CN113736885A - miRNA作为生物标记物在制备骨肉瘤检测制剂中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了miRNA在制备骨肉瘤检测制剂中的应用，所述miRNA为hsa‑miR‑34a、hsa‑miR‑1270、hsa‑miR‑154、hsa‑miR‑329中的一条或几条。本发明发现hsa‑miR‑34a，hsa‑miR‑1270，hsa‑miR‑154，hsa‑miR‑329在骨肉瘤患者的唾液外泌体中显著上调，且与骨肉癌组织具有较高的一致性，说明这四条miRNA中的一条或几条可以作为骨肉瘤标志物，应用于制备骨肉瘤检测制剂中。

Description

miRNA作为生物标记物在制备骨肉瘤检测制剂中的应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，更具体地，本发明涉及多条miRNA作为生物标记物在制备非疾病诊断方法的骨肉瘤检测制剂中的应用。

背景技术

骨肉瘤是儿童及成人中最常见的恶性骨肿瘤，在原发性骨肿瘤中，骨肉瘤的发病率仅次于浆细胞骨髓瘤，居第2位，好发于10-25岁青年，男女患者比例约为1.5:1。骨肉瘤的恶性程度很高，生长非常迅速，转移早，侵袭性强，在临床上作出诊断时已有80％左右的患者发生了肺部或其他部位的转移。既往骨肉瘤患者的预后极差，5年生存率仅有20％左右，尽管近年来外科手术和化疗方面取得了长足的进展，但骨肉瘤患者的5年生存率至今仍徘徊在65％左右，多数患者最终仍然死于骨肉瘤的局部复发或远处转移。

由于骨肉瘤具有恶性程度高、生长迅速、侵袭力强、转移早等肿瘤学特征，所以绝大多数患者就诊时已经是癌症晚期，而研究表明早期诊断及治疗可使骨肉瘤患者的生存率及预后效果提高4-5倍。因此，针对骨肉瘤的早期诊断，早期筛查，将骨肉瘤患者的治疗窗口提前，改善患者的预后，及时评价放化疗的效果，针对骨肉瘤患者的个性化医疗及用药，尤为重要。

目前骨肉瘤的筛查或者诊断依赖于影像学和组织病理学检测，影像学由于自身技术特点只能检测到生长到一定程度的肿瘤，而病理学需要采用外科手术穿刺活检方法从患者身体获取肿瘤组织，不但操作技术难度大，成本高，效率低而且依从性较差，无法大批量进行筛查，而且受到医生技术水平及患者身体状况等诸多因素影响，不能用于早期筛查和临床诊断。

miRNA是具有在转录后水平调控基因表达功能的非编码小分子RNA，长度约18-24nt，参与细胞分裂增殖、分化与发育，以及代谢等许多重要的生物过程，在生物种属之间具有高度的保守性、时序性以及组织特异性。它位于基因内含子中，成熟的miRNA进入RNA诱导的基因沉默复合物(RISC)中，形成非对称性复合物。RISC中成熟的miRNA链可与其靶向mRNA3’非翻译区特异性结合，从而降解靶mRNA，阻断蛋白合成，调控基因的表达。

miRNA作为一种在某些肿瘤中异常表达的非编码的小RNA，参与许多肿瘤的发生发展的相关基因的调控，在这一过程中发挥着十分关键的作用，且其即使在大量核酶存在的情况下依旧十分稳定，在各种体液中表达丰富，可以作为肿瘤诊断和预后判断的生物标志物。在未来临床治疗中，miRNA不仅可以成为新的疾病早期诊断和疾病进程相关的标记物，而且也有望通过改变miRNA的表达或者其靶基因的表达治疗疾病。寻找和鉴定与疾病发生相关的miRNA及其靶基因为miRNA的临床治疗提供基础。

基于以上原因，发现具有高灵敏度及特异性的检测骨肉瘤的生物标志物miRNA，并建立无创早期筛查方法及评价放化疗治疗效果的检测方法是目前研究的热点也是当务之急。而液态活检技术(Liquid Biopsy)正好可以解决目前这一痛点，可以很好的解决上述问题。目前主要是针对血液中的DNA片段、血液中循环肿瘤细胞、以及微小RNA通过高通量测序检测基因突变。

然而，血液样本尽管包含了全身状况的众多信息，但通过提取血液中的miRNA来进行液体活检，仍有一些固有的缺陷：第一，血液采集具有侵袭性，引起患者不适；第二，这种直接检测血液中裸露DNA或miRNA也会造成不同程度的损失和降解；第三，血液中成分复杂，来源多样，信息斑驳，在检测分析的过程中可能会引起非特异性及受到流体动力学作用的干扰；第四，血液有易凝结的特点，需要采取抗凝处理才能进行下一步的检验，而抗凝处理本身有可能会对检验结果造成一定的影响；第五，血液中的大量细胞具有数秒至数周或一个月以上的半衰期，也可能对分析结果产生影响。

因此，发现具有高灵敏度及特异性的检测骨肉瘤的生物标志物miRNA，并建立除血液作为样本外的其他液体活检技术非常必要。

发明内容

基于此，本发明的目的之一是提供一种miRNA作为生物标记物在制备骨肉瘤检测制剂中的应用，所述miRNA在骨肉瘤患者的组织中的表达明显比正常组织中高很多。

实现上述发明目的的具体技术方案如下：

miRNA作为生物标记物在制备非疾病诊断方法的骨肉瘤检测制剂中的应用，所述miRNA为hsa-miR-34a、hsa-miR-1270、hsa-miR-154、hsa-miR-329中的一条或几条。

在其中一些实施例中，所述miRNA为hsa-miR-34a、hsa-miR-1270、hsa-miR-154和hsa-miR-329。

在其中一些实施例中，所述骨肉瘤检测制剂包括：用于检测唾液外泌体中所述miRNA表达水平的试剂。

在其中一些实施例中，所述检测唾液外泌体中的miRNA表达水平的试剂包括：提取唾液外泌体的试剂、提取唾液外泌体RNA的试剂、RNA反转录试剂、以及RNA定量检测试剂。

在其中一些实施例中，所述RNA定量检测试剂包括：针对所述miRNA的引物和/或探针。

在其中一些实施例中，所述骨肉瘤检测制剂为试剂盒、芯片、试纸、或高通量测序平台。

在其中一些实施例中，所述骨肉瘤为软骨母细胞型骨肉瘤。

本发明还提供了一种骨肉瘤检测试剂盒。

实现上述发明目的的具体技术方案如下：

一种骨肉瘤检测试剂盒，包括检测唾液外泌体中的miRNA表达水平的试剂，所述miRNA为hsa-miR-34a、hsa-miR-1270、hsa-miR-154、hsa-miR-329中的一条或几条。

在其中一些实施例中，所述miRNA为hsa-miR-34a、hsa-miR-1270、hsa-miR-154和hsa-miR-329。

在其中一些实施例中，所述检测唾液外泌体中miRNA表达水平的试剂包括：提取唾液外泌体的试剂、提取唾液外泌体RNA的试剂、RNA反转录试剂、以及RNA定量检测试剂。

在其中一些实施例中，所述RNA定量检测试剂包括：针对所述miRNA的引物和/或探针。

在其中一些实施例中，所述骨肉瘤为软骨母细胞型骨肉瘤。

本发明还提供了一种非疾病诊断方法的骨肉瘤的检测方法。

实现上述发明目的的具体技术方案如下：

一种非疾病诊断方法的骨肉瘤的检测方法，包括检测hsa-miR-34a、hsa-miR-1270、hsa-miR-154、以及hsa-miR-329中的一条或几条的表达水平。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

1、本发明的发明人对病人严格入组和评估，提取骨肉瘤患者以及正常人的唾液外泌体中的miRNA，通过基因芯片高通量筛查唾液外泌体中miRNA的表达差异，并应用Q-PCR进行了大样本的验证，证明四条miRNA(hsa-miR-34a，hsa-miR-1270，hsa-miR-154，hsa-miR-329)在骨肉瘤患者的唾液外泌体中显著上调，且与骨肉癌组织具有较高的一致性，说明这四条miRNA中的一条或几条可以作为骨肉瘤标志物，应用于制备非疾病诊断方法的骨肉瘤检测制剂中。

2、本发明通过检测受试者唾液外泌体中的四条miRNA中的一种或几种的含量，判断受试者是否患有骨肉瘤、或者判断受试者是否存在患有骨肉瘤的风险，有助于临床医生迅速掌握患者病情，从而及时制定更具有个体化的治疗措施，相对于检测受试者血液中或唾液中的miRNA，本发明检测受试者外泌体中的miRNA有更为明显的优势——唾液外泌体比唾液更为稳定，外泌体的分泌囊泡能够有效保护miRNA不被核酸酶分解；唾液被称为血液的超滤液，其去掉了血液中的很多有型成分，成分相对于血液更为纯净，且具有易操控、不易凝结等特征，可以很好地消除抗凝处理等对检验结果的影响。

附图说明

图1为本发明实施例2中hsa-miR-34a，hsa-miR-1270，hsa-miR-154，hsa-miR-329在骨肉瘤患者唾液外泌体与正常人唾液外泌体中表达水平对比图，其中，相对表达值单位为ng/ul。

图2为本发明实施例3中骨肉瘤患者癌组织中的hsa-miR-34a与其对应的唾液外泌体中的hsa-miR-34a的相关性分析结果，其中，相对表达值单位为ng/ul。

图3为本发明实施例3中骨肉瘤患者癌组织中的hsa-miR-1270与其对应的唾液外泌体中的hsa-miR-1270的相关性分析结果，其中，相对表达值单位为ng/ul。

图4为本发明实施例3中骨肉瘤患者癌组织中的hsa-miR-154与其对应的唾液外泌体中的hsa-miR-154的相关性分析结果，其中，相对表达值单位为ng/ul。

图5为本发明实施例3中骨肉瘤患者癌组织中的hsa-miR-329与其对应的唾液外泌体中的hsa-miR-329的相关性分析结果，其中，相对表达值单位为ng/ul。

图6为本发明实施例4中唾液外泌体中的hsa-miR-34a的敏感性和特异性分析结果。

图7为本发明实施例4中唾液外泌体中的hsa-miR-1270的敏感性和特异性分析结果。

图8为本发明实施例4中唾液外泌体中的hsa-miR-154的敏感性和特异性分析结果。

图9为本发明实施例4中唾液外泌体中的hsa-miR-329的敏感性和特异性分析结果。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明公开内容的理解更加透彻全面。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(NewYork:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。

在本发明中，除特别定义外，浓度单位均为每升溶液的摩尔浓度。本领域技术人员进一步知悉，本发明下述实施例中的各个浓度，摩尔分数，质量分数均可以根据实际进行进行调整。本领域技术人员可以实现上述调整。

本发明中所述外泌体(exosome)是一种直径仅为30-100nm纳米级的双层脂质膜所包围的囊泡小体，可由B细胞、T细胞、树突细胞、肥大细胞、内皮细胞、成纤维细胞、间充质干细胞和肿瘤细胞等机体内多种细胞分泌释放，天然存在于体液中，在血液、唾液、尿液、腹水和母乳等中具有较高的丰度，且其中含有蛋白质、RNA和脂肪成分，参与细胞间的物质交换和信息交流，影响细胞的生理状态，并与多种疾病的发生与进程密切相关。肿瘤细胞在生长过程中会不断分泌外泌体，从而进入淋巴系统和肿瘤组织内的毛细血管，发挥对恶性肿瘤抑制或促进的双重调控等作用。外泌体携带的信息多样化，其中的蛋白质和核酸，均可用于癌症的早诊、复发监测、抗药性监测等相关方面的分析。外泌体更易富集，在外泌体的分泌囊泡能够有效保护核酸类物质不被核酸酶分解，在临床应用上大有可为；且外泌体更为稳定，即便是-70℃保存30年的血液也可以从中提取外泌体。外泌体中含有丰富的miRNA，因此检测外泌体源性的miRNA有助于肿瘤的早期诊断、疗效评价和预后分析。

唾液是液体诊断的重要组成部分，近年来得到了越来越多的关注，在疾病早期诊断中具有明显的作用。唾液腺血供丰富，唾液被认为是血循环的末端产物，很多血液中的分子物质也见于唾液中。唾液被称为血液的超滤液，比起血液更加纯净，去掉了血液中的很多有型成分。相较其他液体而言，唾液易操控，不易凝结，消除了抗凝处理对检验结果的影响。同时，唾液采集具有非侵袭性，受试者基本无痛苦和不适，具有可重复性，安全而廉价。并且检测方便，一次采样可以检测多个标志物，可以定量。总之，唾液较之其他体液具有较明显的优势。

以下结合具体实施例和附图对本发明作进一步详细的说明。

实施例1基因芯片高通量筛查骨肉瘤患者和正常人的唾液外泌体中miRNA的表达差异

本实施例先提取20例骨肉瘤患者的唾液外泌体中的miRNA，以及20例正常志愿者的唾液外泌体中的miRNA，再通过基因芯片高通量筛查骨肉瘤患者和正常志愿者的miRNA表达差异。具体包括以下步骤：

1、唾液的收集、保存以及运输

本实施例中涉及20例第二军医大学附属长征医院骨肉瘤患者以及20例该院正常志愿者的唾液样本，严格控制两组之间的年龄、男女差异，有无吸烟等其他因素。按以下标准和步骤进行收集、保存及运输：

(1)、收集：于早晨8-10点，采用非刺激性滴取法于安静舒适的环境下，对满足下列条件受试者(a、空腹，未进行剧烈运动；b、嘱咐受试者用约20～60ml左右漱口液，以清除口腔内食物等残渣，吐尽残留液体)进行全唾液收集：头部微下垂，静坐后待唾液自然流出。收集其非刺激性全唾液于收集皿中，以唾液铺满培养皿为宜，约250～900ul，而后迅速分装至无菌保存管。

(2)、保存：采集的唾液在无菌保存管离心后，冰冻状态可长期保存。

(3)、运输：如需运输，可置于运输盒进行运输，可以保证后续实验免受唾液中各种微生物或酶的影响。

2、唾液外泌体提取

分别取各骨肉瘤患者唾液500uL以及各正常人唾液500uL(未进行离心处理的唾液量至少为250uL)，于2500～5000g离心15min。用移液器将离心所得上清移至新的1.5mL的EP管中，得到约450～470uL澄清上清，加入等量的外泌体沉淀溶液(聚乙二醇6000)混匀，4℃静置孵育过夜，10000g4℃离心1h后弃上清，收集外泌体白色沉淀，将外泌体白色沉淀用适量1X外泌体悬浮液(磷酸缓冲盐溶液)重悬得到外泌体重悬液。根据Nanosight分析外泌体相应数量如表1所示。

表1 外泌体数量

3、唾液外泌体中的miRNA提取(参考现有提取miRNA的方法)

在上述步骤2中得到的骨肉瘤患者和正常人的唾液外泌体白色沉淀中，分别加入250ul～500ul的RNA提取液(苯酚和RNA酶抑制剂)，反复吹打后，室温裂解5min-15min，混合均匀后加入相应miRNA的外参cel-miR-39用以后续分析标准化。加入50ul的RNA除杂液(氯仿)，涡旋充分混匀后，室温静置5min-15min，10000g-13000g离心5min-15min，转上层水相到另一个新管，加入等体积的RNA沉淀液(异丙醇)，上下颠倒混匀后室温静置5min-15min，或者-20℃沉淀。10000g-13000g离心5min-15min后，弃去上清液，加入250ul-500ul-20℃预冷的RNA洗涤液(75％DEPC乙醇)洗涤沉淀，震荡混匀，12000g离心5min，弃乙醇液体，超净台静置充分晾干沉淀。所得沉淀用RNA富集液(DEPC水溶液)溶解沉淀，运用NanoDorp2000紫外分光光度计检测纯度及浓度，所得miRNA封口膜密封，-80℃保存。运用NanoDorp2000紫外分光光度计检测分析得到如表2。

表2 唾液外泌体中RNA的浓度

4、对唾液外泌体中的miRNA进行芯片筛选

将提取得到的骨肉瘤患者的唾液外泌体中的miRNA，以及正常志愿者的唾液外泌体中的miRNA，根据总RNA浓度，送检适量体积的miRNA进行microRNA芯片筛选，miRNA芯片(Agilent Human miRNA(8*60K)array)筛选由上海中科新生命生物技术有限公司分析完成。

唾液外泌体miRNA的芯片筛选结果如表3所示，芯片筛选结果发现，miRNA中hsa-miR-34a，hsa-miR-1270，hsa-miR-154，hsa-miR-329，在骨肉瘤患者的唾液外泌体中的表达明显高于正常人。

表3 唾液外泌体miRNA的芯片筛选结果

系统名	p值
		hsa-miR-34a	0.003422396
hsa-miR-1270	0.004127701
		hsa-miR-154	0.003884619
Hsa-miR-329	0.002864984

hsa-miR-34a，hsa-miR-1270，hsa-miR-154，hsa-miR-329的具体序列分别如SEQID NO:1～4所示。

hsa-miR-34a-3p(MIMAT0020924)：GACACAUUUGGAGAGGGAACC(SEQ ID NO:1)；hsa-miR-1270(MIMAT0018985)：GGCUGGAGCGAGUGCAGUGGUG(SEQ ID NO:2)；hsa-miR-154(MIMAT0009447)：UCAGGCCAGGCACAGUGGCUCA(SEQ ID NO:3)；hsa-miR-329-5p(MIMAT0027686)：CAGGCAGGUGUAGGGUGGAGC(SEQ ID NO:4)。

实施例2 Q-PCR验证hsa-miR-34a，hsa-miR-1270，hsa-miR-154，hsa-miR-329对骨肉瘤的检测

提取长征医院100例骨肉瘤患者的唾液外泌体中的miRNA以及40例正常人的唾液外泌体中的miRNA，以实施例1中筛选出的hsa-miR-34a，hsa-miR-1270，hsa-miR-154，hsa-miR-329进行Q-PCR验证，△△CT法进行相对定量。具体包括以下步骤：

1、唾液外泌体中的miRNA反转录成cDNA

使用加尾法、茎环法分别将100例骨肉瘤患者的唾液外泌体中的miRNA反转录成cDNA，以及分别将40例正常人的唾液外泌体中的miRNA反转录成cDNA，采用市面上已成熟的试剂盒如复能公司的All-in-OneTMmiRNA qRT-PCRDetection(QP015、QP016)，按照说明书操作，以表4所示的比例配成25uL反转录反应体系。

表4 反转录体系

成分	剂量
		5*miRNA反转录缓冲液	5uL
miRNA RTase混合液	1uL
		miRNA polyA多聚酶	1uL
总RNA	1ng-5ng
		DEPC水	补足至25uL

将各成分混合均匀后，简单离心后，置于PCR仪，37℃1h，85℃5min，所得产物cDNA置于-80℃冰箱备用。

2、Q-PCR对cDNA进行检测

采用市面上已成熟的试剂盒如复能公司的All-in-OneTMmiRNA qRT-PCRDetection(QP015、QP016)，按照说明书操作，对miRNA反转录所得cDNA进行检测，以表5所示的比例配成20uL Real Time PCR反应体系。

表5 Real Time PCR反应体系

所用miRNA SYBR GREEN正向引物和通用反向引物购自华大基因。

使用Applied Biosystems 7500 Real Time PCR System进行实时荧光定量PCR检测，△△CT法进行相对定量。Real Time PCR反应条件为95℃10min，(95℃10s，60℃20s，72℃10s)*40个循环。结果如图1所示。

从图1可以看出，对芯片筛选的四条miRNA进行Q-PCR验证，表明hsa-miR-34a，hsa-miR-1270，hsa-miR-154，hsa-miR-329在骨肉瘤的表达水平较正常组织中高(骨肉瘤患者样本例数n＝100，正常志愿者样本例数＝40，***表示统计学差异p<0.001)，结果与基因芯片高通量筛查结果一致，说明hsa-miR-34a，hsa-miR-1270，hsa-miR-154，hsa-miR-329能较好地对骨肉瘤进行检测。

实施例3唾液外泌体中的miRNA与骨肉瘤癌组织中的miRNA的相关性分析

对骨肉瘤患者癌组织中的hsa-miR-34a、hsa-miR-1270、hsa-miR-154、hsa-miR-329与骨肉瘤患者唾液外泌体中的hsa-miR-34a、hsa-miR-1270、hsa-miR-154、hsa-miR-329，进行相关性分析，结果如图2～5所示。

图2～5结果表明：相关性分别为p＝0.0201，p＝0.0130，p＝0.0322，p＝0.0039，说明骨肉瘤患者唾液外泌体中的hsa-miR-34a、hsa-miR-1270、hsa-miR-154、hsa-miR-329与骨肉瘤癌组织中的hsa-miR-34a、hsa-miR-1270、hsa-miR-154、hsa-miR-329有较好的一致性，唾液外泌体中的miRNA能够反映癌组织的miRNA表达水平。

实施例4唾液外泌体中的miRNA的敏感性、特异性分析

运用ROC曲线，对唾液外泌体中的4条miRNA的敏感性、特异性进行分析，结果如图6～9所示。

图6结果表明：hsa-miR-34a在区分骨肉瘤组织与正常组织时，AUC值为0.855，cutoff点敏感性为80％，特异性为100％。图7结果表明：hsa-miR-1270在区分骨肉瘤组织与正常组织时，AUC值为0.680，cutoff点敏感性为70％，特异性为70％。图8结果表明：hsa-miR-154在区分骨肉瘤组织与正常组织时，AUC值为0.695，cutoff点敏感性为60％，特异性为70％。图9结果表明：hsa-miR-329在区分骨肉瘤组织与正常组织时，AUC值为0.855，cutoff点敏感性为80％，特异性为70％。

因此，hsa-miR-34a，hsa-miR-1270，hsa-miR-154，hsa-miR-329具有敏感性高，特异性强的特点，其中以hsa-miR-34a敏感性、特异性最优。多标志物综合应用能较好地对骨肉瘤进行筛选，具有临床应用意义。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110> 上海金域医学检验所有限公司

<120> miRNA作为生物标记物在制备骨肉瘤检测制剂中的应用

<130> 1

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gacacauuug gagagggaac c 21

<210> 2

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ggcuggagcg agugcagugg ug 22

<210> 3

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ucaggccagg cacaguggcu ca 22

<210> 4

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 4

caggcaggug uaggguggag c 21

Claims (10)

1.miRNA作为生物标记物在制备非疾病诊断方法的骨肉瘤检测制剂中的应用，其特征在于，所述miRNA为hsa-miR-34a、hsa-miR-1270、hsa-miR-154、hsa-miR-329中的一条或几条。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述miRNA为hsa-miR-34a、hsa-miR-1270、hsa-miR-154和hsa-miR-329。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述骨肉瘤检测制剂包括：用于检测唾液外泌体中所述miRNA表达水平的试剂。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述检测唾液外泌体中的miRNA表达水平的试剂包括：提取唾液外泌体的试剂、提取唾液外泌体RNA的试剂、RNA反转录试剂、以及RNA定量检测试剂。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述RNA定量检测试剂包括：针对权利要求1或2所述miRNA的引物和/或探针。

6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述骨肉瘤检测制剂为试剂盒、芯片、试纸、或高通量测序平台。

7.根据权利要求1～6任一项所述的应用，其特征在于，所述骨肉瘤为软骨母细胞型骨肉瘤。

8.一种骨肉瘤检测试剂盒，其特征在于，包括检测唾液外泌体中的miRNA表达水平的试剂，所述miRNA为hsa-miR-34a、hsa-miR-1270、hsa-miR-154、hsa-miR-329中的一条或几条。

9.根据权利要求8所述的骨肉瘤检测试剂盒，其特征在于，所述检测唾液外泌体中miRNA表达水平的试剂包括：提取唾液外泌体的试剂、提取唾液外泌体RNA的试剂、RNA反转录试剂、以及RNA定量检测试剂。

10.一种非疾病诊断方法的骨肉瘤的检测方法，其特征在于，包括检测hsa-miR-34a、hsa-miR-1270、hsa-miR-154、hsa-miR-329中的一条或几条的表达水平。

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