定量检测试剂盒(GENMED)检测ALDH2的活性并绘制活性曲线图。

结果显示毛蕊异黄酮能提高重组人ALDH2蛋白的活性，呈剂量依赖性。毛蕊异黄酮对ALDH2活性的EC₅₀为9.175×10^-5M。结果说明毛蕊异黄酮可以直接提高ALDH2的活性(图2D)。

实施例3分子动力学模拟探索ALDH2_Calycosin的相互作用

为了探索ALDH2_Calycosin的相互作用，我们进行了分子动力学模拟，从网站https://www.rcsb.org/获取ALDH2蛋白结构，从网站https://tcmsp-e.com/获取Calycosin的分子结构，使用YASARA按默认选项对ALDH2和Calycosin进行虚拟对接。

ALDH2_Calycosin复合物在0ns和60ns处的表面可视化模型如图3A、B所示。由结果可见，毛蕊异黄酮稳定地与ALDH2结合，直到MD结束。图3C显示了重原子均方根的演变。ALDH2的RMSD在0ns升值

逐渐升高至20ns的/>

后稳定地在/>

附近波动，配体毛蕊异黄酮的RMSD波动在/>

附近，可见毛蕊异黄酮和ALDH2的结合是稳定的。

实施例4表面等离子共振探索ALDH2_Calycosin的结合作用

表面等离子共振分析表明毛蕊异黄酮可以以浓度依赖的方式快速结合ALDH2，平衡解离常数(KD)值约为1.00×10^-8M。平衡解离常数的结果表明毛蕊异黄酮对ALDH2具有很强的亲和力，提示毛蕊异黄酮能与ALDH2的直接结合(图4)。

实施例5毛蕊异黄酮抑制乙醇诱导的心肌细胞内丙二醛浓度增加

发明人进一步检测毛蕊异黄酮对乙醇诱导的心肌细胞内丙二醛聚集的抑制作用。

调整细胞密度至2×10⁶/mL，取3mL接种于6cm培养皿中。培养24h待细胞贴壁后，更换10％FBS的DMEM继续培养24h，观察细胞形态良好。药物组分别加入不同浓度的毛蕊异黄酮(2.5μM、5μM、10μM)刺激细胞12h，去掉旧培养基，模型组和药物组加入300μM乙醇的10％FBS的DMEM孵育1h后，制备蛋白样品，测定蛋白浓度，按照说明书使用丙二醛(MDA)试剂盒检测各组蛋白样品的细胞浓度。

如图5所示，乙醇能显著提高心肌细胞内MDA浓度，与对照组相比差异具有统计学意义。不同剂量组的毛蕊异黄酮能降低乙醇诱导的MDA浓度增加，与乙醇组比较差异有统计学意义。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (1)

1.毛蕊异黄酮在制备防治酒精性心肌病的药物中的应用，其特征在于，所述毛蕊异黄酮提高心肌细胞中ALDH2活性，降低乙醇诱导的MDA浓度增加，抑制心肌细胞损伤，以防治酒精性心肌病。

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