CN113735928A - 一种n4-羟基胞苷衍生物及其制备方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种如通式I所示的N4‑羟基胞苷衍生物、其药学上可接受的盐、其互变异构体、其立体异构体、其代谢产物、其代谢前体或其前药：
Description
技术领域
本发明属于医药领域，具体涉及能抑制RNA依赖的RNA聚合酶的N4-羟基胞苷衍生物及其制备方法和作为抗RNA病毒药物的用途。
背景技术
由SARS-CoV-2所引起的COVID-19正在全球蔓延，已经成为世界流行性疾病，给全球公共卫生防御和医疗系统带来严峻的挑战，给世界经济带来不确定因素。SARS-CoV-2是一种高致病性、大规模流行的人畜共患病毒，其与SARS-CoV和MERS-CoV同属于冠状病毒科。SARS-CoV-2的感染症状从无症状疾病到中度和重度肺炎，以及危及生命的并发症，包括低氧性呼吸衰竭、急性呼吸窘迫综合征、多系统器官衰竭，并最终出现死亡。更严重的是，这种病毒不仅具有高度传染性，而且可以通过无症状感染者和那些处于症状期和症状前阶段的人进行传播。SARS-CoV-2病毒感染迅速在亚洲、非洲、欧洲和美洲的多个国家传播，迄今为止感染人数累计超过1.6亿人次，死亡人数累计超过340万人次，并呈现继续增长趋势。尽管多年来科研工作者们一直致力于抗病毒药物的研究与开发，但是令人遗憾的是目前尚无有效的针对性治疗药。这也是我们面临爆发性的SARS-CoV-2感染时束手无策的主要原因。尽管，瑞德西韦被FDA正式批准上市，但是它的临床疗效不显著，对重症患者无效。2020年11月9日，美国FDA批准了礼来的单抗bamlanivimab的紧急使用授权(EUA)，用于治疗成人和儿童中轻至中度COVID-19患者，代表着人们对治疗住院患者方面前进了一小步，但是我们仍然急需更多有效的药物来加速治疗患者和降低病人的死亡率。因此，寻找新型有效抗SARS-CoV-2感染策略迫在眉睫，亦为了更好地应对突如其来的病毒感染做好充足的准备。
Stuyver等人发现了N-羟基胞苷(NHC)具有抗瘟病毒和抗肝炎病毒的活性(参见Antimicrob Agents Chemother，2003，47(1)：244-254)；埃卡特·马特斯等人公布了β-L-N4-羟基嘧啶脱氧核苷和它们在预防和治疗病毒疾病中作为药物制剂的应用，通式为：
(公开号CN 101253190A)；美国埃默里大学公布了N4-羟基胞苷及衍生物和与其相关的抗病毒用途(申请公布号：CN 111372592A、CN 107427529A)；常州安蒂卫生物科技公司最近公开了被取代的N4-羟基胞苷衍生物及其前药的结构(申请公布号：CN111548384A)。
随着SARS-CoV-2病毒在全世界的广泛传播，有效的抗病毒药物的需求也与日俱增，本文公开的化合物和方法可以解决这些需求。
发明内容
发明目的：本发明的目的是提供一种能抑制RNA依赖的RNA聚合酶的N4-羟基胞苷衍生物；本发明的另一目的是提供一种N4-羟基胞苷衍生物的制备方法；本发明的另一目的是提供一种N4-羟基胞苷衍生物作为新的RNA病毒的RNA依赖的RNA聚合酶抑制剂的应用；本发明的另一目的是提供一种N4-羟基胞苷衍生物的药物组合物；本发明的另一目的是提供一种N4-羟基胞苷衍生物、药物组合物在制备用于治疗与RNA病毒的RNA依赖的RNA聚合酶异常有关的疾病的药物中的应用。
技术方案：本发明的通式如式I所示的N4-羟基胞苷衍生物、其药学上可接受的盐、其互变异构体、其立体异构体、其代谢产物、其代谢前体或其前药：
式I中：
R1为氢、
X为O或NH；
R2、R3独立地选自氢、C1-8烷基或
R4、R5可以相同或者不同，并独立地选自氢或氘；
R6、R7、R10、R11独立地氢、羟基、氨基、氰基、C1-8烷基、氰基(C1-8烷基)、氨基(C1-8烷基)、羟基(C1-8烷基)、C1-8烷胺基-C1-8烷基、C1-8烷氧基-C1-8烷基、C1-8烷氧基、C1-8烷巯基、C1-8烷胺基、C2-8烯基、C2-8炔基、C1-12酯基、(C1-12酯基)C1-8烷基、C1-8氨基甲酸酯、C1-8脲基、C1-8酮、未取代的或R6-1取代的C3-10环烷基、未取代的或R6-2取代的杂芳基、未取代的或R6-3取代的杂环烷基、未取代的或R6-4取代的C3-10环烷基-(C1-6烷基)-、未取代的或R6-5取代的杂芳基-(C1-6烷基)-、未取代的或R6-6取代的杂环烷基-(C1-6烷基)-、未取代的或R6-7取代的C6-10芳基、未取代的或R6-8取代的C6-10芳基-(C1-6烷基)-；其中所述的杂环烷基为“杂原子选自N、O和S中的一种或多种，杂原子数为1-3个的”4-10元杂环烷基；所述的杂芳基为“杂原子选自N、O和S中的一种或多种，杂原子数为1-3个的”5-10元杂芳基；
R6-1、R6-3、R6-4和R6-6独立地选自羟基、氰基、氨基、卤素、C1-6的烷基、卤代(C1-6烷基)、羟基(C1-6烷基)、C1-6烷氧基或C1-6烷胺基；
R6-2、R6-5、R6-7和R6-8独立地选自羟基、氰基、卤素、硝基、C1-6的烷基、C2-8烯基、C2-6炔基、C1-6烷氧基、C6-10芳基氧基、杂芳基氧基、(C3-10环烷基)-氧基、卤代(C1-6烷基)、羟基(C1-6烷基)、氨基(C1-6烷基)、C1-6烷胺基-C1-6烷氧基-、C3-10环烷基、C3-10环烷基-(C1-6烷基)-、C3-10环烷基-(C1-6烷氧基)、未取代的或R6-1-1取代的C6-10芳基、C6-10芳基-(C1-6烷基)-、未取代的或R6-1-2取代的C6-10芳基-(C1-6烷氧基)-、杂环烷基、杂环烷基-(C1-6烷基)-、未取代的或R6-1-3取代的杂芳基、杂芳基-(C1-6烷基)-、杂芳基-(C1-6烷氧基)-、-NR6-1-4R6-1-5、-(C＝O)R6-1-6、-(C＝O)NR6-1-7R6-1-8、-NR6-1-9(C＝O)R6-1-10、-(C＝O)OR6-1-11、-O(C＝O)R6-1-12、-(S＝O)2NR6-1- 13R6-1-14、-NR6-1-15(S＝O)2R6-1-16、或-(S＝O)2R6-1-17；
R6-1-1、R6-1-2和R6-1-3独立地选自C1-4烷基、羟基(C1-4烷基)、卤素、氰基、羟基、C1-4烷胺基、C1-4烷氧基或卤代(C1-4烷基)；
R6-1-4～R6-1-17独立地选自氢或C1-4烷基；
R6-9～R6-13独立地选自羟基、氰基、氨基、卤素、C1-6的烷基、卤代(C1-6烷基)、羟基(C1-6烷基)、C1-6烷氧基或C1-6烷胺基；
R6-14和R6-20独立地选自羟基、氰基、卤素、硝基、C1-6的烷基、C2-8烯基、C2-6炔基、C1-6烷氧基、C6-10芳基氧基、杂芳基氧基、(C3-10环烷基)-氧基、卤代(C1-6烷基)、羟基(C1-6烷基)、氨基(C1-6烷基)、C1-6烷胺基-C1-6烷氧基-、C3-10环烷基、C3-10环烷基-(C1-6烷基)-、C3-10环烷基-(C1-6烷氧基)、未取代的或R6-2-1取代的C6-10芳基、C6-10芳基-(C1-6烷基)-、未取代的或R6 -2-2取代的C6-10芳基-(C1-6烷氧基)-、杂环烷基、杂环烷基-(C1-6烷基)-、未取代的或R6-2-3取代的杂芳基、杂芳基-(C1-6烷基)-、杂芳基-(C1-6烷氧基)-、-NR6-2-4R6-2-5、-(C＝O)R6-2-6、-(C＝O)NR6-2-7R6-2-8、-NR6-2-9(C＝O)R6-2-10、-(C＝O)OR6-2-11、-O(C＝O)R6-2-12、-(S＝O)2NR6-2-13R6 -2-14、-NR6-2-15(S＝O)2R6-2-16、或-(S＝O)2R6-2-17；
R6-2-1、R6-2-2和R6-2-3独立地选自C1-4烷基、羟基(C1-4烷基)、卤素、氰基、羟基、C1-4烷胺基、C1-4烷氧基或卤代(C1-4烷基)；
R6-2-4～R6-2-17独立地选自氢或C1-4烷基；
特别地，R10和R11可以与它们相连的氮原子一起形成未取代或R6-3取代的杂环烷基；
特别地，R10和R11也可以与它们相连的氮原子一起形成未取代或R6-2取代的杂芳基；
R8选自-NR10R11或C1-10烷基；
R9为C1-10烷基；
进一步地，在式I各部分的上述定义中，各部分的优选基团如下：
R1优先定义为
其中，
选自以下基团：
其中U1选自氢、羟基、卤素、甲基、乙基、异丙基、叔丁基、三氟甲基、甲氧基、三氟甲氧基或羟甲基；
U2选自氢、羟基、氨基、卤素、甲基、乙基、异丙基、叔丁基、三氟甲基、甲氧基、三氟甲氧基、酯基、羧基、硝基、氰基、苯氧基或羟甲基；
R2、R3选自以下基团：
R4、R5优选为氘；
进一步地，所述的如式I所示化合物为以下任一化合物：
上述的N4-羟基胞苷衍生物、其药学上可接受的盐、其互变异构体、其立体异构体、其代谢产物、其代谢前体或其前药的制备方法，所述制备方法为以下任一方法：
方法一：原料S1与三甲基氯硅烷、三乙胺反应，得到羟基被三甲基硅基保护的中间体，该中间体与三氯氧磷、1,2,4-三氮唑反应得到得到脱水后的产物，再用酸脱去三甲基硅基，得到化合物S2；化合物S2与2,2-二甲氧基丙烷在浓硫酸催化下得到化合物S3；化合物S3与对应的异氰酸酯反应得到化合物S4；化合物S4与盐酸羟胺在三乙胺作用下反应得到化合物S5；酸性条件下脱去羟基保护基得到终产物I-I。
方法二：化合物S3与对应的磷酸酯在氯化镁和碱性条件下反应得到化合物S6；化合物S6与盐酸羟胺反应得到化合物S7；酸性条件下脱去羟基保护基得到终产物I-II。
方法三：化合物S3与对应的酰氯反应得到化合物S8；化合物S8与盐酸羟胺反应得到化合物S9；酸性条件下脱去羟基保护基得到终产物I-III。
方法四：化合物S2与对应的酰氯反应得到化合物S10；化合物S10与盐酸羟胺反应得到终产物I-IV。
上述N4-羟基胞苷衍生物作为RNA依赖的RNA聚合酶抑制剂的应用。
包含上述的N4-羟基胞苷类化合物、其药学上可接受的盐、其互变异构体、其立体异构体、其代谢产物、其代谢前体或其前药以及药学上可接受的载体的药物组合物；在所述的药物组合物中，拟肽类化合物、其药学上可接受的盐、其互变异构体、其立体异构体、其代谢产物、其代谢前体或其前药的用量可为治疗有效量。
上述N4-羟基胞苷类化合物、其药学上可接受的盐、其互变异构体、其立体异构体、其代谢产物、其代谢前体或其前药、上述的药物组合物在制备用于治疗与RNA病毒的RNA依赖的RNA聚合酶抑制剂异常有关的疾病的药物中的应用；
其中，与RNA病毒的RNA依赖的RNA聚合酶抑制剂异常有关的疾病为病毒感染疾病；所述病毒感染为SARS-CoV、HBV、HCV、H1N1、Ebola、SARS-CoV-2中的一种或多种。上述的药物组合物在制备药物或疫苗佐剂中的应用，所述的药物为用于治疗病毒感染的药物；所述的疫苗佐剂为用于治疗病毒感染的疫苗佐剂；
有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下显著优点：(1)该类小分子及其衍生物对RNA病毒的RNA依赖的RNA聚合酶具有高效的抑制活性；(2)该类N4-羟基胞苷类化合物及其衍生物和药物组合物应用广泛，可制备为治疗/预防SARS-CoV、HBV、HCV、H1N1、Ebola或SARS-CoV-2病毒感染疾病的药物，IC50值最优可达到纳摩尔浓度级别；(3)化合物制备方法易操作，反应底物适用性广。
具体实施方式
下面对本发明的技术方案作进一步说明。
实施例1：化合物1的合成
((2R,3S,4R,5R)-3,4-二羟基-5-(4-(羟基亚氨基)-2-氧代-3,4-二氢嘧啶-1(2H)-基-5-d)四氢呋喃-2-基)甲基苯基氨基甲酸酯
步骤一：合成化合物1-1
取尿苷(5.4g,22.1mmol)溶于重水(50mL)中，加入钯碳(500mg)，氢气置换三次，160℃反应24h。硅藻土过滤，减压除去溶剂，得粗品化合物1-2(5.2g，96％)。1H NMR(300MHz,CD3OD)：δ7.76(s,1H),5.89(d,J＝4.2Hz,1H),4.17–4.12(m,2H),4.01–3.96(m,1H),3.84(dd,J＝12.3,2.8Hz,1H),3.72(dd,J＝12.3,3.5Hz,1H).
步骤二：合成化合物1-3
取化合物1-2(5.0g，20.5mmol)溶于丙酮(150mL)中，缓慢滴入2,2-二甲氧基丙烷(12.6mL，102.5mmol)，搅拌10min后，缓慢滴入浓硫酸(1.5mL，26.7mmol)，室温搅拌30min后，缓慢加入碳酸氢钠溶液(2.5g碳酸氢钠溶于20mL水)淬灭，搅拌10min后，减压除去溶剂，用乙酸乙酯(50mL)萃取，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，得粗品化合物1-3(5.5g，95％)，直接用于下一步。1H NMR(300MHz,Chloroform-d1)：δ7.60(s,1H),5.82(d,J＝5.7Hz,1H),4.66–4.61(m,2H),3.78–3.69(m,3H),1.25(s,6H).
步骤三：合成化合物1-4
取化合物1-3(5.0g，17.6mmol)溶于无水二氯甲烷(50mL))中，0℃下滴加三乙胺(4.9mL，35.2mmol)，搅拌10min后，再缓慢滴加苯基异氰酸酯(2.3mL，19.4mmol)，室温反应4h。停止反应，加入饱和氯化铵溶液(20mL)淬灭，用乙酸乙酯(50mL×3)萃取，饱和食盐水(50mL)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，制砂，柱层析纯化(PE：EA＝4：1)得到白色固体化合物1-4(5.0g，81％)。1H NMR(300MHz,Chloroform-d1)：δ7.48–7.41(m,3H),7.36–7.30(m,2H),7.11(dd,J＝6.6,3.1Hz,1H),6.12(d,J＝4.6Hz,1H),5.08–5.01(m,1H),4.55(dd,J＝8.5,4.0Hz,1H),4.21–4.17(m,2H),4.00–3.94(m,1H),1.24(s,6H).
步骤四：合成化合物1-5
取化合物1,2,4-三唑(1.7g，24.8mmol)溶于无水乙腈(100mL)中，氮气置换三次，室温下搅拌30min后，移至0℃下，缓慢滴加三氯氧磷(2.3mL，24.8mmol)后搅拌2h，再缓慢滴加三乙胺(5.2mL，37.2mmol)，维持0℃继续搅拌1h，升温至室温，将溶于无水乙腈(50mL)的化合物1-4(5.0g，12.4mmol)缓慢滴加进反应液，室温搅拌过夜。停止反应，加入饱和氯化铵溶液(50mL)淬灭，用二氯甲烷(150mL×3)萃取，饱和食盐水(150mL)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，制砂，柱层析纯化(DCM：MeOH＝50：1)得到白色固体化合物S4(3.6g，64％)。1HNMR(300MHz,Chloroform-d1)：δ8.14–8.11(m,2H),7.49–7.42(m,3H),7.38–7.31(m,2H),7.12(dd,J＝6.5,3.0Hz,1H),6.10(d,J＝4.7Hz,1H),5.08–5.04(m,1H),4.61(dd,J＝8.8,4.1Hz,1H),4.25–4.19(m,2H),4.02–3.97(m,1H),1.24(s,6H).
步骤五：合成化合物1-6
取化合物1-5(3g，6.6mmol)、盐酸羟胺(551mg，8.0mmol)溶于二氯甲烷中(50mL)，0℃下缓慢滴加三乙胺(2.3mL，16.5mmol)，室温反应3h，停止反应，加入饱和氯化铵溶液(20mL)，用二氯甲烷(50mL×3)萃取，饱和食盐水(50mL)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，制砂，柱层析纯化(DCM：MeOH＝50：1)得到白色固体化合物1-6(2.2g，82％)。1H NMR(500MHz,Chloroform-d)δ7.66(s,1H),7.52–7.46(m,2H),7.35–7.28(m,2H),7.08(tt,J＝7.0,1.2Hz,1H),6.37(d,J＝7.3Hz,1H),4.92(td,J＝3.7,0.8Hz,1H),4.56(ddd,J＝4.8,3.9,0.8Hz,1H),4.49–4.42(m,1H),4.33–4.21(m,2H),1.38(s,2H).
步骤六：合成化合物1
将化合物1-6(2g，4.8mmol)溶于甲醇(20mL)中，0℃下缓慢滴加氯化氢的甲醇溶液(12mL，48mmol)，室温搅拌过夜。反应结束后，减压除去溶剂，加入乙醚(20mL)，搅拌30min后，吸出溶液，得粗品(1.2g)，将粗品制砂，柱层析纯化(DCM：MeOH＝10：1)得到白色固体化合物1(1.0g，55％)。1H NMR(300MHz,Chloroform-d1)：δ7.54–7.46(m,3H),7.35–7.28(m,2H),7.08(tt,J＝7.0,1.2Hz,1H),6.36(d，J＝7.3Hz，1H)，4.33–4.26(m，1H),4.29–4.16(m，3H),4.05(dtt,J＝8.0,4.4,0.8Hz,1H).MS(EI,m/z)：379(M++1).
采用实施例1的合成方法，可以合成化合物(I-I)：
具体合成的化合物如表1所示。
表1使用实施例1的合成方法合成的化合物
实施例2：化合物17的合成
2-乙基丁基(((((2R,3S,4R,5R)-3,4-二羟基-5-(4-(羟基亚氨基)-2-氧代-3,4-二氢嘧啶-1-(2H)-基)四氢呋喃-2-基-5-D)甲氧基)(2-(十六烷氧基)乙氧基)磷酰基)-L-丙氨酸酯(17)
步骤一：合成化合物2-2
在0℃，向乙二醇(72.3mL,1.0mol)的DMF(500mL)溶液中缓慢加入12克氢化钠(60％)，再加入碘化钠(14.9g,0.1mol)，升温至室温搅拌1小时后，在0℃加入化合物2-1(30.5mL,0.1mol)后升温至80℃，搅拌8小时，TLC检测反应完全，冷却至0℃，用饱和氯化铵淬灭反应，减压浓缩除去DMF，加入水和乙酸乙酯，分层，水相用乙酸乙酯萃取，合并有机相，用饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，柱层析得化合物2-2(23.2g,81％)。1H NMR(300MHz,Chloroform-d1)：δ3.72(dt,J＝6.7,2.3Hz,2H),3.52(t,J＝6.6Hz,2H),3.33(t,3.4Hz,2H),1.52–1.45(m,4H),1.28–1.20(m,24H),0.94(t,J＝1.7Hz,3H).
步骤二：合成化合物2-5
在氩气保护下，在0℃，向化合物2-2(20g，69.9mmol)的无水二氯甲烷(200mL)溶液中缓慢滴加三乙胺(9.7mL,69.9mmol)，搅拌30min，降温至-78℃，向其中缓慢滴加三氯氧磷(6.5mL,69.9mmol)，升温至0℃反应3小时，TLC检测反应完全，冷却至-78℃，向其中滴加L-丙氨酸-2-乙基丁基酯盐酸盐(11.7g,55.9mmol)的二氯甲烷(75mL)溶液，再缓慢滴加三乙胺(15.4mL,111.8mmol)，升温至0℃反应3小时，TLC检测反应完全，向其中滴加对硝基苯酚(7.7g,55.9mmol)的二氯甲烷(75mL)溶液，再缓慢滴加三乙胺(7.77mL,55.9mmol)，升温至室温反应2小时，TLC检测反应完全，冷却至0℃，用饱和氯化铵淬灭反应，分层，水相用DCM萃取，合并有机相，用饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，柱层析得化合物2-5(25.9g,72％)。1H NMR(300MHz,Chloroform-d1)：δ8.19(d,J＝4.3Hz,2H),7.30(d,J＝4.1Hz,2H),4.33–4.24(m,4H),3.70(t,J＝6.5Hz,2H),3.56(dq,J＝8.3,2.2Hz,1H),3.34(t,J＝2.5Hz，2H),1.88–1.81(m，1H),1.51–1.42(m，4H)，1.28–1.16(m,31H),1.00(t,J＝1.6Hz,6H),0.78(t,J＝0.9Hz,3H).
步骤三：合成化合物2-6
在氩气保护下，在室温下，向化合物2-5(7.0g,10.9mmol)、核糖碱基(3.0g,9.1mmol)和无水氯化镁(1.7g,18.1mmol)的乙腈(50mL)溶液中滴加N,N-二异丙基乙胺(7.5mL,45.3mmol)，升温至50摄氏度反应2小时，TLC检测反应完全，冷却至0℃，用饱和氯化铵淬灭反应，减压浓缩除去乙腈，加入水和乙酸乙酯，分层，水相用乙酸乙酯萃取，合并有机相，用饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，柱层析得化合物2-6(5.9g,78％)。1HNMR(300MHz,Chloroform-d1)：δ8.79(s,1H),7.99(s,1H),7.31(s,1H),6.53(d,J＝8.3Hz,1H),6.11(d,J＝2.7Hz,1H),4.69–4.60(m,2H),4.32–4.21(m,5H),4.05–3.98(m,2H),3.70(t,J＝6.8Hz,2H),3.58(dq,J＝8.2,2.0Hz,1H),3.34(t,J＝2.8Hz,2H),1.90–1.84(m,1H),1.52–1.44(m,4H),1.28–1.16(m,37H),1.02(t,J＝1.5Hz,6H),0.78(t,J＝1.3Hz,3H).
步骤四：合成化合物2-7
取化合物2-6(5.5g，6.5mmol)、盐酸羟胺(682mg，9.8mmol)溶于二氯甲烷中(100mL)，0℃下缓慢滴加三乙胺(2.3mL，16.5mmol)，室温反应3h，停止反应，加入饱和氯化铵溶液(40mL)，用二氯甲烷(100mL×3)萃取，饱和食盐水(100mL)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，制砂，柱层析纯化得到白色固体化合物2-7(2.8g，54％)。1H NMR(300MHz,Chloroform-d1)：δ8.88(d,J＝4.8Hz,1H),6.13(s,1H),4.68–4.59(m,2H),4.31–4.20(m,5H),4.01–3.94(m,2H),3.70(t,J＝6.4Hz,2H),3.56(dq,J＝8.8,2.2Hz,1H),3.30(t,J＝2.9Hz,2H),1.91–1.86(m,1H),1.55–1.45(m,4H),1.29–1.14(m,37H),0.99(t,J＝1.7Hz,6H),0.73(t,J＝1.1Hz,3H).
步骤五：合成化合物17
将化合物2-7(2.5g，3.1mmol)溶于甲醇(20mL)中，0℃下缓慢滴加氯化氢的甲醇溶液(7.8mL，31mmol)，室温搅拌过夜。反应结束后，减压除去溶剂，加入乙醚(20mL)，搅拌30min后，吸出溶液，得粗品(1.9g)，将粗品制砂，柱层析纯化(DCM：MeOH＝10：1)得到白色固体化合物17(1.2g，52％)。1H NMR(300MHz,Chloroform-d1)：δ8.87(d,J＝4.2Hz,1H),6.11(s,1H),4.67–4.54(m,2H),4.32–4.21(m,5H),4.00–3.92(m,2H),3.71(t,J＝6.2Hz,2H),3.53(dq,J＝8.2,1.9Hz,1H),3.32(t,J＝2.3Hz,2H),1.89–1.85(m,1H),1.56–1.43(m,4H),1.29–1.18(m,31H),1.02(t,J＝1.9Hz,6H),0.74(t,J＝1.3Hz,3H).MS(EI,m/z)：763(M++1).
采用实施例2的合成方法，可以合成化合物(I-II)：
具体合成的化合物如表2所示。
表2使用实施例2的合成方法合成的化合物
实施例3：化合物18的合成
((2R,3S,4R,5R)-3,4-二羟基-5-(4-(羟基亚氨基)-2-氧代-3,4-二氢嘧啶-1(2H)-基-5-d)四氢呋喃-2-基)异丁酸甲酯
步骤一：合成化合物3-2
在氩气保护下，将化合物1-2(5.0g,20.5mmol)溶解于无水乙腈(164mL)中，依次缓慢加入三乙胺(42.7mL,307.5mmol)和三甲基氯硅烷(13.0mL,102.5mmol)，在室温下搅拌1h后冷却至0℃，加入三氯氧磷(3.7mL,41.0mmol)，搅拌10min后，缓慢加入1,2,4-三氮唑(14.2g,205.0mmol)，维持0℃搅拌1h后移至室温搅拌3h。反应完全后将该混合物倒入三乙胺磷酸盐缓冲溶液中(pH＝7，0.5M)，用二氯甲烷(150mL×3)萃取，饱和食盐水(100mL)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩。向浓缩液中加入4：1(v/v)的MeOH：AcOH溶液，室温下搅拌过夜，过滤，滤饼用乙醚洗涤，减压干燥得到白色固体3-2(5.0g,83％)。1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ9.46(s,1H),8.85(d,J＝7.2Hz,1H),8.42(s,1H),6.98(s,1H),5.67(d,J＝4.8Hz,1H),5.28(t,J＝4.9Hz,1H),5.08(d,J＝5.7Hz,1H),4.08–4.02(m,1H),4.01–3.94(m,2H),3.86–3.76(m,1H),3.69–3.60(m,1H).
步骤二：合成化合物3-3
在氩气保护下，将化合物3-2(5.0g,16.9mmol)溶于无水乙腈(120mL)中，依次加入2,2-二甲氧基丙烷(4.2mL,33.8mmol)和浓硫酸(46.4μL)，室温搅拌30min，反应完全后减压除去溶剂，向浓缩液中加入MeOH(100mL)，室温搅拌30min，过滤得到白色固体3-3(3.9g,70％)。1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ9.46(s,1H),8.58(d,J＝7.3Hz，1H)，8.41(s，1H),6.97(s，1H)，4.90(dd，J＝6.2，2.0Hz，1H)，4.75(dd,J＝6.2,2.8Hz,1H),4.32(q,J＝4.0Hz,1H),3.68(dd,J＝11.9,3.9Hz,1H),3.58(dd,J＝11.9,4.7Hz,1H),1.50(s,3H),1.30(s,3H).
步骤三：合成化合物3-4
在氩气保护下，将化合物3-3(3.5g,10.4mmol)溶于吡啶(50mL)中，冰水浴下缓慢滴加异丁酰氯(1.64mL,15.6mmol),室温反应8h。待反应完全后，减压除去溶剂，用乙酸乙酯(100mL×3)萃取，饱和食盐水(100mL)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，制砂，柱层析纯化得到白色固体化合物3-4(3.1g,74％)。1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ9.45(s,1H),8.56(d,J＝7.4Hz,1H),8.42(s,1H),6.99(s,1H),4.91(dd,J＝6.2,2.0Hz,1H),4.75(dd,J＝6.2,2.4Hz,1H),4.32(q,J＝4.2Hz,1H),3.68(dd,J＝11.4,3.1Hz,1H),3.55(dd,J＝11.5,4.3Hz,1H),2.53–2.48(m,1H),1.49(s,3H),1.32(s,3H),1.14(dd,J＝8.4,3.1Hz,6H).
步骤四：合成化合物3-5
将化合物3-4(2.2g,5.4mmol)溶于异丙醇(20mL)中，依次加入盐酸羟胺(565mg，8.1mmol)和三乙胺(1.3mL，9.7mmol)，室温搅拌1h，减压除去溶剂，加入乙酸乙酯(50mL)，用水(25mL)和饱和食盐水(25mL)洗涤，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，柱层析得到产物3-5(1.3g，67％)。1H NMR(300MHz,Chloroform-d1)：δ8.32(s,1H),6.00–5.94(m,1H),5.21–5.16(m,1H),4.65(dd,J＝6.3,2.4Hz),4.31(q,J＝4.0Hz,1H),3.64(dd,J＝11.6,3.5Hz,1H),3.55(dd,J＝11.5,4.3Hz,1H),2.53–2.48(m,1H),1.49(s,3H),1.32(s,3H),1.14(dd,J＝8.4,3.1Hz,6H).
步骤五：合成化合物18
将化合物3-5(1.0g,2.7mmol)溶于甲酸(10mL)中，室温搅拌6h，TLC检测反应完成后，减压除去溶剂，柱层析得到化合物18(481mg,54％)。1H NMR(300MHz，Methanol-d4)δ8.32(s,1H)，6.01–5.94(m，1H)，5.25–5.18(m,1H),4.65(dd,J＝6.4,2.4Hz),4.32(q,J＝4.0Hz,1H),3.64(dd,J＝11.6，3.2Hz,1H),3.57(dd，J＝11.7,4.3Hz,1H),2.53–2.47(m,1H),1.13(dd,J＝8.4,3.1Hz,6H).MS(EI,m/z)：331(M++1).
采用实施例3的合成方法，可以合成化合物(I-III)：
具体合成的化合物如表3所示。
表3使用实施例3的合成方法合成的化合物
实施例4：合成化合物22
(2R,3R,4R,5R)-2-(4-(羟基氨基)-2-氧代嘧啶-1(2H)-基-5-d)-5-((异丁酰氧基)甲基)四氢呋喃-3,4-二基双(2-甲基丙酸酯)
步骤一：合成化合物4-2
在氩气保护下，将化合物3-2(1.2g,4.1mmol)溶于吡啶(20mL)中，冰水浴下缓慢滴加异丁酰氯(1.7mL,16.4mmol),室温反应8h。待反应完全后，减压除去溶剂，用乙酸乙酯(100mL×3)萃取，饱和食盐水(100mL)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，制砂，柱层析纯化得到白色固体化合物4-4(1.3g,65％)。1H NMR(300MHz,Chloroform-d1)δ8.32(s,1H),8.11(s,1H),8.09(s,1H),6.45–6.38(m,1H),6.24(dd,J＝6.4,2.2Hz,1H),5.59–5.52(m,2H),4.32(q,J＝4.1Hz,1H),3.94(dd,J＝10.5,3.0Hz,1H),2.53–2.47(m,3H),1.13–1.05(m,18H).
步骤二：合成化合物22
将化合物4-2(1.0g,1.9mmol)溶于异丙醇(20mL)中，依次加入盐酸羟胺(275mg，3.8mmol)和三乙胺(0.6mL，4.6mmol)，室温搅拌1h，减压除去溶剂，加入乙酸乙酯(50mL)，用水(25mL)和饱和食盐水(25mL)洗涤，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，柱层析得到产物22(687mg，77％)。1H NMR(300MHz,Chloroform-d1)δ8.32(s,1H),6.44–6.37(m,1H),6.25(dd,J＝6.7,2.1Hz,1H),5.58–5.52(m,2H),4.30(q,J＝4.1Hz,1H),3.94(dd,J＝10.8,3.1Hz,1H),2.54–2.47(m,3H),1.15–1.04(m,18H).MS(EI,m/z)：471(M++1).
采用实施例4的合成方法，可以合成化合物(I-IV)：
具体合成的化合物如表4所示。
表4使用实施例4的合成方法合成的化合物
实施例5：片剂制备
将实施例1中制得的化合物1(50g)、羟丙甲基纤维素E(150g)、淀粉(200g)、聚维酮(适量)和硬脂酸镁(1g)混合，制粒，压片。
此外，可以根据药典2015版常规制剂法，将实施例1-2制得的化合物赋予不同的药物辅料制成胶囊剂、散剂、颗粒剂、丸剂、注射剂、糖浆剂、口服液、吸入剂、软膏剂、栓剂或贴剂等。
实施例6：药物处理CPE观察
检测试剂：SARS-CoV-2病毒(代次：P6；滴度：2×105TCID50/mL)、Madin-Darby犬肾(MDCK)细胞得自ATCC，流感A/Hawaii/70/2019(H1N1)、流感A/Hong Kong/45/2019(H3N2)由国家流感中心提供病毒、DMEM基础培养基(Gibco)、胎牛血清(Gibco)、青霉素-链霉素双抗(Bioind)、0.25％胰酶-EDTA。
试验操作：
1)接种细胞：取处于对数生长期的Vero-E6细胞，使用使用0.25％胰酶-EDTA消化细胞，细胞计数，获得细胞密度为：1×106个/mL的细胞悬液；取上述细胞4mL，加入完全培养基(DMEM with 10％FBS)6mL，制备得到细胞密度为4×105个/mL的细胞悬液，接种到96孔板中，每孔100μL，每孔细胞数4×104个。放入37℃二氧化碳培养箱中持续培养过夜。
2)细胞药物预处理：病毒感染前，使用维持培养基(DMEM with 2％FBS)稀释药物至相应浓度，每孔加入100μL含有相应浓度药物的培养基，放入37℃二氧化碳培养箱中持续培养1小时。
3)测试药物稀释：每孔加入2倍终浓度稀释药物60μL，同时设置细胞对照，加入维持培养基120μL；病毒对照，加入维持培养基60μL。
4)病毒稀释：病毒储存液滴度为2.5×105TCID50/mL，取病毒储存液200μL，加入25mL维持培养基，充分混匀，将病毒稀释至100TCID50/50μL。
5)滴加病毒：垂直悬滴病毒(细胞对照除外)至96孔板内，加样体积60μL/孔，最终病毒-药物混合液120μL。
6)将加好的病毒-抗体在震荡器上混匀后，吸去接种有细胞的培养板上清液(100μL)，随后将病毒-药物混合液吸取100μL/孔加入其中。
7)根据细胞病变观察药物抗病毒能力：将细胞放入37℃CO2培养箱中持续培养48小时，使用倒置显微镜观察细胞病变，记录、统计分析结果。
8)接种细胞：取处于对数生长期的Huh 7细胞，使用0.25％胰酶-EDTA消化细胞，接种于孔板中。
9)药物处理：使用通式I的化合物分别处理Huh 7细胞，药物处理浓度为20μM。
10)收集细胞：48小时后收集细胞，Western blot检测蛋白表达。
结果显示，1-75化合物相对于对照组对SARS-CoV-2感染的Vero E6细胞能较好的抑制细胞病变的情况发生。证明1-75化合物对SARS-CoV-2有一定的抑制作用。
实施例7：抗流感病毒实验
1)细胞与病毒株：Madin-Darby犬肾(MDCK)细胞得自ATCC，流感A/Hawaii/70/2019(H1N1)、流感A/Hong Kong/45/2019(H3N2)由国家流感中心提供
2)实验过程
将MDCK细胞接种于96孔板中，每孔细胞数为2×105/mL，待细胞长成单层后，感染一定数量的病毒(100TCID50)，在37℃下吸附2h后，用MEM进行冲洗，换上不同浓度梯度的小分子化合物(0-500μg/mL)的维持液，在37℃，5％的二氧化碳的环境下进行孵育，同时设不含受试小分子化合物的病毒对照组和正常细胞对照组。当病毒对照组的细胞病变(CPE)达到4+时，观察并记录各组的CPE结果。抗病毒的活性采用Reed&Muench方法计算，EC50＝Antilog[A+(50-B)/(C-B)×D]，其中A：log＜50％累加抑制剂的药物浓度；B：＜50％累加抑制率；C：＞50％累加抑制率；D：log稀释倍数。
实施例8：抗SARS-CoV-2病毒实验
1)细胞与病毒株
非洲绿猴肾细胞(Vero E6)得自ATCC，2019BetaCoV/Wuhan/WIV04/2019由中国科学院武汉病毒所分离得到
2)实验过程
将Vero E6细胞种于96孔板中，每孔3×105个细胞，在37℃，5％的二氧化碳的培养箱中过夜培养。待细胞长成单层后，用PBS洗涤一次，加入SARS-CoV-2病毒(MOI＝0.03)，吸附2h后弃病毒液，用PBS洗3次后加入含有梯度稀释的小分子化合物的2％低熔点琼脂糖-DMEM(4％FBS)培养基。在37℃，5％的二氧化碳的培养箱中培养4天后采用4％的多聚甲醛固定15min，清洗3次，加入0.8％结晶紫染色10min，清洗三次并烘干。采用酶联荧光斑点分析仪(CTL，Immunospot S6 Universal)进行图片采集并对噬斑进行统计。根据噬斑数绘制剂量反应曲线，计算半数有效浓度EC50。
细胞毒性实验
取处于指数生长期的MDCK细胞和Vero细胞种在96孔板上，每孔2×104个细胞，然后给予受试小分子化合物，质量浓度范围为0-2000μg/mL，在37℃，5％的二氧化碳的培养箱中培养2天。MDCK细胞和Vero细胞的毒性试验采用CPE法，受试小分子化合物对细胞的半数细胞毒性浓度CC50采用Reed&Muench方法计算，CC50＝Antilog[A+(50-B)/(C-B)×D]，其中A：log＜50％累加抑制剂的药物浓度；B：＜50％累加抑制率；C：＞50％累加抑制率；D：log稀释倍数。
表5为本发明化合物对SARS-CoV-2病毒的活性和细胞毒性结果：
其中，SI＝CC50/EC50；
A：EC50<1μM,B：EC50＝10μM-1μM,C：EC50＞10μM；
α：SI＞50,β：SI＝1-50,γ：SI<1；
表5化合物1-75对SARS-CoV-2的活性和细胞毒性
上述细胞实验证明本发明化合物可以有效地抑制SARS-CoV-2病毒，对其他RNA病毒可能也有相同的结果，该系列化合物能够应用在制备抗RNA病毒药物中。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种如通式I所示的N4-羟基胞苷衍生物、其药学上可接受的盐、其互变异构体、其立体异构体、其代谢产物、其代谢前体或其前药：
式I中：
R1为氢、
X为O或NH；
R2、R3独立地选自氢、C1-8烷基或
R4、R5可以相同或者不同，并独立地选自氢或氘；
R6、R7、R10、R11独立地氢、羟基、氨基、氰基、C1-8烷基、氰基(C1-8烷基)、氨基(C1-8烷基)、羟基(C1-8烷基)、C1-8烷胺基-C1-8烷基、C1-8烷氧基-C1-8烷基、C1-8烷氧基、C1-8烷巯基、C1-8烷胺基、C2-8烯基、C2-8炔基、C1-12酯基、(C1-12酯基)C1-8烷基、C1-8氨基甲酸酯、C1-8脲基、C1-8酮、未取代的或R6-1取代的C3-10环烷基、未取代的或R6-2取代的杂芳基、未取代的或R6-3取代的杂环烷基、未取代的或R6-4取代的C3-10环烷基-(C1-6烷基)-、未取代的或R6-5取代的杂芳基-(C1-6烷基)-、未取代的或R6-6取代的杂环烷基-(C1-6烷基)-、未取代的或R6-7取代的C6-10芳基、未取代的或R6-8取代的C6-10芳基-(C1-6烷基)-；其中所述的杂环烷基为“杂原子选自N、O和S中的一种或多种，杂原子数为1-3个的”4-10元杂环烷基；所述的杂芳基为“杂原子选自N、O和S中的一种或多种，杂原子数为1-3个的”5-10元杂芳基；
R6-1、R6-3、R6-4和R6-6独立地选自羟基、氰基、氨基、卤素、C1-6的烷基、卤代(C1-6烷基)、羟基(C1-6烷基)、C1-6烷氧基或C1-6烷胺基；
R6-2、R6-5、R6-7和R6-8独立地选自羟基、氰基、卤素、硝基、C1-6的烷基、C2-8烯基、C2-6炔基、C1-6烷氧基、C6-10芳基氧基、杂芳基氧基、(C3-10环烷基)-氧基、卤代(C1-6烷基)、羟基(C1-6烷基)、氨基(C1-6烷基)、C1-6烷胺基-C1-6烷氧基-、C3-10环烷基、C3-10环烷基-(C1-6烷基)-、C3-10环烷基-(C1-6烷氧基)、未取代的或R6-1-1取代的C6-10芳基、C6-10芳基-(C1-6烷基)-、未取代的或R6-1-2取代的C6-10芳基-(C1-6烷氧基)-、杂环烷基、杂环烷基-(C1-6烷基)-、未取代的或R6-1-3取代的杂芳基、杂芳基-(C1-6烷基)-、杂芳基-(C1-6烷氧基)-、-NR6-1-4R6-1-5、-(C＝O)R6-1-6、-(C＝O)NR6-1-7R6-1-8、-NR6-1-9(C＝O)R6-1-10、-(C＝O)OR6-1-11、-O(C＝O)R6-1-12、-(S＝O)2NR6-1-13R6 -1-14、-NR6-1-15(S＝O)2R6-1-16、或-(S＝O)2R6-1-17；
R6-1-1、R6-1-2和R6-1-3独立地选自C1-4烷基、羟基(C1-4烷基)、卤素、氰基、羟基、C1-4烷胺基、C1-4烷氧基或卤代(C1-4烷基)；
R6-1-4～R6-1-17独立地选自氢或C1-4烷基；
R6-9～R6-13独立地选自羟基、氰基、氨基、卤素、C1-6的烷基、卤代(C1-6烷基)、羟基(C1-6烷基)、C1-6烷氧基或C1-6烷胺基；
R6-14和R6-20独立地选自羟基、氰基、卤素、硝基、C1-6的烷基、C2-8烯基、C2-6炔基、C1-6烷氧基、C6-10芳基氧基、杂芳基氧基、(C3-10环烷基)-氧基、卤代(C1-6烷基)、羟基(C1-6烷基)、氨基(C1-6烷基)、C1-6烷胺基-C1-6烷氧基-、C3-10环烷基、C3-10环烷基-(C1-6烷基)-、C3-10环烷基-(C1-6烷氧基)、未取代的或R6-2-1取代的C6-10芳基、C6-10芳基-(C1-6烷基)-、未取代的或R6-2-2取代的C6-10芳基-(C1-6烷氧基)-、杂环烷基、杂环烷基-(C1-6烷基)-、未取代的或R6-2-3取代的杂芳基、杂芳基-(C1-6烷基)-、杂芳基-(C1-6烷氧基)-、-NR6-2-4R6-2-5、-(C＝O)R6-2-6、-(C＝O)NR6 -2-7R6-2-8、-NR6-2-9(C＝O)R6-2-10、-(C＝O)OR6-2-11、-O(C＝O)R6-2-12、-(S＝O)2NR6-2-13R6-2-14、-NR6-2-15(S＝O)2R6-2-16、或-(S＝O)2R6-2-17；
R6-2-1、R6-2-2和R6-2-3独立地选自C1-4烷基、羟基(C1-4烷基)、卤素、氰基、羟基、C1-4烷胺基、C1-4烷氧基或卤代(C1-4烷基)；
R6-2-4～R6-2-17独立地选自氢或C1-4烷基；
特别地，R10和R11可以与它们相连的氮原子一起形成未取代或R6-3取代的杂环烷基；
特别地，R10和R11也可以与它们相连的氮原子一起形成未取代或R6-2取代的杂芳基；
R8选自-NR10R11或C1-10烷基；
R9为C1-10烷基。
2.根据权利要求1所述的N4-羟基胞苷衍生物、其药学上可接受的盐、其互变异构体、其立体异构体、其代谢产物、其代谢前体或其前药，其特征在于：
R1优先定义为
其中，
选自以下基团：
其中U1选自氢、羟基、卤素、甲基、乙基、异丙基、叔丁基、三氟甲基、甲氧基、三氟甲氧基或羟甲基；
U2选自氢、羟基、氨基、卤素、甲基、乙基、异丙基、叔丁基、三氟甲基、甲氧基、三氟甲氧基、酯基、羧基、硝基、氰基、苯氧基或羟甲基；
R2、R3选自以下基团：
R4、R5优选为氘。
3.根据权利要求1或2所述的N4-羟基胞苷衍生物、其药学上可接受的盐、其互变异构体、其立体异构体、其代谢产物、其代谢前体或其前药，其特征在于，其结构式为以下化学式之一：
4.根据权利要求1～3所述的N4-羟基胞苷衍生物、其药学上可接受的盐、其互变异构体、其立体异构体、其代谢产物、其代谢前体或其前药的制备方法，所述制备方法为以下任一方法：
方法一：原料尿苷S1与三甲基氯硅烷、三乙胺反应，得到羟基被三甲基硅基保护的中间体，该中间体与三氯氧磷、1,2,4-三氮唑反应得到得到脱水后的产物，再用酸脱去三甲基硅基，得到化合物S2；化合物S2与2,2-二甲氧基丙烷在浓硫酸催化下得到化合物S3；化合物S3与对应的异氰酸酯反应得到化合物S4；化合物S4与盐酸羟胺在三乙胺作用下反应得到化合物S5；酸性条件下脱去羟基保护基得到终产物I-I。
方法二：化合物S3与对应的磷酸酯在氯化镁和碱性条件下反应得到化合物S6；化合物S6与盐酸羟胺反应得到化合物S7；酸性条件下脱去羟基保护基得到终产物I-II。
方法三：化合物S3与对应的酰氯反应得到化合物S8；化合物S8与盐酸羟胺反应得到化合物S9；酸性条件下脱去羟基保护基得到终产物I-III。
方法四：化合物S2与对应的酰氯反应得到化合物S10；化合物S10与盐酸羟胺反应得到终产物I-IV。
5.权利要求1-3中任一所述的N4-羟基胞苷衍生物作为RNA病毒的RNA依赖的RNA聚合酶抑制剂的应用。
6.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含权利要求1-3中任一所述的N4-羟基胞苷衍生物、其药学上可接受的盐、其互变异构体、其立体异构体、其代谢产物、其代谢前体或其前药以及药学上可接受的载体。
7.一种如权利要求1-4中任一所述N4-羟基胞苷衍生物、其药学上可接受的盐、其互变异构体、其立体异构体、其代谢产物、其代谢前体或其前药、或如权利要求5所述的药物组合物在制备用于治疗与RNA病毒的RNA依赖的RNA聚合酶异常有关的疾病的药物中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的与RNA病毒的RNA依赖的RNA聚合酶抑制剂异常有关的疾病为病毒感染疾病。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述病毒为SARS-CoV、HBV、HCV、H1N1、Ebola、SARS-CoV-2中的一种或多种。
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