CN113717872A - 一种筛选高表达fad-gdh重组毕赤酵母菌株的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种筛选高表达FAD‑GDH的重组毕赤酵母菌株的方法。包括如下步骤：通过依次使用Zeocin、G418及G418浓度梯度筛选，以增加重组菌中FAD‑GDH基因拷贝数。首先，利用前期获得的密码子偏好性优化的FAD‑GDH基因片段分别与表达载体pPICZαA、pMD连接，构建重组表达载体pPICZαA‑GDH和pMD‑GDH；然后，将pPICZαA‑GDH电转入毕赤酵母X33构建重组子，使用Zeocin及试管发酵筛选获得毕赤酵母重组菌株X33‑GDH‑2，将其制成感受态；最后将pMD‑GDH电转入X33‑GDH‑2感受态细胞，利用G418浓度梯度平板和试管发酵进行筛选。结果表明，转入pMD‑GDH后100μg/mlG418平板上的转化子X33‑GDH‑2‑1酶活比X33‑GDH‑2提高94％；2000μg/mlG418梯度平板上菌株X33‑GDH‑2‑17酶活最高，比X33‑GDH‑2‑1提高97％。结果表明了依次使用不同筛选标记及浓度梯度策略有助于提高FAD‑GDH的表达量。

Description

一种筛选高表达FAD-GDH重组毕赤酵母菌株的方法
技术领域
本发明涉及酵母菌株筛选的技术领域,更具体的说是涉及一种筛选高表达FAD-GDH的重组毕赤酵母菌株的方法。
背景技术
FAD依赖的葡萄糖脱氢酶(FAD-dependent glucose dehydrogenase，简称FAD-GDH，EC 1.1.99.10)，与葡萄糖氧化酶(glucose oxidase，简称GOD)、吡喃糖脱氢酶、胆碱脱氢酶和甲醇氧化酶同属于GMC氧化还原酶(glucose-methanol-choline-oxidoreductase)家族。它是以FAD为辅基能够在NAD(P)+等存在的情况下催化β-D-葡萄糖生成D-葡萄糖酸-δ-内酯，而D-葡萄糖酸-δ-内酯会自发形成葡萄糖酸。
在目前使用的血糖检测用酶中，葡萄糖氧化酶(GOD)因其能利用氧作为电子受体，样品中氧分压的改变会使检测结果产生误差，而GDH不利用氧作为电子受体，不会产生此种偏差，适用于检测包括静脉血、动脉血、高海拔等氧气含量不同的样本，近年来成为便携式血糖监测系统的研究热点。所以亟需实现FAD-GDH的高效表达。
目前，毕赤酵母P.pastoris已经成为外源表达蛋白的成熟宿主，P.pastoris正筛选标记主要分为抗生素标记和营养缺陷型筛选标记。其中，抗生素标记主要包括由Streptoalloteichus hindustanus中Sh ble基因赋予的博来霉素Zeocin抗性和来源于Tn903转座子的Kan基因赋予的遗传霉素G418抗性。
通常情况下，仅含单个拷贝外源基因的重组菌可能由于转录水平较低而表达量不高。为了提高外源基因在毕赤酵母中的表达水平，研究中通常采用的策略之一是筛选含多拷贝外源基因的重组菌株。然而，在缺乏较强筛选压力的情况下，外源载体转化毕赤酵母自然发生多次单交换重组整合的概率较低，以下两种方法常被用于提高构建多拷贝P.pastoris重组菌株的效率。
(1)高浓度抗生素直接筛选法：含抗生素标记基因的载体转化宿主后，直接使用含较高浓度的抗生素平板进行筛选。尽管可行，但使用该法获得的耐高浓度抗生素克隆子中仅有不足5％的多拷贝重组菌株，且所含外源基因拷贝数超过10的重组子仅约1-2％；可见，使用该方法筛选获得高拷贝重组菌的效率仍然较低。
(2)含不同筛选标记载体多次转化法：将目的基因插入多种含不同筛选标记的重组载体，并依次转化同一宿主实现重组菌中基因拷贝数的增加。Fan等将Thermomyceslanuginosus lipase基因分别克隆至使用His4营养缺陷型筛选和Zeocin抗生素筛选的表达载体，并将其依次转化P.pastoris而成功获得了含较高拷贝的重组菌株。该方法简单实用，但其所构重组菌株中外源基因的拷贝数往往受到毕赤酵母可用筛选标记数量的限制。
因此，在需要筛选含较高拷贝的重组菌时，需要采取或结合其它分子生物学方法。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种方法简单、操作简便，工作量也不大，实验周期短，容易达到预期效果的基于不同抗生素及浓度梯度筛选高表达FAD-GDH重组毕赤酵母菌株的方法。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种筛选高表达FAD-GDH的重组毕赤酵母菌株的方法，具体步骤为：
步骤一：利用前期获得的密码子偏好性优化的FAD-GDH基因片段分别与表达载体pPICZαA、pMD连接，构建重组表达载体pPICZαA-GDH和pMD-GDH；
步骤二：将pPICZαA-GDH电转入毕赤酵母X33构建重组子，使用Zeocin及试管发酵筛选获得毕赤酵母重组菌株X33-GDH-2，将其制成感受态；
步骤三：将pMD-GDH电转入X33-GDH-2感受态细胞，利用G418浓度梯度平板和试管发酵进行筛选。
优选的，所述步骤一中重组质粒pMD-GDH、pPICZαA-GDH的构建具体方法为：
目的基因FAD-GDH连接在pUC57T载体上，3’和5’两端分别有EcoRI和NotI限制性酶切位点，中科院微生物研究所提供的PMD-AOX质粒及pPICZαA质粒也存在这两个酶切位点，将pUC57-GDH和实验室保存的pMD-AOX质粒、pPICZαA分别进行EcoRI和NotI双酶切，酶切产物分别用1％琼脂糖凝胶电泳分离，切胶回收GDH目的基因及pMD空载、pPICZαA空载，得到有相同粘性末端的目的基因GDH和载体。用T4连接酶连接回收产物，连接后的产物转化入大肠杆菌DH5α感受态，对鉴定出的阳性克隆提取质粒进行酶切、测序，比对分析重组质粒构建成功。
优选的，所述步骤二中重组毕赤酵母产FAD-GDH的菌株构建的具体方法为：重组质粒pPICZαA-GDH采用SacI线性化后电转表达宿主Pichia pastoris X33，构建重组菌X33/pMD-GDH，电转条件：4Kv，4-5ms，快速加入1ml预冷的YPDS液体培养基，电转的感受态细胞置于30℃培养箱静置培养2-4h，4000rpm离心5min，弃上清，用1ml过滤除菌的生理盐水洗3次，然后取500μL涂布在终浓度为100μg/mLZeocin的YPD平板上，30℃培养，2-3天后获得阳性转化子；
将阳性转化子挑取单菌落接种于盛有5mlYPCS(含终浓度100μg/mL Zeocin)的试管中，250rpm/min，30℃培养，16h-18h后加甲醇，使甲醇溶液的体积百分浓度为1％，之后24h和48h后均各加相同体积的甲醇诱导，96h培养后毕赤酵母菌经8000r/min离心5min收集上清，测定FAD依赖葡萄糖脱氢酶的活力；
试管发酵水平筛选获得毕赤酵母重组菌株X33-GDH-2将其制成感受态。重组质粒pMD-GDH采用同样的方法电转入感受态菌株X33-GDH-2，然后取500μL涂布在G418终浓度为100μg/ml、200μg/ml、500μg/ml、800μg/ml、1000μg/ml、1500μg/ml、2000μg/ml、3000μg/ml的YPD梯度平板上，30℃培养，3-6天后获得阳性转化子。
优选的，步骤三中高酶活重组毕赤酵母菌株的筛选具体方法为：将阳性转化子挑取单菌落接种于盛装5mlYPCS(含终浓度100μg/mLZeocin)的试管中，250rpm/min，30℃培养，16h-18h后加甲醇，使甲醇溶液的体积百分浓度为1％，之后24h和48h后均各加相同体积的甲醇诱导，96h培养后毕赤酵母菌经8000r/min离心5min收集上清，测定FAD依赖葡萄糖脱氢酶的活力。
具体方法如下：
DCIP反应体系包括终浓度50mM乙酸钠缓冲液，pH 5.5，300μM DCIP和100mM葡萄糖。
具体如下：
1、反应体系3.1ml：底物葡萄糖2.9ml、9×10-3Mol/L DCIP 100μl、酶液100μl；
2、检测520nm处吸光值的变化(吸光值下降)；
3、计算公式：
酶活(U/ml)＝△A×3.1×稀释倍数D/6.9×0.1×3min。
经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明基于不同抗生素及浓度梯度筛选以期增加重组菌中FAD-GDH基因拷贝数，筛选高表达FAD-GDH的重组毕赤酵母菌株的策略有助于提高FAD-GDH在重组毕赤酵母中的表达量进而达到方法简单、操作简便，工作量也不大，实验周期短，容易达到预期效果的目的。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1为本发明的X33-GDH-2和X33-GDH-2-1的酶活对比图。
图2为本发明的X33-GDH-2和X33-GDH-2-1的相对酶活对比图。
图3为本发明的X33-GDH-2-1和X33-GDH-2-17的相对酶活对比图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明实施例公开了一种筛选高表达FAD-GDH的重组毕赤酵母菌株的方法，具体步骤为：
步骤一：利用前期获得的密码子偏好性优化的FAD-GDH基因片段分别与表达载体pPICZαA、pMD连接，构建重组表达载体pPICZαA-GDH和pMD-GDH；
步骤二：将pPICZαA-GDH电转入毕赤酵母X33构建重组子，使用Zeocin及试管发酵筛选获得毕赤酵母重组菌株X33-GDH-2，将其制成感受态；
步骤三：将pMD-GDH电转入X33-GDH-2感受态细胞，利用G418浓度梯度平板和试管发酵进行筛选。
进一步的，所述步骤一中重组质粒pMD-GDH、pPICZαA-GDH的构建具体方法为：
目的基因FAD-GDH连接在pUC57T载体上，3’和5’两端分别有EcoRI和NotI限制性酶切位点，中科院微生物研究所提供的PMD-AOX质粒及pPICZαA质粒也存在这两个酶切位点，将pUC57-GDH和实验室保存的pMD-AOX质粒、pPICZαA分别进行EcoRI和NotI双酶切，酶切产物分别用1％琼脂糖凝胶电泳分离，切胶回收GDH目的基因及pMD空载、pPICZαA空载，得到有相同粘性末端的目的基因GDH和载体。用T4连接酶连接回收产物，连接后的产物转化入大肠杆菌DH5α感受态，对鉴定出的阳性克隆提取质粒进行酶切、测序，比对分析重组质粒构建成功。
进一步的，所述步骤二中重组毕赤酵母产FAD-GDH的菌株构建的具体方法为：重组质粒pPICZαA-GDH采用SacI线性化后电转表达宿主Pichia pastoris X33，构建重组菌X33/pMD-GDH，电转条件：4Kv，4-5ms，快速加入1ml预冷的YPDS液体培养基，电转的感受态细胞置于30℃培养箱静置培养2-4h，4000rpm离心5min，弃上清，用1ml过滤除菌的生理盐水洗3次，然后取500μL涂布在终浓度为100μg/mLZeocin的YPD平板上，30℃培养，2-3天后获得阳性转化子；
将阳性转化子挑取单菌落接种于盛有5mlYPCS(含终浓度100μg/mL Zeocin)的试管中，250rpm/min，30℃培养，16h-18h后加甲醇，使甲醇溶液的体积百分浓度为1％，之后24h和48h后均各加相同体积的甲醇诱导，96h培养后毕赤酵母菌经8000r/min离心5min收集上清，测定FAD依赖葡萄糖脱氢酶的活力；
试管发酵水平筛选获得毕赤酵母重组菌株X33-GDH-2将其制成感受态。重组质粒pMD-GDH采用同样的方法电转入感受态菌株X33-DH-2，然后取500μL涂布在G418终浓度为100μg/ml、200μg/ml、500μg/ml、800μg/ml、1000μg/ml、1500μg/ml、2000μg/ml、3000μg/ml的YPD梯度平板上，30℃培养，3-6天后获得阳性转化子。
进一步的，步骤三中高酶活重组毕赤酵母菌株的筛选具体方法为：将阳性转化子挑取单菌落接种于盛装5mlYPCS(含终浓度100μg/mLZeocin)的试管中，250rpm/min，30℃培养，16h-18h后加甲醇，使甲醇溶液的体积百分浓度为1％，之后24h和48h后均各加相同体积的甲醇诱导，96h培养后毕赤酵母菌经8000r/min离心5min收集上清，测定FAD依赖葡萄糖脱氢酶的活力。
具体方法如下：
DCIP反应体系包括终浓度50mM乙酸钠缓冲液，pH 5.5，300μM DCIP和100mM葡萄糖。
具体如下：
1、反应体系3.1ml：底物葡萄糖2.9ml、9×10-3Mol/L DCIP 100μl、酶液100μl；
2、检测520nm处吸光值的变化(吸光值下降)；
3、计算公式：
酶活(U/ml)＝△A×3.1×稀释倍数D/6.9×0.1×3min。
如图1-3所示，将pPICZαA-GDH电转入毕赤酵母X33构建重组子，使用Zeocin及试管水平发酵筛选获得一株株高产毕赤酵母重组菌株X33-GDH-2将其制成感受态；然后将pMD-GDH电转入X33-GDH-2感受态细胞，涂布于G418终浓度为100μg/ml、200μg/ml、500μg/ml、800μg/ml、1000μg/ml、1500μg/ml、2000μg/ml、3000μg/ml的YPD梯度平板上，随着G418浓度的增大，平板上单菌落数量逐渐减少且生长时间变长，利用G418和试管发酵筛选得到高产毕赤酵母重组菌株X33-GDH-2-1。转入pMD-GDH后100μg/mlG418平板上的转化子X33-GDH-2-1酶活比X33-GDH-2提高94％；2000μg/ml G418梯度平板上菌株X33-GDH-2-17酶活最高，比X33-GDH-2-1提高97％。结果表明了依次使用不同筛选标记及浓度梯度策略有助于提高FAD-GDH的表达量。
结果表明，本研究中依次使用Zeocin、G418及G418浓度梯度筛选，以期增加重组菌中FAD-GDH基因拷贝数，筛选高表达FAD-GDH的重组毕赤酵母菌株的策略有助于提高FAD-GDH在重组毕赤酵母中的表达量。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (4)

1.一种筛选高表达FAD-GDH的重组毕赤酵母菌株的方法，其特征在于，具体步骤为：
步骤一：利用前期获得的密码子偏好性优化的FAD-GDH基因片段分别与表达载体pPICZαA、pMD连接，构建重组表达载体pPICZαA-GDH和pMD-GDH；
步骤二：将pPICZαA-GDH电转入毕赤酵母X33构建重组子，使用Zeocin及试管发酵筛选获得毕赤酵母重组菌株X33-GDH-2，将其制成感受态；
步骤三：将pMD-GDH电转入X33-GDH-2感受态细胞，利用G418浓度梯度平板和试管发酵进行筛选。
2.根据权利要求1所述的一种筛选高表达FAD-GDH的重组毕赤酵母菌株的方法，其特征在于，所述步骤一中重组质粒pMD-GDH、pPICZαA-GDH的构建具体方法为：目的基因FAD-GDH连接在pUC57T载体上，3’和5’两端分别有EcoRI和NotI限制性酶切位点，中科院微生物研究所提供的pMD-AOX质粒及pPICZαA质粒也存在这两个酶切位点，将pUC57-GDH和实验室保存的pMD-AOX质粒、pPICZαA分别进行EcoRI和NotI双酶切，酶切产物分别用1％琼脂糖凝胶电泳分离，切胶回收GDH目的基因及pMD空载、pPICZαA空载，得到有相同粘性末端的目的基因GDH和载体。用T4连接酶连接回收产物，连接后的产物转化入大肠杆菌DH5α感受态，对鉴定出的阳性克隆提取质粒进行酶切、测序，比对分析重组质粒构建成功。
3.根据权利要求1所述的一种筛选高表达FAD-GDH的重组毕赤酵母菌株的方法，其特征在于，所述步骤二中重组毕赤酵母产FAD-GDH的菌株构建的具体方法为：重组质粒pPICZαA-GDH采用SacI线性化后电转表达宿主Pichia pastoris X33，构建重组菌X33/pMD-GDH，电转条件：4Kv，4-5ms，快速加入1ml预冷的YPDS液体培养基，电转的感受态细胞置于30℃培养箱静置培养2-4h，4000rpm离心5min，弃上清，用1ml过滤除菌的生理盐水洗3次，然后取500μL涂布在终浓度为100μg/mLZeocin的YPD平板上，30℃培养，2-3天后获得阳性转化子；
将阳性转化子挑取单菌落接种于盛有5mlYPCS(含终浓度100μg/mLZeocin)的试管中，250rpm/min，30℃培养，16h-18h后加甲醇，使甲醇溶液的体积百分浓度为1％，之后24h和48h后均各加相同体积的甲醇诱导，96h培养后毕赤酵母菌经8000r/min离心5min收集上清，测定FAD依赖葡萄糖脱氢酶的活力；
试管发酵水平筛选获得毕赤酵母重组表达菌株X33-GDH-2，将其制成感受态。重组质粒pMD-GDH采用同样的方法电转入感受态菌株X33-GDH-2，然后取500μL涂布在G418终浓度为100μg/ml、200μg/ml、500μg/ml、800μg/ml、1000μg/ml、1500μg/ml、2000μg/ml、3000μg/ml的YPD梯度平板上，30℃培养，3-6天后获得阳性转化子。
4.根据权利要求1所述的一种筛选高表达FAD-GDH的重组毕赤酵母菌株的方法，其特征在于，步骤三中高酶活重组毕赤酵母菌株的筛选具体方法为：将阳性转化子挑取单菌落接种于盛装5mlYPCS(含终浓度100μg/mLZeocin)的试管中，250rpm/min，30℃培养，16h-18h后加甲醇，使甲醇溶液的体积百分浓度为1％，之后24h和48h后均各加相同体积的甲醇诱导，96h培养后毕赤酵母菌经8000r/min离心5min收集上清，测定FAD依赖葡萄糖脱氢酶的活力。
具体方法如下：
DCIP反应体系包括终浓度50mM乙酸钠缓冲液，pH 5.5，300μM DCIP和100mM葡萄糖。
具体如下：
1、反应体系3.1ml：底物葡萄糖2.9ml、9×10-3Mol/L DCIP 100μl、酶液100μl；
2、检测520nm处吸光值的变化(吸光值下降)；
3、计算公式：
酶活(U/ml)＝△A×3.1×稀释倍数D/6.9×0.1×3min。
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