CN113755527B - 一种同时表达plaur和gpld1基因的质粒载体及其构建方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种同时表达PLAUR和GPLD1基因的质粒载体及其制备方法。质粒载体构建过程中，先设计一段含有NheⅠ‑AgeⅠ‑SbfⅠ‑EcorⅠ‑NsiⅠ‑MluⅠ‑AvrⅡ‑BamhⅠ酶切位点的DNA，对NheⅠ和BamhⅠ双酶切后回收片段，通过相同的酶切位点将回收片段克隆到双酶切后的pCW‑Cas9‑Blast载体得到新克隆载体pCW‑DNA‑Blast。扩增得到带上述酶切位点的PLAUR和GPLD1基因片段并与pCW‑DNA‑Blast经相同的酶切处理后连接即得。本发明首次通过质粒载体使PLAUR基因与GPLD1基因同时表达，从而在细胞培养上清中获得大量PLUAR蛋白。

Description

一种同时表达PLAUR和GPLD1基因的质粒载体及其构建方法
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种同时表达PLAUR和GPLD1基因的质粒载体及其构建方法。
背景技术
心肌梗塞(AMI)是指急性、持续性缺血、缺氧所引起的心肌缺血性坏死，绝大多数患者可见冠状动脉粥样硬化病变，心肌病变。心肌梗塞的发生是基因和环境因素共同作用的结果。基因和环境因素影响动脉粥样硬化的发生发展，冠状动脉斑块的形态、代谢，斑块不稳定，凝血和纤溶系统的平衡，血栓的形成。
尿激酶型纤溶酶原激活物受体(urokinase-type plasminogen activatorreceptor，uPAR，亦称PLAUR)是一个分子质量为55-60kD的糖蛋白，包含313个氨基酸残基，通过二硫键组成3个同源折叠区域，从N端开始依次被命名为DI、DⅡ、DⅢ。PLAUR不含跨膜序列，其羧基末端(位于DⅢ区域中)连接一个糖基化磷脂酰肌醇(GPI)锚，GPI锚将PLAUR连接于细胞膜的磷脂双分子层表面，其氨基末端(位于DI区域中)则提供尿激酶型纤溶酶原激活物(uPA)的结合位点，可与uPA高亲和力结合。在炎症刺激下，PLAUR在多种蛋白作用下从细胞膜上脱落，形成可溶性尿激酶型纤溶酶原激活物受体(suPAR)。uPAR和uPA已被证明广泛参与多种病理生理过程，包括：蛋白水解、炎症、动脉粥样硬化形成、血管发生、斑块不稳定以及纤溶；这些过程都与心肌梗死、心力衰竭等心血管疾病的发生发展过程密切相关，但具体机制还有待进一步研究。
糖基磷脂酰肌醇特异性磷脂酶D1(glycosylphosphatidylinositol specificphospholipase D1，GPDLD1)是一种大量存在哺乳动物血清中的酶，具有两个功能域，一个N端催化域和一个C端β-螺旋桨域。这种酶的功能之一是水解细胞表面的糖基化磷脂酰肌醇(GPI)锚，从而从细胞膜上释放附着的蛋白质。
发明内容
本发明首次通过质粒载体使PLAUR基因与GPLD1基因同时表达，从而在细胞培养上清中获得大量PLAUR蛋白，为今后研究PLAUR基因在心肌梗塞、心力衰竭等心血管疾病的作用机制提供基础。本发明获得的载体中PLAUR基因表达获得蛋白，然后GPLD1基因表达有利于释放PLAUR蛋白，从而提高培养上清中的PLAUR蛋白含量。
本发明的构建过程：
构建新克隆质粒载体：人工合成一段DNA，该DNA的序列中含有8个不同且按一定顺序分布的限制性内切酶的酶切位点(比如A、B、C、D、E、F、G、H)，然后在位于该DNA序列中两端位置的限制性内切酶的酶切位点，如A、H，用对应的内切酶进行双酶切，得到具有上述8个酶切位点的DNA片段。选择仅在编码区具有1个上述DNA片段第一端位置的酶切位点(比如A)和1个第二端位置的酶切位点(比如H)的质粒载体并用对应的限制性内切酶进行双酶切处理，回收剩余的质粒载体片段，再将DNA片段克隆到酶切后的质粒载体片段中；
优选地，8个限制性内切酶的酶切位点优选NheⅠ、AgeⅠ、SbfⅠ、EcorⅠ、NsiⅠ、MluⅠ、AvrⅡ、BamhⅠ，具有效率高的特点。
进一步地，选择的质粒载体上还具有四环素诱导表达系统。
优选pCW-Cas9-Blast作为载体质粒，该载体中NheⅠ、AgeⅠ、SbfⅠ、EcorⅠ、NsiⅠ、MluⅠ、AvrⅡ、BamhⅠ为单酶切位点，并具有四环素诱导表达系统。
基因片段扩增：从NCBI网站查询PLAUR和GPLD1的编码区，根据编码区序列设计正反向引物，并在PLAUR的正反向引物序列的最前或最后对应引入第一个酶切位点和第二个酶切位点(比如A、B)；在GPLD1的正反向引物序列的最前或最后对应引入第三个酶切位点和第四个酶切位点(比如C、D)；
PLAUR和GPLD1基因以诱导多能干细胞获得的心肌细胞cDNA为模板，分别在扩增引物下进行PCR扩增，得到带上述酶切位点的PLAUR和GPLD1基因片段；
同样地，对Puro基因和EGFP基因各设计两条扩增引物，在Puro的正反向引物序列的最前或最后对应引入第五个酶切位点和第六个酶切位点(比如E、F)，以Addgene提供中的Puro抗性基因的cDNA序列为模板，进行扩增得到带第五酶切位点和第六酶切位点的Puro基因片段；在EGFP的正反向引物序列的最前或最后对应引入第七酶切位点和第八酶切位点(比如G、H)，以Addgene提供中的EGFP绿色荧光蛋白的cDNA序列为模板进行扩增得到带第七酶切位点和第八酶切位点的EGFP基因片段；
用DNA胶回收纯化试剂盒回收扩增得到的带各酶切位点的PLAUR、GPLD1、Puro和EGFP基因片段。
重组质粒载体构建：将上述回收的带各酶切位点的PLAUR、GPLD1、Puro和EGFP基因片段和新克隆载体用对应各酶切位点的限制性内切酶酶切处理，具有相同酶切位点的基因片段和新克隆质粒载体利用T4 DNA ligase连接酶进行连接，连接产物转化至感受态细胞中，培养转化成功的感受态细胞，小量提取质粒，得到含PLAUR、Puro、EGFP和GPLD1基因的重组质粒载体。
本发明的构建方法具有以下优势：
1、对实验环境要求低，常规实验室即可操作；
2、可高通量操作；
3、可重复性高。
4、质粒中带有抗性基因和荧光蛋白基因，若细胞未被病毒感染导入质粒在2～3天即可被药物杀死，EGFP荧光蛋白能通过显微镜观察即可再次确定在抗性下存活的细胞表达目的基因。
附图说明
图1为本发明质粒载体pCW-Cas9-Blast的结构示意图；
图2为重组质粒载体PLAUR-T2A-GPLD1-T2A-Puro-EGFP质粒的结构示意图；
图3为回收后的PLAUR、GPLD1、Puro、EGFP条带；图中：M:DNA Marker；1：PLAUR，2：GPLD1，3：Puro，4：EGFP；
图4为荧光显微镜下显示的对照组(A)和Dox诱导组(B)表达3天后的图，比例尺为100μm；
图5为Dox诱导组和对照组的PLAUR基因在HEK293T中蛋白表达水平图。
具体实施方式
为让本领域的技术人员更加清晰直观的了解本发明，下面将结合附图，对本发明作进一步的说明。
1、构建PLAUR-T2A-GPLD1-T2A-Puro-T2A-EGFP质粒。
2、获得PLAUR-T2A-GPLD1-T2A-Puro-T2A-EGFP慢病毒。
3、转染HEK293T细胞。
4、用盐酸四环素(Dox)诱导HEK293T细胞表达PLUAR和-GPLD1基因。
5、用ELISA试剂盒检测获得培养上清的PLAUR水平。
实施例1：构建PLAUR-T2A-GPLD1-T2A-Puro-T2A-EGFP质粒
商品化的pCW-Cas9-Blast质粒(Addgen，83481)；绿色荧光蛋白(EGFP)的原始质粒购自Addgene；Puro抗性的原始质粒购自Addgene。
所有限制性内切酶、T4连接酶均购自Thermo Fisher Scientific；质粒小量提取纯化试剂盒、DNA凝胶回收与纯化试剂盒均购自Axygen；化学感受态细胞DH5α菌株：购自上海生工生物工程有限公司。
1.1改建pCW-Cas9-Blast载体
选择pCW-Cas9-Blast作为载体的原因是在该载体中NheⅠ、AgeⅠ、SbfⅠ、EcorⅠ、NsiⅠ、MluⅠ、AvrⅡ、BamhⅠ为单酶切位点，并具有四环素诱导表达系统。
人工合成一段DNA，该片段含有限制性内切酶NheⅠ-AgeⅠ-SbfⅠ-EcorⅠ-NsiⅠ-MluⅠ-AvrⅡ-BamhⅠ位点，AgeⅠ和SbfⅠ之间的片段为T2A连接链，EcorⅠ和NsiⅠ之间的片段为T2A连接链，MluⅠ和AvrⅡ之间的片段为T2A连接链，将合成的基因片段用NheⅠ和BamhⅠ双酶切。该人工DNA序列SEQID No.1如下：
GCTAGCaccatggtgagcaagggcgaggagctgttcaccggggtggtgcccatcctggtcgagctggacggcgacgtaaacggccacaagttcagcgtgtccggcgagggcgagggcgatgccacctacggcaagctgaccctgaagttcatctgcacctatacagacatagagatgaaccgacttggaaaggccacccatcatcaccatcaccatggaagcggacagtgtactaattatgctctcttgaaattggctggagatgttgagagcaaccctggacctACCGGTggaagcggagagggcagaggaagtcttctaacatgcggtgacgtggaggagaatcctggcccaaCCTGCAGGaccggcaagctgcccgtgccctggcccaccctcgtgaccaccctgacctacggcgtgcagtgcttcagccgctaccccgaccacatgaagcagcacgacttcttcaagtccgccatgcccgaaggctacgtccaggagcgcaccatcttcggaagcggagctactaacttcagcctgctgaagcaggctggagacgtggaggagaaccctggacctgattacaaggatgacgacgataaggaccacctcGAATTCggcagtggagagggcagaggaagtctgctaacatgcggtgacgtcgaggagaatcctggcccaATGCATaccatgaccatggtgagcaagggcgaggagctgttcaccggggtggtgcccatcctggtcgagctggacggcgacgtaaacggccacaagttcagcgtgtccggcgagggcgagggcgatgccacctacggcaagctgaccctgaagttcatctgcacctatacagacatagagatgaaccgacttggaaaggccacccatcatcaccatcaccatggaagcggacagtgtactaattatgctctcttgaaattggctggagatgttgagagcaaccctggacctACGCGTggcagtggagagggcagaggaagtctgctaacatgcggtgacgtcgaggagaatcctggcccaCCTAGGaccatggtgagcaagggcgaggagctgttcaccggggtggtgcccatcctggtcgagctggacggcgacgtaaacggccacaagttcagcgtgtccggcgagggcgagggcgatgccacctacggcaagctgaccctgaagttcatctgcacctatacagacatagagatgaaccgacttggaaaggccacccatcatcaccatcaccatggaagcggacagtgtactaattatgctctcttgaaattggctggagatgttgagagcaaccctggaccttaaGGATCC。
将质粒载体pCW-Cas9-Blast扩大培养后，提取质粒。用NheⅠ和BamhⅠ双酶切后回收7.4kb片段，通过相同的酶切位点将合成的DNA片段克隆到酶切后的pCW-Cas9-Blast载体，新克隆载体命名为pCW-DNA-Blast。
1.2基因片段克隆扩增
从NCBI网站查询PLAUR和GPLD1的编码区，根据编码区序列设计引物，并引入酶切位点，引物序列如表1所示(其中F表示正向引物，R表示反向引物)。
PLAUR和GPLD1基因以诱导多能干细胞获得的心肌细胞cDNA为模板，利用表1中各基因引物进行PCR扩增，具体如下：
反应体系(50μl)为：2×Hight Fidelity PCR Master Mix 25μl，上下游引物(5μM)各1μl，模板1μl，ddH2O 22μl。
PLAUR基因PCR扩增程序为：95℃ 5min；95℃ 30sec，53℃ 1min，72℃ 1min，循环30次；72℃ 10min。
GPLD1基因PCR扩增程序为：95℃ 5min；95℃ 30sec，53℃ 1min，72℃ 2min30sec，循环30次；72℃ 10min。
以Addgene提供中的Puro抗性基因的cDNA序列为模板，设计两条扩增引物，并引入酶切位点NsiⅠ和MluⅠ，引物序列如表1。
以Addgene提供中的EGFP绿色荧光蛋白的cDNA序列为模板，设计两条扩增引物，并引入酶切位点AvrⅡ和BamhⅠ，引物序列如表1。
反应体系(50μl)为：2×Taq PCR Master Mix 25μl，上下游引物(5μM)各1μl，模板1μl，ddH2O 22μl。
PCR扩增程序为：95℃ 5min；95℃ 30sec，56℃ 30sec，72℃ 45sec，循环30次；72℃ 10min。
表1
Figure BDA0003314523570000061
注：引物序列中大写的字母为引入的酶切位点。
将PCR扩增产物在在1％琼脂糖凝胶中电泳进行结果检测，用DNA胶回收纯化试剂盒回收PLAUR、GPLD1、Puro和EGFP条带，获得1020、2537、606、729bp的片段，与预期大小一致，见图3。
1.3PLAUR-T2A-GPLD1-T2A-Puro-T2A-EGFP构建
将上述回收的基因片段用对应的限制性内切酶酶切处理，再根据相同的酶切位点和新克隆载体pCW-DNA-Blast连接，利用T4 DNA ligase连接酶进行连接，连接产物转化至感受态细胞DH5α菌株中，涂布到氨苄抗性固体培养基平皿，挑取若干单克隆菌落，接种到氨苄抗性液体培养基中，恒温摇床37℃、200rpm振荡培养过夜。小量提取质粒，得到重组质粒载体PLAUR-T2A-GPLD1-T2A-Puro-T2A-EGFP。
1.4重组载体PLAUR-T2A-GPLD1-T2A-Puro-T2A-EGFP的鉴定
通过菌落鉴定鉴定出阳性克隆，引物如表1所示，鉴定体系及反应条件如下：
反应体系(20μl)为：2×Hight Fidelity PCR Master Mix 10μl，上下游引物(5μM)各1μl，模板1μl，ddH2O 7μl。
PLAUR基因PCR扩增程序为：95℃ 5min；95℃ 30sec，53℃ 1min，72℃ 1min，循环30次；72℃ 10min。
GPLD1基因PCR扩增程序为：95℃ 5min；95℃ 30sec，56℃ 1min，72℃ 2min30sec，循环30次；72℃ 10min。
Puro和EGFP基因PCR扩增程序为：95℃ 5min；95℃ 30sec，56℃ 30sec，72℃45sec，循环30次；72℃ 10min。
经菌落鉴定，阳性菌落应有大小为1020、2537、606、729bp的片段。
选取菌落鉴定验证正确的阳性克隆进行测序分析，结果经SnapGene软件比对，以验证重组质粒载体的正确性。分析结果表明，核苷酸序列完全正确，成功获得了重组质粒载体PLAUR-T2A-GPLD1-T2A-Puro-T2A-EGFP。
实施例2：PLAUR-T2A-GPLD1-T2A-Puro-EGFP慢病毒包装
以下实施例中，用到的培养基有：
HEK293T细胞的培养基，具体组成为：10％胎牛血清(购自HyClone，SH30396.03)；1％PS(购自Invitrogen，10378016)；1％的非必须氨基酸NEAA(购自Invitrogen，11140050)；余量为DMEM(购自Invitrogen，11965)。
接种HEK293T细胞到六孔板中，用含10％胎牛血清的DMEM培养液进行培养，待细胞汇合度达到70％-80％时进行转染。
按照Lipofectamine 2000说明书操作将PLAUR-T2A-GPLD1-T2A-Puro-EGFP(20μg)、pVSVG(10ug)、psPAX2(15ug)共转染HEK293T细胞。
6h后，将培养液更换为含10％胎牛血清的DMEM。
继续培养60h后，取培养液于3000rpm，4℃离心10min，去除细胞残渣。
用0.45um低蛋白结合滤膜(Millipore Steriflip HV/PVDF)过滤上清液，去除细胞残渣。
将含病毒的培养液按照体积比4:1与10％蔗糖缓冲液(50mM Tris-HCl，pH7.4，100mM NaCl，0.5mM EDTA)混合，10000g(离心转速)，4℃离心4h。小心弃去上清液，离心管在吸水纸上沥干3min，加入PBS重悬获得浓缩病毒液，-80℃保存。
实施例3：感染HEK293T细胞
接种HEK293T细胞到六孔板中，用含10％胎牛血清的DMEM培养液进行培养，待细胞汇合度达到70％-80％时加入病毒进行感染。感染24h后，将培养液更换成新鲜含10％胎牛血清的DMEM培养液(含终浓度为2ug/ml的盐酸四环素Dox+嘌呤霉素Puro)进行筛选。筛选2-3天后，能够得到约30％的转化效率。再通过流式细胞仪分选获得表达EGFP的细胞株，即得到PLAUR-GPLD1细胞株。
实施例4：Dox诱导表达
将细胞用PBS洗2次后，将培养液更换为不含血清的DMEM培养液，加入终浓度为2μg/ml的盐酸四环素Dox(购自Sigma，货号D9891)培养3天诱导PLAUR、GPLD1、GFP表达，对照组加入等量的DMSO。3天后收集培养上清。
倒置荧光显微镜下观察可见Dox诱导组细胞有绿色荧光(B)，DMSO对照组细胞不发光(A)。见图4。停止加入Dox后细胞不发光。
实施例5：上清中PLAUR水平检测
用0.45um低蛋白结合滤膜(Millipore Steriflip HV/PVDF)过滤收集的上清液，去除细胞残渣。
将过滤收集的上清液稀释500倍，按照人尿激酶型纤溶酶原激活物受体(PLAUR/UPAR)酶联免疫试剂盒(CUSABIO，CSB-E04752h)说明书对PLAUR蛋白浓度进行检测。
用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD值)计算蛋白浓度，数据处理方式为绘制标准曲线，代入样本OD值，计算出样本浓度，最后乘以稀释倍数，即为样本的实际浓度。
结果如图5所示，Dox诱导组中PLAUR的蛋白浓度为5925ng/ml，DMSO对照组浓度为0.8ng/ml，Dox诱导组是DMSO对照组的7406倍。根据以上结果表明，本发明构建出能从培养上清获取大量PLAUR蛋白的PLAUR-GPLD1细胞株。
上述对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和应用本发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于这里的实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，对于本发明做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种同时表达PLAUR和GPLD1基因的质粒载体的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、构建新克隆质粒载体
人工合成一段DNA，该DNA的序列中含有8个不同且按一定顺序分布的限制性内切酶的酶切位点，然后在位于该DNA序列中两端位置的限制性内切酶的酶切位点用对应的内切酶进行双酶切，得到具有上述8个酶切位点的DNA片段；选择仅在编码区具有1个上述DNA片段第一端位置的酶切位点和1个第二端位置的酶切位点的质粒载体并用对应的限制性内切酶进行双酶切处理，回收剩余的质粒载体片段，再通过相同的酶切位点将DNA片段克隆到酶切后的质粒载体片段中；
S2、基因片段扩增
根据PLAUR和GPLD1的编码区序列设计正反向引物，并在PLAUR的正反向引物序列的最前或最后对应引入第一个酶切位点和第二个酶切位点；在GPLD1的正反向引物序列的最前或最后对应引入第三个酶切位点和第四个酶切位点；扩增PLAUR和GPLD1基因得到带上述酶切位点的PLAUR和GPLD1基因片段；
同样地，对Puro基因和EGFP基因各设计两条扩增引物，在Puro的正反向引物序列的最前或最后对应引入第五个酶切位点和第六个酶切位点，进行扩增得到带第五酶切位点和第六酶切位点的Puro基因片段；在EGFP的正反向引物序列的最前或最后对应引入第七酶切位点和第八酶切位点，进行扩增得到带第七酶切位点和第八酶切位点的EGFP基因片段；
用DNA胶回收纯化试剂盒回收扩增得到的带各酶切位点的PLAUR、GPLD1、Puro和EGFP基因片段；
S3、重组质粒载体构建
将上述回收的带各酶切位点的PLAUR、GPLD1、Puro和EGFP基因片段和新克隆载体都用对应各酶切位点的限制性内切酶酶切处理，具有相同酶切位点的基因片段和新克隆质粒载体利用DNA连接酶进行连接，连接产物转化至感受态细胞中，培养转化成功的感受态细胞，小量提取质粒，得到含PLAUR、Puro、EGFP和GPLD1基因的重组质粒载体。
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，8个限制性内切酶的酶切位点为NheⅠ、AgeⅠ、SbfⅠ、EcorⅠ、NsiⅠ、MluⅠ、AvrⅡ、BamhⅠ。
3.根据权利要求1或2所述的构建方法，其特征在于，选择的质粒载体上还具有四环素诱导表达系统。
4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于：质粒载体选择pCW-Cas9-Blast作为载体质粒。
5.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，PLAUR的扩增引物序列如下：
F：tataGCTAGCaccatgggtcacccg；
R：taACCGGTggtccagaggagagtg。
6.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，GPLD1的扩增引物序列如下：
F：tataCCTGCAGGaccatgtctgctttc；
R：ttGAATTCatctgagccaaggctatagacg。
7.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，Puro的扩增引物序列如下：
F：ttACGCGTggcaccgggcttg；
R：ttGAATTCaccatgaccgagtacaag。
8.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，EGFP的扩增引物序列如下：
F：ttCCTAGGgtgagcaagggcga；
R：ttGGATCCttacttgtacagctcgtccat。
9.根据权利要求1-8任一项所述的构建方法构建得到的质粒载体。
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