CN113754624A - 一种艳山姜中的化合物及其提取分离纯化方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种艳山姜中的化合物及其提取分离纯化方法和应用，所述化合物分别为：二氢‑5,6‑去氢醉椒素、5,6‑去氢醉椒素、Anibadimer A、6,6′‑(2,4‑二苯基环丁烷‑1,3‑二基)双(4‑甲氧基‑2H‑吡喃‑2‑酮)，本发明化合物药效学实验研究结果表明，艳山姜中4个化合物对对高糖损伤HUVECs均具有较为明显的修复保护作用，解决了既降糖又可修复血管的问题，可开发成为预防心血管疾病的传统降糖药物的联合药。

Description

一种艳山姜中的化合物及其提取分离纯化方法和应用
技术领域
本发明涉及药学领域，具体涉及一种艳山姜中的化合物及其提取分离纯化方法和应用。
背景技术
艳山姜，中药名。为姜科植物艳山姜Alpiniazerumbet(Pers.)Burtt.etSmith的根茎和果实。分布于我国东南部至西南部各地。具有温中燥湿，行气止痛，截疟之功效。常用于心腹冷痛，胸腹胀满，痰食积滞，消化不良，呕吐腹泻。
人的血糖都有一个正常的范围，如果经常超过这个范围就会面临着血糖高的问题，可能会给我们的身体带来不适，血糖升高，尿糖增多，可引发渗透性利尿，从而引起多尿的症状；血糖升高、大量水分丢失，血渗透压也会相应升高，高血渗可刺激下丘脑的口渴中枢，从而引起口渴、多饮的症状；由于胰岛素相对或绝对的缺乏，导致体内葡萄糖不能被利用，蛋白质和脂肪消耗增多，从而引起乏力、体重减轻；近年来，因高血糖引起的糖尿病、心血管疾病、肾病、白内障、脑血栓等疾病越来越常见，但治疗效果却并不乐观。
现目前，对于高血糖引起疾病，多数治疗方法采用单纯的西医西药治疗高血糖，往往会出现心血管疾病而带来严重后果，某些不适用症状还需禁用或慎用此类西药，如心衰或缺血性心脏病等情况；传统降糖药物会存在一些不良反应，且未能解决既降糖又可修复血管等问题。
针对以上问题，本发明团队根据药用植物化学分类学的原理，通过研究表明，验证了中药艳山姜该中含有四元环类或卡瓦内酯类化合物，其中化合物药效学实验表明化合物对对高糖损伤HUVECs均具有较为明显的修复保护作用，解决了既降糖又可修复血管的问题，可开发成为预防心血管疾病的传统降糖药物的联合药，为后续可以继续加强对该种植物的化学成分和活性筛选研究以及对该种植物中具有较好活性的化合物进行结构修饰方面的研究，期待发现更多的具有较好生物活性的单体化合物，以提供更好的降糖类药。
发明内容
本发明的目的是提供艳山姜中的化合物。
本发明的另一目的是提供一种艳山姜中的化合物提取分离纯化方法。
本发明的另一目的是提供一种艳山姜中的化合物应用。
本发明所述化合物结构式如下：
1)二氢-5,6-去氢醉椒素的结构式：
Figure BDA0003289509830000011
2)5,6-去氢醉椒素的结构式：
Figure BDA0003289509830000012
3)AnibadimerA的结构式：
Figure BDA0003289509830000021
4)6,6′-(2,4-二苯基环丁烷-1,3-二基)双(4-甲氧基-2H-吡喃-2-酮)的结构式：
Figure BDA0003289509830000022
所述化合物在制备降糖药物及预防心血管疾病药物方面的应用。
所述化合物在制备治疗糖尿病、修复高糖损伤血管内皮疾病药物中的应用。
本发明所述药物可以加入药学上可接受的辅料制成药学上可接受的固体制剂或液体制剂。
本发明所述固体制剂为片剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂、散剂、冻干粉针剂；
本发明所述液体制剂为注射制剂、口服液。
本发明所述化合物提取分离纯化方法包括以下步骤：
1)提取：①取艳山姜干燥果实，粉碎成粗颗粒，再称取25kg置于提取罐中，室温下用70～80％乙醇浸渍5～10天，重复两次；②合并浸渍液，用纱布滤过，得到的滤液置于旋转蒸发仪中，在低压～0.1MPa下旋转蒸干，得浸膏；
2)分离：将浸膏分批次放入到分液漏斗中，每次加入2L超纯水复溶，再依次加入等量石油醚、乙酸乙酯、正丁醇分别萃取三次，将得到的不同萃取液用旋转蒸发仪蒸去部分有机试剂，转移至蒸发皿中，放置70～80℃水浴锅上浓缩至浸膏状，分别得到石油醚层萃取物60～100g、乙酸乙酯层萃取物120～160g、正丁醇层萃取物80～120g；
3)纯化：①采用湿法过柱的方式，取乙酸乙酯层萃取物与硅胶按1:3质量比混合拌样，即得拌样硅胶，备用；②在硅胶柱中加入2L石油醚与2kg硅胶的混悬液，装填到硅胶柱中，再加入拌样硅胶，整个过程加压填实，活化20～40min；③再以100:1:0-0:0:1的石油醚-乙酸乙酯-甲醇溶剂系统对硅胶柱分别进行梯度洗脱，得到流分Fr.1～Fr.13；④用比例为10:1的石油醚-乙酸乙酯对流分Fr.5采用析晶的方式得到二氢-5,6-去氢醉椒素9.63g和5,6-去氢醉椒素0.96g；用比例为4:1的石油醚-乙酸乙酯对流分Fr.8经Sephadex LH-20凝胶柱反复层析，再经半制备高效液相分离得Anibadimer A 13.2mg；用比例为7:3的石油醚-乙酸乙酯对流分Fr.9经半制备高效液相分离得到6,6′-(2,4-二苯基环丁烷-1,3-二基)双(4-甲氧基-2H-吡喃-2-酮)11.3mg。
优选的，本发明步骤2)所述分离：将浸膏分批次放入到分液漏斗中，每次加入2L超纯水复溶，再依次加入等量石油醚、乙酸乙酯、正丁醇分别萃取三次，将得到的不同萃取液用旋转蒸发仪蒸去部分有机试剂，转移至蒸发皿中，放置75℃水浴锅上浓缩至浸膏状，分别得到石油醚层萃取物60～100g、乙酸乙酯层萃取物120～160g、正丁醇层萃取物80～120g；
优选的，本发明步骤2)所述分离：将浸膏分批次放入到分液漏斗中，每次加入2L超纯水复溶，再依次加入等量石油醚、乙酸乙酯、正丁醇分别萃取三次，将得到的不同萃取液用旋转蒸发仪蒸去部分有机试剂，转移至蒸发皿中，放置75℃水浴锅上浓缩至浸膏状，分别得到石油醚层萃取物60～100g、乙酸乙酯层萃取物120～160g、正丁醇层萃取物80～120g；
优选的，本发明步骤3)所述纯化：①采用湿法过柱的方式，取乙酸乙酯层萃取物与硅胶按1:3质量比混合拌样，即得拌样硅胶，备用；②在硅胶柱中加入2L石油醚与2kg硅胶的混悬液，装填到硅胶柱中，再加入拌样硅胶，整个过程加压填实，活化30min；③再以100:1:0-0:0:1的石油醚-乙酸乙酯-甲醇溶剂系统对硅胶柱分别进行梯度洗脱，得到流分Fr.1～Fr.13；④用比例为10:1的石油醚-乙酸乙酯对流分Fr.5采用析晶的方式得到二氢-5,6-去氢醉椒素9.63g和5,6-去氢醉椒素0.96g；用比例为4:1的石油醚-乙酸乙酯对流分Fr.8经Sephadex LH-20凝胶柱反复层析，再经半制备高效液相分离得Anibadimer A 13.2mg；用比例为7:3的石油醚-乙酸乙酯对流分Fr.9经半制备高效液相分离得到6,6′-(2,4-二苯基环丁烷-1,3-二基)双(4-甲氧基-2H-吡喃-2-酮)11.3mg。
本发明有益效果：
1、本发明根据药用植物化学分类学的原理，通过研究表明，验证了中药艳山姜该中含有四元环类或卡瓦内酯类化合物，所述合物在制备治疗糖尿病、修复高糖损伤血管内皮疾病药物中的应用。
2、本发明通过了对艳山姜化合物二氢-5,6-去氢醉椒素、5,6-去氢醉椒素、Anibadimer A、6,6′-(2,4-二苯基环丁烷-1,3-二基)双(4-甲氧基-2H-吡喃-2-酮)的药效学实验研究，结果表明4个化合物均对高糖损伤HUVECs均具有较为明显的修复保护作用，解决了既降糖又可修复血管的问题。
3、本发明与空白组比较，二氢-5,6-去氢醉椒素、5,6-去氢醉椒素、AnibadimerA、6,6′-(2,4-二苯基环丁烷-1,3-二基)双(4-甲氧基-2H-吡喃-2-酮)均具有较为明显修复血管内皮的作用，且差异具有统计学意义(P<0.05)，因此本发明化合物可联合传统降糖药治疗高血糖，可开发成为预防心血管疾病的传统降糖药物的联合药。
4、本发明的研究结果，为后续可以继续加强对该种植物的化学成分和活性筛选研究以及对该种植物中具有较好活性的化合物进行结构修饰方面的研究，期待发现更多的具有较好生物活性的单体化合物，以提供更好的降糖类药。
附图说明：
图1二氢-5,6-去氢醉椒素1H-NMR图；
图2二氢-5,6-去氢醉椒素13C-NMR图；
图3 5,6-去氢醉椒素1H-NMR图；
图4 5,6-去氢醉椒素13C-NMR图；
图5 AnibadimerA 1H-NMR图；
图6 AnibadimerA 13C-NMR图；
图7 6,6′-(2,4-二苯基环丁烷-1,3-二基)双(4-甲氧基-2H-吡喃-2-酮)1H-NMR图；
图8 6,6′-(2,4-二苯基环丁烷-1,3-二基)双(4-甲氧基-2H-吡喃-2-酮)13C-NMR图；
图9二氢-5,6-去氢醉椒素药效图；
图10 5,6-去氢醉椒素药效图；
图11 AnibadimerA药效图；
图12 6,6′-(2,4-二苯基环丁烷-1,3-二基)双(4-甲氧基-2H-吡喃-2-酮)药效图。
下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步地具体说明。
实施例1化合物的结构式
1)二氢-5,6-去氢醉椒素的结构式：
Figure BDA0003289509830000041
2)5,6-去氢醉椒素的结构式：
Figure BDA0003289509830000042
3)AnibadimerA的结构式：
Figure BDA0003289509830000043
4)6,6′-(2,4-二苯基环丁烷-1,3-二基)双(4-甲氧基-2H-吡喃-2-酮)的结构式：
Figure BDA0003289509830000044
实施例2化合物的提取分离纯化方法：
1)提取：①取艳山姜干燥果实，粉碎成粗颗粒，再称取25kg置于提取罐中，室温下用75％乙醇浸渍7天，重复两次；②合并浸渍液，用纱布滤过，得到的滤液置于旋转蒸发仪中，在低压-0.1MPa下旋转蒸干，得浸膏；
2)分离：将浸膏分批次放入到分液漏斗中，每次加入2L超纯水复溶，再依次加入等量石油醚、乙酸乙酯、正丁醇分别萃取三次，将得到的不同萃取液用旋转蒸发仪蒸去部分有机试剂，转移至蒸发皿中，放置75℃水浴锅上浓缩至浸膏状，分别得到石油醚层萃取物80g、乙酸乙酯层萃取物140g、正丁醇层萃取物100g；
3)纯化：①采用湿法过柱的方式，取乙酸乙酯层萃取物与硅胶按1:3质量比混合拌样，即得拌样硅胶，备用；②在硅胶柱中加入2L石油醚与2kg硅胶的混悬液，装填到硅胶柱中，再加入拌样硅胶，整个过程加压填实，活化30min；③再以100:1:0-0:0:1的石油醚-乙酸乙酯-甲醇溶剂系统对硅胶柱分别进行梯度洗脱，得到流分Fr.1～Fr.13；④用比例为10:1的石油醚-乙酸乙酯对流分Fr.5采用析晶的方式得到二氢-5,6-去氢醉椒素9.63g和5,6-去氢醉椒素0.96g；用比例为4:1的石油醚-乙酸乙酯对流分Fr.8经Sephadex LH-20凝胶柱反复层析，再经半制备高效液相分离得AnibadimerA 13.2mg；用比例为7:3的石油醚-乙酸乙酯对流分Fr.9经半制备高效液相分离得到6,6′-(2,4-二苯基环丁烷-1,3-二基)双(4-甲氧基-2H-吡喃-2-酮)11.3mg。
化合物的结构式：同实施例1。
实施例3化合物及提取分离纯化方法：
1)提取：①取艳山姜干燥果实，粉碎成粗颗粒，再称取25kg置于提取罐中，室温下用70％乙醇浸渍5天，重复两次；②合并浸渍液，用纱布滤过，得到的滤液置于旋转蒸发仪中，在低压-0.1MPa下旋转蒸干，得浸膏；
2)分离：将浸膏分批次放入到分液漏斗中，每次加入2L超纯水复溶，再依次加入等量石油醚、乙酸乙酯、正丁醇分别萃取三次，将得到的不同萃取液用旋转蒸发仪蒸去部分有机试剂，转移至蒸发皿中，放置70℃水浴锅上浓缩至浸膏状，分别得到石油醚层萃取物60g、乙酸乙酯层萃取物120g、正丁醇层萃取物80g；
3)纯化：①采用湿法过柱的方式，取乙酸乙酯层萃取物与硅胶按1:3质量比混合拌样，即得拌样硅胶，备用；②在硅胶柱中加入2L石油醚与2kg硅胶的混悬液，装填到硅胶柱中，再加入拌样硅胶，整个过程加压填实，活化20min；③再以100:1:0-0:0:1的石油醚-乙酸乙酯-甲醇溶剂系统对硅胶柱分别进行梯度洗脱，得到流分Fr.1～Fr.13；④用比例为10:1的石油醚-乙酸乙酯对流分Fr.5采用析晶的方式得到二氢-5,6-去氢醉椒素9.63g和5,6-去氢醉椒素0.96g；用比例为4:1的石油醚-乙酸乙酯对流分Fr.8经Sephadex LH-20凝胶柱反复层析，再经半制备高效液相分离得AnibadimerA 13.2mg；用比例为7:3的石油醚-乙酸乙酯对流分Fr.9经半制备高效液相分离得到6,6′-(2,4-二苯基环丁烷-1,3-二基)双(4-甲氧基-2H-吡喃-2-酮)11.3mg。
化合物的结构式：同实施例1。
实施例4化合物及提取分离纯化方法：
1)提取：①取艳山姜干燥果实，粉碎成粗颗粒，再称取25kg置于提取罐中，室温下用80％乙醇浸渍10天，重复两次；②合并浸渍液，用纱布滤过，得到的滤液置于旋转蒸发仪中，在低压-0.1MPa下旋转蒸干，得浸膏；
2)分离：将浸膏分批次放入到分液漏斗中，每次加入2L超纯水复溶，再依次加入等量石油醚、乙酸乙酯、正丁醇分别萃取三次，将得到的不同萃取液用旋转蒸发仪蒸去部分有机试剂，转移至蒸发皿中，放置80℃水浴锅上浓缩至浸膏状，分别得到石油醚层萃取物100g、乙酸乙酯层萃取物160g、正丁醇层萃取物120g；
3)纯化：①采用湿法过柱的方式，取乙酸乙酯层萃取物与硅胶按1:3质量比混合拌样，即得拌样硅胶，备用；②在硅胶柱中加入2L石油醚与2kg硅胶的混悬液，装填到硅胶柱中，再加入拌样硅胶，整个过程加压填实，活化40min；③再以100:1:0-0:0:1的石油醚-乙酸乙酯-甲醇溶剂系统对硅胶柱分别进行梯度洗脱，得到流分Fr.1～Fr.13；④用比例为10:1的石油醚-乙酸乙酯对流分Fr.5采用析晶的方式得到二氢-5,6-去氢醉椒素9.63g和5,6-去氢醉椒素0.96g；用比例为4:1的石油醚-乙酸乙酯对流分Fr.8经Sephadex LH-20凝胶柱反复层析，再经半制备高效液相分离得AnibadimerA 13.2mg；用比例为7:3的石油醚-乙酸乙酯对流分Fr.9经半制备高效液相分离得到6,6′-(2,4-二苯基环丁烷-1,3-二基)双(4-甲氧基-2H-吡喃-2-酮)11.3mg。
化合物的结构式：同实施例1。
实施例5取二氢-5,6-去氢醉椒素、5,6-去氢醉椒素、AnibadimerA、6,6′-(2,4-二苯基环丁烷-1,3-二基)双(4-甲氧基-2H-吡喃-2-酮)任意一种化合物作为原料药，加入30％的淀粉和10％的枸橼酸制粒，得颗粒剂。
实施例6取二氢-5,6-去氢醉椒素、5,6-去氢醉椒素、AnibadimerA、6,6′-(2,4-二苯基环丁烷-1,3-二基)双(4-甲氧基-2H-吡喃-2-酮)任意一种化合物作为原料药，加入5％的预胶化淀粉、5％微晶纤维素和3％滑石粉混匀，装入胶囊，得胶囊剂。
实施例7取二氢-5,6-去氢醉椒素、5,6-去氢醉椒素、AnibadimerA、6,6′-(2,4-二苯基环丁烷-1,3-二基)双(4-甲氧基-2H-吡喃-2-酮)任意一种化合物作为原料药，加入20％的淀粉和5％的水混合均匀，制成丸剂。
实施例8取二氢-5,6-去氢醉椒素、5,6-去氢醉椒素、AnibadimerA、6,6′-(2,4-二苯基环丁烷-1,3-二基)双(4-甲氧基-2H-吡喃-2-酮)任意一种化合物作为原料药，加入10％的淀粉桨和0.3％的糊精，制粒，压片，制成片剂。
实施例9取二氢-5,6-去氢醉椒素、5,6-去氢醉椒素、AnibadimerA、6,6′-(2,4-二苯基环丁烷-1,3-二基)双(4-甲氧基-2H-吡喃-2-酮)任意一种化合物作为原料药，加入14倍量的注射用水，过滤，灭菌，得注射剂。
实施例10取二氢-5,6-去氢醉椒素、5,6-去氢醉椒素、AnibadimerA、6,6′-(2,4-二苯基环丁烷-1,3-二基)双(4-甲氧基-2H-吡喃-2-酮)任意一种化合物作为原料药，加入8倍量的注射用水和0.05％羧甲基淀粉钠，过滤，冻干，得冻干粉剂。
实施例11取二氢-5,6-去氢醉椒素、5,6-去氢醉椒素、AnibadimerA、6,6′-(2,4-二苯基环丁烷-1,3-二基)双(4-甲氧基-2H-吡喃-2-酮)任意一种化合物作为原料药，加入12倍量纯净水和0.05％丙二醇，混合均匀，过滤，灭菌，得口服液。
为了进一步验证本发明的可行性及有效性，发明人进行了一系列的试验，具体如下：
(一)化合物的分离与鉴定考察
1仪器及试剂、材料
1.1仪器
Figure BDA0003289509830000061
1.2试剂
Figure BDA0003289509830000062
Figure BDA0003289509830000071
1.3材料
实验药材：艳山姜(批号：20190608)购自于贵州省黔西南州贞丰县，经贵州医科大学药学院龙庆德副教授鉴定为姜科植物Alpiniazerumbet(Pers.)Burtt.et Smith的干燥成熟果实。
细胞及培养基：人脐静脉内皮细胞株(HUVECs，武汉普诺赛生命科技有限公司，批号：CL-0122)、DMEM培养基(贵阳沃尔森生物技术有限公司，批号：8121370)、胎牛血清(贵阳沃尔森生物技术有限公司，批号：086150061)、双抗(贵阳沃尔森生物技术有限公司，批号：15140-122)。
2提取与分离
2.1药材的提取与分离
采集艳山姜干燥果实，粉碎成粗颗粒，再称取25kg置于提取罐中，室温下用75％乙醇浸渍7天，重复两次；合并浸渍液，用纱布滤过，得到的滤液置于旋转蒸发仪中，在低压-0.1MPa下旋转蒸干，得浸膏；将浸膏分批次放入到分液漏斗中，每次加入2L超纯水复溶，再依次加入等量石油醚、乙酸乙酯、正丁醇分别萃取三次，将得到的不同萃取液用旋转蒸发仪蒸去部分有机试剂，转移至蒸发皿中，放置75℃水浴锅上浓缩至浸膏状，分别得到石油醚层萃取物80g、乙酸乙酯层萃取物140g、正丁醇层萃取物100g；
2.2纯化
采用湿法过柱的方式，取乙酸乙酯层萃取物与硅胶按1:3质量比混合拌样，即得拌样硅胶，备用；②在硅胶柱中加入2L石油醚与2kg硅胶的混悬液，装填到硅胶柱中，再加入拌样硅胶，整个过程加压填实，活化30min；再以100:1:0-0:0:1的石油醚-乙酸乙酯-甲醇溶剂系统对硅胶柱分别进行梯度洗脱，得到流分Fr.1～Fr.13；用比例为10:1的石油醚-乙酸乙酯对流分Fr.5采用析晶的方式得到二氢-5,6-去氢醉椒素9.63g和5,6-去氢醉椒素0.96g；用比例为4:1的石油醚-乙酸乙酯对流分Fr.8经Sephadex LH-20凝胶柱反复层析，再经半制备高效液相分离得Anibadimer A 13.2mg；用比例为7:3的石油醚-乙酸乙酯对流分Fr.9经半制备高效液相分离得到6,6′-(2,4-二苯基环丁烷-1,3-二基)双(4-甲氧基-2H-吡喃-2-酮)11.3mg。
2.3艳山姜中4个化合物的表征
二氢-5,6-去氢醉椒素化合物表征
无色结晶，分子式：C14H14O3。硅胶薄层检识：以比例为2:1的石油醚：乙酸乙酯展开，在254nm下有荧光，经10％浓硫酸-乙醇显色烘烤后呈现黄色斑点。1H-NMR(400MHz,MeOD)、13C-NMR(100MHz,MeOD)数据见表1，谱图见图1、图2。
表1二氢-5,6-去氢醉椒素化合物表征数据表
Figure BDA0003289509830000072
Figure BDA0003289509830000081
5,6-去氢醉椒素化合物表征：
淡黄色粉末，分子式：C14H12O3。硅胶薄层检识：以比例为2:1的石油醚：乙酸乙酯展开，在254nm下有荧光，经10％浓硫酸-乙醇显色烘烤后呈现黄色斑点。1H-NMR(400MHz,MeOD)、13C-NMR(100MHz,MeOD)数据见表2，谱图见图3、图4。
表2 5,6-去氢醉椒素化合物表征数据表
Figure BDA0003289509830000082
AnibadimerA化合物表征：
无色结晶，分子式：C32H32O10。
硅胶薄层检识：以比例为5:6的石油醚：乙酸乙酯展开，在254nm下有荧光，经10％浓硫酸-乙醇显色烘烤后呈现黄色斑点。1H-NMR(400MHz,MeOD)、13C-NMR(100MHz,MeOD)数据表见表3，谱图见图5、图6。
表3 Anibadimer A化合物表征数据表
Figure BDA0003289509830000083
Figure BDA0003289509830000091
6,6′-(2,4-二苯基环丁烷-1,3-二基)双(4-甲氧基-2H-吡喃-2-酮)化合物表征：
无色结晶，分子式：C28H24O6。硅胶薄层检识：以比例为5:6的石油醚：乙酸乙酯展开，在254nm下有荧光，经10％浓硫酸-乙醇显色烘烤后呈现黄色斑点。1H-NMR(400MHz,MeOD)、13C-NMR(100MHz,MeOD)数据见表4，谱图见图7、图8。
表4 6,6′-(2,4-二苯基环丁烷-1,3-二基)双(4-甲氧基-2H-吡喃-2-酮)化合物表征数据表
Figure BDA0003289509830000092
Figure BDA0003289509830000101
(二)化合物的药效学实验研究
1细胞复苏
将冻存的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)从液氮容器转入至37℃温水中，手动振摇使其快速融化。将细胞悬液转移至加有适量的培养基离心管中，混匀，离心后弃上清液，加入适量的完全培养基(89％DMEM培养基+10％胎牛血清+1％双抗)重悬细胞，接种至培养瓶，于37℃、5％CO2培养箱静置培养。次日更换一次培养液，继续培养。
2细胞传代
在显微镜下观察，待HUVECs密度达到85％-90％以上，弃去培养基，用适量PBS清洗HUVECs，并弃去PBS；加入1mL胰酶消化HUVECs；待消化完全后，加入1.5mL完全培养基终止消化，离心后弃上清液，加适量完全培养基吹打混匀HUVECs，按合适比例进行细胞传代，并放入37℃、5％CO2的培养箱孵育。
3铺板
待细胞密度达到85％-90％以上，用适量的PBS洗涤2次，消化步骤同“2.细胞传代”，离心管中加入适量完全培养基重悬(1500rpm，离心5min)，显微镜下进行计数；然后将细胞悬液调整为6x104个/mL，以200μL/孔将细胞接种于96孔板中。
4MTT法考察四元环类或卡瓦内酯类化合物的安全浓度范围
取处于对数生长期的HUVECs以6x104个/mL的密度均匀接种在96孔板中，加入含不同浓度梯度药物的DMEM培养基，培养24h后，每孔加入20uL 5mg/mLMTT。4h后，吸出孔中培养基，每孔加入150uLDMSO，振摇至底部颜色均匀后用酶标仪在490nm波长下测量每孔OD值。
5四元环类或卡瓦内酯类化合物对高糖损伤HUVECs的保护作用考察
取处于对数生长期的HUVECs以6x104个/mL的密度均匀接种在96孔板中，加入含不同浓度艳山姜化合物的DMEM培养基，预保护培养1.5h后，加入含浓度为45mM高糖的DMEM培养基，放入37℃、5％CO2的培养箱孵育12h。每孔加入20uLMTT。4h后，吸出孔中培养基，每孔加入150uLDMSO，振摇至底部颜色均匀后用酶标仪在490nm波长下测量每孔OD值。结果发现，二氢-5,6-去氢醉椒素、5,6-去氢醉椒素、Anibadimer A、6,6′-(2,4-二苯基环丁烷-1,3-二基)双(4-甲氧基-2H-吡喃-2-酮)对高糖损伤HUVECs均具有较为明显的修复保护作用，且差异具有统计学意义(P<0.05)，实验数据见表5，药效图见图9、图10、图11、图12。
表5样品对HUVECs的保护作用(N＝6,
Figure BDA0003289509830000103
)
Figure BDA0003289509830000102
Figure BDA0003289509830000111
*与模型组比较，P<0.05；***与模型组比较，P<0.001；#与空白组比较，P<0.05。
6结论
艳山姜中化合物二氢-5,6-去氢醉椒素、5,6-去氢醉椒素、Anibadimer A、6,6′-(2,4-二苯基环丁烷-1,3-二基)双(4-甲氧基-2H-吡喃-2-酮)对高糖损伤HUVECs均具有较为明显的修复保护作用。
虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作出一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种艳山姜中的化合物，基特征在于，所述化合物结构式分别如下：
1)二氢-5,6-去氢醉椒素的结构式：
Figure FDA0003289509820000011
2)5,6-去氢醉椒素的结构式：
Figure FDA0003289509820000012
3)Anibadimer A的结构式：
Figure FDA0003289509820000013
4)6,6′-(2,4-二苯基环丁烷-1,3-二基)双(4-甲氧基-2H-吡喃-2-酮)的结构式：
Figure FDA0003289509820000014
2.根据权利要求1所述化合物，其特征在于，所述化合物在制备降糖药物及预防心血管疾病药物方面的应用。
3.根据权利要求2所述化合物，其特征在于，所述化合物在制备治疗糖尿病、修复高糖损伤血管内皮疾病药物中的应用。
4.根据权利要求2所述的化合物，其特征在于，所述药物可以加入药学上可接受的辅料制成药学上可接受的固体制剂或液体制剂。
5.根据权利要求4所述化合物，其特征在于，所述固体制剂为片剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂、散剂、冻干粉针剂。
6.根据权利要求4所述化合物，其特征在于，所述液体制剂为注射制剂、口服液。
7.根据权利要求1～6任一项所述的化合物，其特征在于，所述化合物提取分离纯化方法包括以下步骤：
1)提取：①取艳山姜干燥果实，粉碎成粗颗粒，再称取25kg置于提取罐中，室温下用70～80％乙醇浸渍5～10天，重复两次；②合并浸渍液，用纱布滤过，得到的滤液置于旋转蒸发仪中，在低压-0.1MPa下旋转蒸干，得浸膏；
2)分离：将浸膏分批次放入到分液漏斗中，每次加入2L超纯水复溶，再依次加入等量石油醚、乙酸乙酯、正丁醇分别萃取三次，将得到的不同萃取液用旋转蒸发仪蒸去部分有机试剂，转移至蒸发皿中，放置70～80℃水浴锅上浓缩至浸膏状，分别得到石油醚层萃取物60～100g、乙酸乙酯层萃取物120～160g、正丁醇层萃取物80～120g；
3)纯化：①采用湿法过柱的方式，取乙酸乙酯层萃取物与硅胶按1:3质量比混合拌样，即得拌样硅胶，备用；②在硅胶柱中加入2L石油醚与2kg硅胶的混悬液，装填到硅胶柱中，再加入拌样硅胶，整个过程加压填实，活化20～40min；③再以100:1:0-0:0:1的石油醚-乙酸乙酯-甲醇溶剂系统对硅胶柱分别进行梯度洗脱，得到流分Fr.1～Fr.13；④用比例为10:1的石油醚-乙酸乙酯对流分Fr.5采用析晶的方式得到二氢-5,6-去氢醉椒素9.63g和5,6-去氢醉椒素0.96g；用比例为4:1的石油醚-乙酸乙酯对流分Fr.8经Sephadex LH-20凝胶柱反复层析，再经半制备高效液相分离得Anibadimer A 13.2mg；用比例为7:3的石油醚-乙酸乙酯对流分Fr.9经半制备高效液相分离得到6,6′-(2,4-二苯基环丁烷-1,3-二基)双(4-甲氧基-2H-吡喃-2-酮)11.3mg。
8.根据权利要求7所述的化合物，其特征在于，步骤1)所述提取：①取艳山姜干燥果实，粉碎成粗颗粒，再称取25kg置于提取罐中，室温下用75％乙醇浸渍7天，重复两次；②合并浸渍液，用纱布滤过，得到的滤液置于旋转蒸发仪中，在低压-0.1MPa下旋转蒸干，得浸膏。
9.根据权利要求7的化合物，其特征在于，步骤2)所述分离：将浸膏分批次放入到分液漏斗中，每次加入2L超纯水复溶，再依次加入等量石油醚、乙酸乙酯、正丁醇分别萃取三次，将得到的不同萃取液用旋转蒸发仪蒸去部分有机试剂，转移至蒸发皿中，放置75℃水浴锅上浓缩至浸膏状，分别得到石油醚层萃取物60～100g、乙酸乙酯层萃取物120～160g、正丁醇层萃取物80～120g。
10.根据权利要求7的化合物，其特征在于，步骤3)所述纯化：①采用湿法过柱的方式，取乙酸乙酯层萃取物与硅胶按1:3质量比混合拌样，即得拌样硅胶，备用；②在硅胶柱中加入2L石油醚与2kg硅胶的混悬液，装填到硅胶柱中，再加入拌样硅胶，整个过程加压填实，活化30min；③再以100:1:0-0:0:1的石油醚-乙酸乙酯-甲醇溶剂系统对硅胶柱分别进行梯度洗脱，得到流分Fr.1～Fr.13；④用比例为10:1的石油醚-乙酸乙酯对流分Fr.5采用析晶的方式得到二氢-5,6-去氢醉椒素9.63g和5,6-去氢醉椒素0.96g；用比例为4:1的石油醚-乙酸乙酯对流分Fr.8经Sephadex LH-20凝胶柱反复层析，再经半制备高效液相分离得Anibadimer A 13.2mg；用比例为7:3的石油醚-乙酸乙酯对流分Fr.9经半制备高效液相分离得到6,6′-(2,4-二苯基环丁烷-1,3-二基)双(4-甲氧基-2H-吡喃-2-酮)11.3mg。
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