CN113768938B - 乳香酸在制备促进肠道有益菌增殖的产品中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了乳香酸在制备促进肠道有益菌增殖的产品中的应用，涉及生物技术领域。发明人创造性地发现乳香酸可以针对多种肠道有益菌起到显著的促进作用，可以有效提升人体肠道有益菌含量，可以制备形成用于促进肠道有益菌增殖的产品，同时也可以应用于制药中，用于制备很多由于肠道有益菌减少所导致的疾病的药物。

Description

乳香酸在制备促进肠道有益菌增殖的产品中的应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及乳香酸在制备促进肠道有益菌增殖的产品中的应用。

背景技术

乳香酸成分提取自橄榄科植物卡氏乳香树，具有活血止痛的效果，可以用于心腹诸痛、筋脉拘挛、跌打损伤、疮痈肿痛等；还有外用消肿生肌的作用，然而其对于肠道微生物的调节作用，目前未见相关报道。

人体肠道中存在的数量庞大的微生物，这群微生物依靠人体的肠道生活，同时帮助人体完成多种生理生化功能。肠道微生物不仅在膳食和宿主之间起到了重要的桥梁作用，其本身以及代谢产物也能调节人体健康，因此肠道微生物与人体健康密切相关。肠道微生物通过与宿主之间的动态性生理作用，达到微生态平衡，有效防止肠道内细菌及内毒素易位。当正常的微生物群落受到宿主及外环境影响时，原有的平衡遭到破坏，肠道菌群失调，肠道正常菌群的种类、数量和比例发生异常变化，转变为病理性组合状态，进而导致宿主致病。

目前研究表明，人体的多种疾病都与肠道微生物具有密切关联，多个文献报道Faecalibacterium、Blautia、Parasutterella、Fusicatenibacter属与痛风、肝硬化、克罗恩、便秘、抑郁、二型糖尿病等有关联。若能够通过饮食、药物等方法促进肠道有益菌增殖，则能够一定程度上改善上述疾病，具有增强人体免疫力的效果。

鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供乳香酸在制备促进肠道有益菌增殖的产品中的应用。

本发明的另一目的在于提供一种用于促进肠道有益菌增殖的产品，旨在有效地促进多种肠道有益菌的增殖。

本发明的第三目的在于提供乳香酸在制备用于治疗肠道有益菌所导致的疾病的药物中的应用。

本发明是这样实现的：

第一方面，本发明提供乳香酸在制备促进肠道有益菌增殖的产品中的应用。

在可选的实施方式中，肠道有益菌包括粪杆菌、布劳特氏菌、副萨特氏菌、Fusicatenibacter、粪厌氧棒杆菌和阿里松氏菌属。

在可选的实施方式中，肠道有益菌包括粪杆菌、布劳特氏菌、副萨特氏菌和Fusicatenibacter。

在可选的实施方式中，肠道有益菌包括粪杆菌、副萨特氏菌和Fusicatenibacter。

在可选的实施方式中，肠道有益菌包括粪杆菌和副萨特氏菌。

在可选的实施方式中，肠道有益菌为粪杆菌。

在可选的实施方式中，乳香酸提取自乳香药材，其化学式为：C₃₀H₄₈O₃。

第二方面，本发明提供一种用于促进肠道有益菌增殖的产品，包括乳香酸。

第三方面，本发明提供乳香酸在制备用于治疗肠道有益菌含量下降所导致的疾病的药物中的应用。

在可选的实施方式中，肠道有益菌含量下降所导致的疾病选自痛风、肝硬化、克罗恩、便秘、抑郁症和二型糖尿病中的至少一种。

本发明具有以下有益效果：发明人创造性地发现乳香酸可以针对多种肠道有益菌起到显著的促进作用，可以有效提升人体肠道有益菌含量，可以制备形成用于促进肠道有益菌增殖的产品，同时也可以应用于制药中，用于制备很多由于肠道有益菌减少所导致的疾病的药物。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为将乳香酸应用到促进肠道有益菌增殖中的方法的菌群经乳香酸干预前后的丰度变化示意图；

图2为试验组（乳香酸）和对照组中Faecalibacterium生长曲线。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

发明人创造性地发现，乳香酸可以促进多种肠道有益菌的增殖，并且效果明显。故，本发明实施例提供乳香酸在制备促进肠道有益菌增殖的产品中的应用。

在一些实施例中，肠道有益菌包括粪杆菌（Faecalibacterium）、布劳特氏菌（blautia）、副萨特氏菌（parasutterella）、Fusicatenibacter、粪厌氧棒杆菌（anaerostipes）和阿里松氏菌属（Allisonella）。发明人发现，乳香酸对上述几种菌均有促进增殖的效果，可以用于促进以上几种肠道有益菌形成的菌群的增殖。

在优选的实施例中，肠道有益菌包括粪杆菌、布劳特氏菌、副萨特氏菌和Fusicatenibacter。发明人发现，乳香酸对上述四种均具有明显的促进增殖的效果，要明显好于粪厌氧棒杆菌（anaerostipes）、阿里松氏菌属（Allisonella）。

在更优选的实施例中，肠道有益菌包括粪杆菌、副萨特氏菌和Fusicatenibacter。发明人发现，乳香酸对上述三种菌的促进效果要好于布劳特氏菌，促进增殖的效果更加明显。

在进一步优选的实施例中，肠道有益菌包括粪杆菌和副萨特氏菌，乳香酸对上述两种菌的促进效果比Fusicatenibacter更显著，促进增殖的效果十分明显。

在最佳的实施例中，肠道有益菌为粪杆菌，乳香酸对粪杆菌的促进效果十分显著，要明显优于对布劳特氏菌、副萨特氏菌和Fusicatenibacter等其他菌的效果。

本发明实施例所提出的乳香酸是提取自乳香药材，其化学式为：C₃₀H₄₈O₃；。

本发明提供一种用于促进肠道有益菌增殖的产品，包括乳香酸，还可以包括其他能够促进肠道有益菌增殖的组分，可以是组合物的形式，也可以将乳香酸作为单一的活性成分使用，可以是添加剂，可以是食品或保健品。

多个文献报道Faecalibacterium、Blautia、Parasutterella、Fusicatenibacter属与痛风、肝硬化、克罗恩、便秘、抑郁、二型糖尿病等有关联，如：

Guo, Z., Zhang, J., Wang, Z., Ang, K. Y., Huang, S., Hou, Q., …Zhang, H. (2016). Intestinal Microbiota Distinguish Gout Patients fromHealthy Humans. Scientific Reports, 6(1).这一文献公开了以上肠道有益菌减少会引起痛风。

Fujimoto, T., Imaeda, H., Takahashi, K., Kasumi, E., Bamba, S.,Fujiyama, Y.,&Andoh, A. (2013). Decreased abundanceofFaecalibacteriumprausnitziiin the gut microbiota of Crohn’s disease.Journal of Gastroenterology and Hepatology, 28(4), 613–619.这一文献公开了以上肠道有益菌减少会引起克罗恩。

Zhuang, M., Shang, W., Ma, Q., Strappe, P.,&Zhou, Z. (2019).Abundance of Probiotics and Butyrate‐Production Microbiome ManagesConstipation Via Short‐Chain Fatty Acids Production and Hormones Secretion.Molecular Nutrition&Food Research, 1801187.这一文献公开了以上肠道有益菌减少会引起便秘。

Simpson, C. A., Diaz-Arteche, C., Eliby, D., Schwartz, O. S.,Simmons, J. G.,&Cowan, C. S. M. (2020). The gut microbiota in anxiety anddepression – A systematic review. Clinical Psychology Review, 101943.这一文献公开了以上肠道有益菌减少会引起抑郁。

Xu, J., Liang, R., Zhang, W., Tian, K., Li, J., Chen, X., … Chen, Q.(2019). Faecalibacteriumprausnitzii‐derived Microbial Anti‐inflammatoryMolecule regulates intestinal integrity in diabetes mellitus mice viamodulating tight junction protein expression. Journal of Diabetes.这一文献公开了以上肠道有益菌减少会引起二型糖尿病。

基于乳香酸的能够显著促进Faecalibacterium、Blautia、Parasutterella、Fusicatenibacter增殖的作用，乳香酸可以在制备用于治疗肠道有益菌含量下降所导致的疾病的药物中得到应用，如痛风、肝硬化、克罗恩、便秘、抑郁症、二型糖尿病等。

试验例1

考虑到来源于人体的肠道菌群无法完全在小鼠体内进行定殖，导致菌群丰度测定结果不准确的问题。本试验例在体外进行体内模拟实验，取人体粪便作为肠道菌群样品，观察乳香酸干预对于肠道菌群的作用，具体操作过程如下：

1、粪便样品处理

（1）PBS缓冲液配制

以1000mL为例，用电子分析天平分别称取下列药品，倒入1000mL烧杯中，包括：KH₂PO₄0.24 g，Na₂HPO₄•12H₂O 2.90 g，NaCl 8.00 g，KCl 0.20 g。用量筒量取800mL超纯水倒入烧杯中，放入搅拌转子，并放到磁力加热搅拌器上搅拌至完全溶解，然后用校准后的pH计测量上述溶液的pH，用0.1M的HCl或NaOH调整pH=7.4±0.05。

将上述完全溶解并调节pH后的溶液用玻璃棒引流至1000mL容量瓶中，用少量超纯水冲洗烧杯后倒入容量瓶，重复3次。将容量瓶中的液体用超纯水定容至刻度线，塞上盖子后上下颠倒10次，确保溶液充分混匀。

将定容后的溶液倒入洁净黄色盖子的玻璃瓶，每1000mL的瓶子内放500mL溶液，防止高压灭菌时喷出。将黄色玻璃瓶盖子拧松后，放入高压灭菌锅，灭菌温度为121℃，灭菌时间为15分钟。取出后迅速拧紧盖子，待降至室温后，将溶液需存于4℃冰箱中，可保存6个月。

（2）粪便样品处理

以10g为例，最终浓度为5%。

用百分之一的天平称量出10 g粪便样品，用自动移液枪取适量上述PBS缓冲液加至离心管中，在振荡器上充分混匀。然后将完全混匀的样品平均分装至新50mL离心管中，每管再加适量PBS缓冲液。

混匀后在生物安全柜内进行过滤，把稀释好的样品依次通过20目、50目、100目、200目的滤网。收集滤液至离心管中，将离心管放入离心机，配平，6000G，4℃，离心15min，弃上清。将沉淀称量之后，以终浓度为5%用PBS溶液定容，得到肠道微生物样品。

2、乳香酸干预实验

（1）基础培养基配制

配制用于培养肠道微生物的基础培养基：GAM培养基，以1000mL为例。用电子分析天平称取60 g改良GAM肉汤药品，倒入1000mL烧杯中。用量筒量取800mL超纯水倒入烧杯中，放入搅拌转子，并放到磁力加热搅拌器上搅拌至完全溶解。将上述完全溶解的溶液用玻璃棒引流至1000mL容量瓶，并用少量超纯水冲洗烧杯后倒入容量瓶，重复3次。将容量瓶中的液体用超纯水定容至刻度线，塞上盖子后上下颠倒10次，确保溶液充分混匀。

将定容后的溶液倒入洁净黄色盖子的玻璃瓶，每1000mL的瓶子内放500mL培养基，防止高压灭菌时喷出。将装有培养基的黄色盖子的玻璃瓶，瓶盖拧松，放入脉冲高压灭菌锅，使用液体程序，121℃，15分钟。灭菌完后，立即把瓶盖拧紧，冷却至室温。

（2）乳香酸-GAM培养基配制

于无菌操作台上，用1mL的移液枪取上述GAM培养基分装至玻璃管中，每管2mL。将黑色盖子放在瓶口上微掩。接着用1mL移液器取乳香酸溶液（乳香酸购于西安盛恒生物，纯度65%，用PBS缓冲液溶解至质量百分浓度为：5%），加入上述装有GAM培养基的玻璃管中，每管2mL，作为试验组。同时还设置有空白对照组，每组3个重复，分组具体如下：

试验组：2mL GAM培养基+2mL 乳香酸溶液+1mL PBS缓冲液；

对照组：2mL GAM培养基+3mL PBS缓冲液；

确认好每个玻璃管盖拧紧后，转移至厌氧箱传递箱中，放置之前需用84消毒液消毒处理。放入厌氧箱后，拧松瓶盖，置换氧气，需置换12个小时。

将上述处理后得到的肠道微生物样品分别接种至试验组（乳香酸-GAM培养基）以及空白对照组（GAM培养基-PBS缓冲液）中，每管1mL。于厌氧箱中培养72小时后，观察菌群的生长状况，拍照留存。

接着分别将试验组样品和对照组样品，10000 rpm，3 min离心，弃上清，将沉淀用液氮处理，并送至武汉艾康健生物科技有限公司，利用二代测序法（16S cDNA）分别测定试验组和对照组中的肠道菌群丰度，即不同肠道微生物在检测到的所有菌种中所占的百分比，其中部分肠道菌群的丰度测定结果如表1所示。

表1不同处理组的肠道菌群丰度

若以：（试验组均值-对照组均值）/对照组均值，计算提升效果，则乳香酸对以上四种菌均有提升效果，且Faecalibacterium、Parasutterella、Fusicatenibacter、Blautia的提升效果依次减弱，对Faecalibacterium具有显著提升的效果。

对部分肠道菌群经乳香酸干预前后的丰度变化进行显著性分析。分析结果如图1所示，其中**表示P＜0.01，即丰度变化有极显著差异；*表示P＜0.05，即丰度变化有显著差异。

从表1和图1的测试结果可知：Faecalibacterium、Blautia、Parasutterella、Fusicatenibacter丰度水平有极其明显的升高，达到促进肠道有益菌增值的作用，Anaerostipes、Allisonella也有促进效果，但并不显著，对粪杆菌（Faecalibacterium）效果最为显著。

本试验例通过体外模拟肠道环境，并以健康人体粪便中收集的肠道菌群作为样本，将乳香酸应用到促进肠道有益菌增殖发酵，为临床应用提供科学依据，达到高效制备肠道有益菌剂。

试验例2

为观察乳香酸对于促进栖粪杆菌Faecalibacterium的动态变化，绘制相应的生长曲线，观察经乳香酸干预前后栖粪杆菌Faecalibacterium的生长曲线变化，方法如下：

准备100μl无菌枪头，需在高压灭菌锅内进行115℃、20mins的灭菌。移液枪、无菌96孔板事先用酒精消毒后放入生物安全柜进行30分钟的紫外灭菌。再转移至厌氧箱内进行取样测定OD600值。

培养液充分摇匀再进行取样，每个培养瓶取三次100μl样品的量，分别纵向添加，再横向稀释三至五组连续的梯度，每个培养瓶使用一根无菌枪头。以此类推，待取样完成后，对所有的培养液进行测定。取样过程中准备100μl无菌枪头和移液枪、无菌96孔板紫外灭菌。

使用系统:Tecani-control , 2.0.10.0，设定系统数值如下表2：

表2 系统参数设定值

系统导出的OD600值数据如表3所示。

表3乳香酸对Faecalibacterium的促进作用

根据表3的数据，以培养时间为X轴，测定的OD600值为Y值，分别绘制试验组和对照组的生长曲线，结果如图2所示。

结果显示，试验组（乳香酸）和对照组内的Faecalibacterium在8-24H开始进入对数生长期，24-32H为稳定期，32H后进入衰亡期。对比试验组和对照组的生长曲线可以得出，在乳香酸的培养下，Faecalibacterium生长得更加旺盛，说明乳香酸对Faecalibacterium的生长有促进作用。

综上所述，本发明实施例提供乳香酸在制备促进肠道有益菌增殖的产品中的应用，发明人创造性地发现乳香酸可以针对多种肠道有益菌起到显著的促进作用，可以有效提升人体肠道有益菌含量，可以制备形成用于促进肠道有益菌增殖的产品，同时也可以应用于制药中，用于制备很多由于肠道有益菌减少所导致的疾病的药物。

以上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (2)

1.乳香酸作为唯一的活性成分在制备促进肠道有益菌增殖的产品中的应用；所述肠道有益菌为粪杆菌。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述乳香酸提取自乳香药材，其化学式为：C₃₀H₄₈O₃。

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