CN113754712A - 一种高纯度橄榄苦苷的分离制备方法 - Google Patents

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邸多隆
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Abstract

本发明公开了一种高纯度橄榄苦苷的分离制备方法，将油橄榄叶经水加热回流提取得到橄榄苦苷粗提物；将橄榄苦苷粗提物利用大孔吸附树脂进行分离富集得到橄榄苦苷洗脱物；将橄榄苦苷洗脱物利用高速逆流色谱分离技术进行分离纯化得到橄榄苦苷粗制品；将橄榄苦苷粗制品利用制备型液相色谱进行分离纯化得到橄榄苦苷精制品；橄榄苦苷精制品冷冻干燥后获得高纯度橄榄苦苷。本发明分离提取的橄榄苦苷纯度高，纯度＞98.5％，能够作为橄榄苦苷的标准样品。

Description

一种高纯度橄榄苦苷的分离制备方法
技术领域
本发明涉及一种高纯度橄榄苦苷的分离制备方法，属于药效成分提取技术领域。
背景技术
油橄榄(Olea europaea L.)为木犀科木犀榄属(Olea)常绿乔木，主要分布在地中海沿岸国家。油橄榄叶在欧美国家有较长的种植和食用历史，干燥叶茶、粉末或提取物常口服用于降血压、降血糖、抗炎和抗氧化。油橄榄的主要药效成分为橄榄苦苷(oleuropein)，橄榄苦苷在油橄榄叶中含量最高，可达4％-12％。
橄榄苦苷(Oleuropein)，CAS：32619-42-4、分子式：C25H32O13、分子量： 540.51、化学命名：2H-Pyran-4-acetic acid,3-ethylidene-2-(β-D-glucopyranosyloxy) -3,4-dihydro-5-(methoxycarbonyl)-,2-(3,4-dihydroxyphenyl)ethyl ester,(2S,3E,4S)、性状：白色粉末、熔点：96-98℃、比旋光度：[α]20＝-190.764°(C＝0.025,MeOH)、溶解性：易溶于水、甲醇、乙醇，可溶于丙酮、乙酸乙酯，不溶于石油醚、乙醚、氯仿等。化学结构式为：
Figure 1
药理学研究表明，橄榄苦苷具有降血压、降血脂、降血糖、抗炎、抗氧化、抗肿瘤和治疗老年痴呆等作用。目前，在欧美国家已有多种以油橄榄叶提取物为原料的产品上市。然而，目前国内市场缺乏规范统一的橄榄苦苷标准样品，相关产品质量良莠不齐，橄榄苦苷的纯度比较差。因此，亟待一种能够分离出高纯度橄榄苦苷的方法，提供高纯度的橄榄苦苷从而作为橄榄苦苷的标准样品，进而规范油橄榄叶提取物及相关产品的品质，保证以此为原料的功能食品、保健食品和化妆品的质量。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术中存在的不足，而提供一种高纯度橄榄苦苷的分离制备方法，本发明分离提取的橄榄苦苷纯度高，纯度＞98.5％，能够作为橄榄苦苷的标准样品。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种高纯度橄榄苦苷的分离制备方法，包括以下步骤：
(1)将油橄榄叶经水加热回流提取得到橄榄苦苷粗提物；
(2)将橄榄苦苷粗提物利用大孔吸附树脂进行分离富集得到橄榄苦苷洗脱物；
(3)将橄榄苦苷洗脱物利用高速逆流色谱分离技术进行分离纯化得到橄榄苦苷粗制品；
(4)将橄榄苦苷粗制品利用制备型液相色谱进行分离纯化得到橄榄苦苷精制品；橄榄苦苷精制品冷冻干燥后获得高纯度橄榄苦苷。
上述技术方案中，步骤(1)中，所述的油橄榄叶，为油橄榄(Olea europaea L.)的干燥叶，粉碎后过10目得到橄榄叶粗粉，橄榄叶粗粉加水进行回流提取。
上述技术方案中，步骤(1)中，所述的橄榄叶粗粉与水的重量比为1：4-7。
上述技术方案中，步骤(1)中，所述的加热回流提取，指的是加热至50-60℃回流提取4-9h得到橄榄苦苷粗提物(得率为34-40％，提取率为80-90％)，橄榄苦苷粗提物中橄榄苦苷的含量为10-15％。
上述技术方案中，步骤(2)中，所述的将橄榄苦苷粗提物利用大孔吸附树脂进行分离富集，指的是，将橄榄苦苷粗提物上大孔吸附树脂柱吸附，吸附结束后依次用不同的洗脱液进行洗脱，收集洗脱后得到的液体(得率为70-80％) 经旋转蒸发去除溶剂、冷冻干燥后得到橄榄苦苷洗脱物，橄榄苦苷洗脱物中橄榄苦苷的含量为33-42％。
上述技术方案中，步骤(2)中，所述的依次用不同的洗脱液进行洗脱，指的是依次水、50％乙醇和95％乙醇进行洗脱，收集50％乙醇洗脱后得到的液体经旋转蒸发去除溶剂、冷冻干燥后得到橄榄苦苷洗脱物。
上述技术方案中，步骤(2)中，所述的大孔吸附树脂为AB-8、LSA-8、 SPD-700、LSA-10、D101中的任意一种。
上述技术方案中，步骤(2)中，利用大孔吸附树脂进行分离富集时的操作条件为：以橄榄苦苷粗提物与大孔吸附树脂的质量比为1：50上柱，上柱流速为1ml/min，洗脱液的上柱流速为1ml/min，洗脱液用量为1-3BV。
上述技术方案中，步骤(2)中，所述的旋转蒸发去除溶剂，操作条件为：真空度为-0.9—-0.1mpa、温度为50-60℃，蒸发过程配设有冷却水循环系统，冷凝水的温度为-10℃以下、优选为-20—-10℃，蒸发至产物中无乙醇味结束；所述的冷冻干燥，操作条件为：真空度为2-8mp、温度-25—-10℃、时间5-10min。
上述技术方案中，步骤(3)中，将橄榄苦苷洗脱物利用高速逆流色谱分离技术进行分离纯化，操作条件为：溶剂系统为正丁醇、乙酸乙酯、甲醇、水、氯仿以1：17：1：21：0.3重量比混合后的混合物，溶剂系统静置分层后分别取上相和下相各20ml且分别加入橄榄苦苷洗脱物30mg，上相作为固定相、下相作为流动相，在转速950r/min、流动相体积流量1.5m L/min、进样浓度20mg/m L条件下进行分离，分离时间为200-280min，分离得到的产物经旋转蒸发去除溶剂后得到橄榄苦苷粗制品(得率为68-75％)，橄榄苦苷粗制品中橄榄苦苷的含量为93-97％。
上述技术方案中，步骤(3)中，所述的旋转蒸发去除溶剂，操作条件为：真空度为-0.9—-0.1mpa、温度为50-60℃，蒸发过程配设有冷却水循环系统，冷凝水的温度为-10℃以下、优选为-20—-10℃，蒸发至产物中无乙醇味结束。
上述技术方案中，步骤(4)中，将橄榄苦苷粗制品利用制备型液相色谱进行分离纯化，采用的色谱柱为C18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)，流动相为体积比为75:25的水：乙腈，流速为1ml/min，柱温为30℃，检测波长232nm，进样体积为5ml，运行25min筹集产物(得率为65-70％)经旋转蒸发去除溶剂、冷冻干燥得到纯度＞98.5％的橄榄苦苷样品。
上述技术方案中，步骤(4)中，所述的旋转蒸发去除溶剂，操作条件为：真空度为-0.9—-0.1mpa、温度为50-60℃，蒸发过程配设有冷却水循环系统，冷凝水的温度为-10℃以下、优选为-20—-10℃，取蒸发得到的部分溶剂加入酸性重铬酸钾溶液，如果变成灰绿色则说明没有蒸完，如果不变色则证明蒸发完毕；所述的冷冻干燥，操作条件为：真空度为2-8mp、温度-25—-10℃、时间5-10min。
本发明分离提取的橄榄苦苷纯度高，纯度＞98.5％，能够作为橄榄苦苷的标准样品使用，进而规范油橄榄叶提取物及相关产品的品质，保证以此为原料的功能食品、保健食品和化妆品的质量。
附图说明
图1-1为系统I检测实施例1得到的橄榄苦苷的薄层色谱图；
图1-2为系统II检测实施例1得到的橄榄苦苷的薄层色谱图；
图1-3为系统III检测实施例1得到的橄榄苦苷的薄层色谱图；
图2-1为流动相水:乙腈:甲醇＝75:20:5时检测实施例1得到的橄榄苦苷的 HPLC图谱；
图2-2为流动相水:乙腈＝75:25时检测实施例1得到的橄榄苦苷HPLC图谱；
图2-3为流动相水:乙腈＝75:25时的空白谱图；
图3-1为检测波长为232nm时检测实施例1得到的橄榄苦苷放大色谱图；
图3-2为检测波长为254nm时检测实施例1得到的橄榄苦苷放大色谱图；
图3-3为检测波长为280nm时检测实施例1得到的橄榄苦苷放大色谱图；
图4-1为Hypersil ODS2 C18色谱柱(4.6mm×250mm,5μm)检测实施例1 得到的橄榄苦苷的HPLC图谱；
图4-2为SinoChrom ODS-BP C18色谱柱(4.6mm×250mm,5μm)检测实施例1得到的橄榄苦苷的HPLC图谱；
图4-3为SinoChrom ODS-AP C18色谱柱(4.6mm×250mm,5μm)检测实施例1得到的橄榄苦苷的HPLC图谱；
图5为HPLC-MS检测实施例1得到的橄榄苦苷正离子模式下总离子流图；
图6-1为实施例1得到的橄榄苦苷的TG曲线(N2气氛)；
图6-2为实施例1得到的橄榄苦苷的TG曲线(O2气氛)；
图7-1为实施例1得到的橄榄苦苷的紫外光谱图；
图7-2为实施例1得到的橄榄苦苷的红外光谱图；
图7-3为实施例1得到的橄榄苦苷的高分辨质谱图。
具体实施方式
以下对本发明技术方案的具体实施方式详细描述，但本发明并不限于以下描述内容：
下面结合具体的实施例，对本发明进行阐述：
实施例1：一种高纯度橄榄苦苷的分离制备方法
包括以下步骤：
(1)以油橄榄(Olea europaea L.)的干燥叶作为原料，粉碎后过10目筛得到橄榄叶粗粉，向橄榄叶粗粉中加5倍重量的水，加热至55℃左右回流提取6h 得到橄榄苦苷粗提物(得率为37％，提取率为85％)，橄榄苦苷粗提物中橄榄苦苷的含量为12％。
(2)将步骤(1)得到的橄榄苦苷粗提物上D101大孔吸附树脂进行吸附，以橄榄苦苷粗提物与大孔吸附树脂的质量比为1：50上柱，上柱流速为1ml/min，洗脱液的上柱流速为1ml/min，洗脱液用量为2BV；吸附结束后依次用水、50％乙醇和95％乙醇进行洗脱，收集50％乙醇洗脱后得到的液体(得率为75％)经旋转蒸发去除溶剂、冷冻干燥后得到橄榄苦苷洗脱物(橄榄苦苷的含量为37％)。
旋转蒸发去除溶剂的操作条件为：真空度为-0.1mpa、温度为55℃，蒸发过程配设有冷却水循环系统，冷凝水的温度为-15℃，蒸发至产物中无乙醇味结束；冷冻干燥的操作条件为：真空度为4mp、温度-15℃、时间8min。
(3)将橄榄苦苷洗脱物利用高速逆流色谱分离技术进行分离纯化得到橄榄苦苷粗制品，操作条件为：溶剂系统为正丁醇、乙酸乙酯、甲醇、水、氯仿以1： 17：1：21：0.3重量比混合后的混合物，溶剂系统静置分层后分别取上相和下相各20ml且分别加入橄榄苦苷洗脱物30mg，上相作为固定相、下相作为流动相，在转速950r/min、流动相体积流量1.5m L/min、进样浓度20mg/m L条件下进行分离，分离时间为250min，分离得到的产物经旋转蒸发去除溶剂后得到橄榄苦苷粗制品(得率为72％)，橄榄苦苷粗制品中橄榄苦苷的含量为95％。
旋转蒸发去除溶剂，操作条件为：真空度为-0.9mpa、温度为50℃，蒸发过程配设有冷却水循环系统，冷凝水的温度为-12℃，蒸发至产物中无乙醇味结束。
(4)将橄榄苦苷粗制品利用制备型液相色谱进行分离纯化得到橄榄苦苷精制品：采用的色谱柱为C18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)，流动相为体积比为75:25的水：乙腈，流速为1ml/min，柱温为30℃，检测波长232nm，进样体积为5ml，运行25min筹集产物(得率为68％)经旋转蒸发去除溶剂、冷冻干燥得到纯度＞98.5％的高纯度橄榄苦苷；
旋转蒸发去除溶剂的操作条件为：真空度为-0.1mpa、温度为58℃，蒸发过程配设有冷却水循环系统，冷凝水的温度为-10℃，取蒸发得到的部分溶剂加入酸性重铬酸钾溶液，如果变成灰绿色则说明没有蒸完，如果不变色则证明蒸发完毕；冷冻干燥的操作条件为：真空度为7mp、温度-10℃、时间7min。
验证试验一：利用3种不同的展开剂对实施例1得到的高纯度橄榄苦苷进行薄层色谱检测
采用3种展开体系对实施例1得到的高纯度橄榄苦苷进行检测，薄层板硅胶 254G板，设计五个点样量分别为20μg(点1)、40μg(点2)、60μg(点3)、 80μg(点4)、100μg(点5)。
1、展开系统：
1.1、系统I
薄层板：烟台江友硅胶开发有限公司HPTLC预制板
展开剂：二氯甲烷:甲醇:醋酸(8.5:1.5:0.1，v/v/v)
显色剂：I2
显色方法：碘蒸汽熏蒸
Rf值：0.42
结论：各量下均未见杂质斑点出现，见图1-1。
1.2系统II
薄层板：烟台江友硅胶开发有限公司HPTLC预制板
展开剂：二氯甲烷:丙酮:甲醇:醋酸(8:2:1.2:0.1，v/v/v/v)
显色剂：I2
显色方法：碘蒸汽熏蒸
Rf值：0.31
结论：各量下均未见杂质斑点出现，见图1-2。
1.3系统III
薄层板：烟台江友硅胶开发有限公司HPTLC预制板
展开剂：二氯甲烷:乙酸乙酯:甲醇:醋酸(8:2:1.5:0.1，v/v/v/v)
显色剂：I2
显色方法：碘蒸汽熏蒸
Rf值：0.32
结论：各量下均未见杂质斑点出现，见图1-3。
2、结论
利用3种不同的展开剂进行薄层色谱检测，结果显示，橄榄苦苷样品在20～ 100μg的点样量范围内，仅见明显的一个显色斑点，未见杂质的斑点，说明该样品的纯度较高。
验证试验二：利用HPLC分析实施例1得到的高纯度橄榄苦苷的纯度
1、不同洗脱条件下纯度分析
1.1洗脱条件一
分析条件：色谱柱：Hypersil ODS2 C18色谱柱(4.6mm×250mm,5μm)；流动相：水:乙腈:甲醇(75:20:5,v/v/v)；流速：1mL/min；柱温：30℃；检测时间：25min；检测波长：232nm。扣除溶剂色谱峰后，对样品色谱峰进行面积归一化法定量，经积分，橄榄苦苷纯度为98.99％。HPLC测定图如图2-1所示。
1.2洗脱条件二
分析条件：色谱柱：Hypersil ODS2 C18色谱柱(4.6mm×250mm,5μm)；流动相：水:乙腈(75:25,v/v)；流速：1mL/min；柱温：30℃；检测时间：25min；检测波长：232nm。扣除溶剂色谱峰后，对样品色谱峰进行面积归一化法定量，经积分，橄榄苦苷纯度为99.03％。选定洗脱条件二对橄榄苦苷标准样品进行后续的均匀性、稳定性和定值试验。橄榄苦苷HPLC图谱如图2-2所示，空白图谱如图2-3所示。
2、不同检测波长下纯度分析
分析条件：色谱柱：Hypersil ODS2 C18色谱柱(4.6mm×250mm,5μm)；流动相：水:乙腈(75:25,v/v)；流速：1mL/min；柱温：30℃；检测时间：25min；检测波长：200-400nm。除溶剂峰外，其他波长下无其他杂质峰出现。将232nm、 254nm、280nm三个波长条件下的色谱图放大，纯度和放大色谱图见下表：
表1不同检测波长结果
检测波长(nm) 纯度值(％) 放大色谱图
232 99.03 图3-1
254 98.95 图3-2
280 99.46 图3-3
3、不同色谱柱条件下纯度分析
采用三根不同的C18色谱柱，在相同的洗脱条件下测定橄榄苦苷标准样品的纯度。
3.1Hypersil ODS2 C18色谱柱(4.6mm×250mm,5μm)
流动相：水:乙腈(75:25,v/v)；流速：1mL/min；柱温：30℃；检测时间： 25min；检测波长：232nm。扣除溶剂色谱峰后，对样品色谱峰进行面积归一化法定量，经积分，橄榄苦苷纯度为99.03％。HPLC图谱如图4-1所示。
3.2SinoChrom ODS-BP C18色谱柱(4.6mm×250mm,5μm)
流动相：水:乙腈(75:25,v/v)；流速：1mL/min；柱温：30℃；检测时间： 25min；检测波长：232nm。扣除溶剂色谱峰后，对样品色谱峰进行面积归一化法定量，经积分，橄榄苦苷纯度为99.58％。HPLC图谱如图4-2所示。
3.3SinoChrom ODS-AP C18色谱柱(4.6mm×250mm,5μm)
流动相：水:乙腈(75:25,v/v)；流速：1mL/min；柱温：30℃；检测时间： 25min；检测波长：232nm。扣除溶剂色谱峰后，对样品色谱峰进行面积归一化法定量，经积分，橄榄苦苷纯度为98.98％。HPLC图谱如图4-3所示。
4结论
不同洗脱条件、不同检测波长及不同色谱柱条件下，分别对样品色谱峰进行面积归一化法定量，经积分，橄榄苦苷样品纯度均大于98.5％。
验证试验三：利用HPLC-MS分析实施例1得到的高纯度橄榄苦苷
分析条件：色谱柱：SinoChrom ODS-BP C18色谱柱(4.6mm×250mm,5μm)；流动相：0-30min水:乙腈＝75:25；流速：1.0mL/min；柱温：30℃；运行时间：30min。MS条件如下：GasTemp：225℃；Drying Gas：5L/min；Nebulizer：20 psig；Sheath Gas Temp：400℃；SheathGas Flow：12L/min；Scan：150to 2000 m/z。正离子总离子流图中未发现明显杂质峰存在。橄榄苦苷正离子模式下总离子流图如图5所示。
验证试验四：对实施例1得到的高纯度橄榄苦苷进行热重分析
在N2气氛条件下可以看出温度在25～105℃范围内，TG曲线是一条水平线 (图6-1)，表明样品中无吸附水和结晶水，热稳定性好。当温度超过130℃时，样品开始分解。在O2气氛条件下可以看出样品在加热到温度900℃时(图6-2)，重量损失在100.17～100.46％之间(平行分析3次)，表明样品中无明显无机杂质。
验证试验五：对实施例1得到的高纯度橄榄苦苷进行结构确认
实施例1得到的高纯度橄榄苦苷的紫外光谱图如图7-1所示，橄榄苦苷 UV(MeOH)λmax(logε)＝232(4.25)，符合橄榄苦苷紫外吸收的特征。
实施例1得到的高纯度橄榄苦苷的红外光谱图如图7-2所示：3441cm-1：-OH 伸缩振动；2951cm-1,2913cm-1：-CH2，-CH3伸缩振动；1704cm-1：多共轭不饱和酮的羰基的伸缩振动；1632cm-1：多共轭不饱和酮的双键的伸缩振动；1202 cm-1：O＝C-O的伸缩振动；1075cm-1：烷基醚的伸缩振动；920cm-1,856cm-1,815 cm-1,770cm-1：三取代苯环的伸缩振动。该化合物存在-CH3，-CH2-，-OH，不饱和酮，三取代烯烃等基团，具有裂环烯醚的结构，与橄榄苦苷的结构完全相符。
实施例1得到的高纯度橄榄苦苷的高分辨质谱图如图7-3所示：橄榄苦苷加钠离子[C25H32O13+Na]+的理论精确质量数563.1741，高分辨质谱测得的橄榄苦苷加钠离子精确质量数为563.1725，两者数据完全一致，符合高分辨质谱的基本要求。
上述实例只是为说明本发明的技术构思以及技术特点，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明的实质所做的等效变换或修饰，都应该涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种高纯度橄榄苦苷的分离制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将油橄榄叶经水加热回流提取得到橄榄苦苷粗提物；
(2)将橄榄苦苷粗提物利用大孔吸附树脂进行分离富集得到橄榄苦苷洗脱物；
(3)将橄榄苦苷洗脱物利用高速逆流色谱分离技术进行分离纯化得到橄榄苦苷粗制品；
(4)将橄榄苦苷粗制品利用制备型液相色谱进行分离纯化得到橄榄苦苷精制品；橄榄苦苷精制品冷冻干燥后获得高纯度橄榄苦苷。
2.根据权利要求1所述的分离制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的油橄榄叶，为油橄榄(Olea europaea L.)的干燥叶，粉碎后过10目筛得到橄榄叶粗粉，橄榄叶粗粉加水进行回流提取，橄榄叶粗粉与水的重量比为1：4-7；所述的加热回流提取，指的是加热至50-60℃回流提取4-9h得到橄榄苦苷粗提物。
3.根据权利要求1所述的分离制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述的将橄榄苦苷粗提物利用大孔吸附树脂进行分离富集，指的是，将橄榄苦苷粗提物上大孔吸附树脂柱吸附，吸附结束后依次用不同的洗脱液进行洗脱，收集洗脱后得到的液体经旋转蒸发去除溶剂、冷冻干燥后得到橄榄苦苷洗脱物。
4.根据权利要求3所述的分离制备方法，其特征在于，所述的依次用不同的洗脱液进行洗脱，指的是依次水、50％乙醇和95％乙醇进行洗脱，收集50％乙醇洗脱后得到的液体经旋转蒸发去除溶剂、冷冻干燥后得到橄榄苦苷洗脱物。
5.根据权利要求3所述的分离制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述的大孔吸附树脂为AB-8、LSA-8、SPD-700、LSA-10、D101中的任意一种；利用大孔吸附树脂进行分离富集时的操作条件为：以橄榄苦苷粗提物与大孔吸附树脂的质量比为1：50上柱，上柱流速为1ml/min，洗脱液的上柱流速为1ml/min，洗脱液用量为1-3BV。
6.根据权利要求3所述的分离制备方法，其特征在于，所述的旋转蒸发去除溶剂，操作条件为：真空度为-0.9—-0.1mpa、温度为50-60℃，蒸发过程配设有冷却水循环系统，冷凝水的温度为-10℃以下，蒸发至产物中无乙醇味结束；所述的冷冻干燥，操作条件为：真空度为2-8mp、温度-25—-10℃、时间5-10min。
7.根据权利要求1所述的分离制备方法，其特征在于，步骤(3)中，将橄榄苦苷洗脱物利用高速逆流色谱分离技术进行分离纯化，操作条件为：溶剂系统为正丁醇、乙酸乙酯、甲醇、水、氯仿以1：17：1：21：0.3重量比混合后的混合物，溶剂系统静置分层后分别取上相和下相各20ml且分别加入橄榄苦苷洗脱物30mg，上相作为固定相、下相作为流动相，在转速950r/min、流动相体积流量1.5m L/min、进样浓度20mg/m L条件下进行分离，分离时间为200-280min，分离得到的产物经旋转蒸发去除溶剂后得到橄榄苦苷粗制品。
8.根据权利要求7所述的分离制备方法，其特征在于，所述的旋转蒸发去除溶剂，操作条件为：真空度为-0.9—-0.1mpa、温度为50-60℃，蒸发过程配设有冷却水循环系统，冷凝水的温度为-10℃以下，蒸发至产物中无乙醇味结束。
9.根据权利要求1所述的分离制备方法，其特征在于，步骤(4)中，将橄榄苦苷粗制品利用制备型液相色谱进行分离纯化，采用的色谱柱为C18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)，流动相为体积比为75:25的水：乙腈，流速为1ml/min，柱温为30℃，检测波长232nm，进样体积为5ml，运行25min筹集产物经旋转蒸发去除溶剂、冷冻干燥得到高纯度橄榄苦苷。
10.根据权利要求9所述的分离制备方法，其特征在于，所述的旋转蒸发去除溶剂，操作条件为：真空度为-0.9—-0.1mpa、温度为50-60℃，蒸发过程配设有冷却水循环系统，冷凝水的温度为-10℃以下，取蒸发得到的部分溶剂加入酸性重铬酸钾溶液，如果变成灰绿色则说明没有蒸完，如果不变色则证明蒸发完毕；所述的冷冻干燥，操作条件为：真空度为2-8mp、温度-25—-10℃、时间5-10min。
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