CN113717869A - 一株酿酒酵母 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一株酿酒酵母菌，所述菌株为酿酒酵母MX2（Saccharomyces cerevisiae MX2），该菌株于2020年7月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.20378。本发明提供的酿酒酵母MX2对豆腐加工产生的豆清水以及淮山加工产生的淮山皮具有发酵作用，能以豆清水为原料发酵生产豆清酒，还能以淮山皮为原料发酵生产淮山皮酒，从而为豆清酒、淮山酒的生产及资源化提供新的发酵菌源。
Description
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株酿酒酵母。所述菌株为酿酒酵母MX2（Saccharomyces cerevisiae MX2），该菌株能应用于发酵豆清酒、淮山酒。
背景技术
大豆是我国第四大粮食作物，豆制品加工是大豆最为常见的食用方法。2018年全国豆制品加工大豆约700万吨，占食用大豆的55%左右。在豆腐滤压制作工艺过程中，会产生大量的沥水，俗称豆清水或黄浆水，其产生量是大豆干重的3-5倍。豆清水营养丰富，包括可溶性蛋白质、可溶性糖、维生素、脂类、微量元素等成分，其多糖含量约为1-3.22%左右。据统计2018年中国因豆制品加工产生豆清水达到2100-3500万吨。据测算每生产75 吨大豆蛋白所排放的豆清水，其BOD值相当于2.5～3 万人口的城市一天的生活污水，而目前，大多数企业对豆清水的处理多采用直排的方式，这对环境产生了严重污染。
淮山属于薯类作物，我国食用淮山已经有2000多年的历史，由于其富含人体必需的18种氨基酸，粘液蛋白，淮山多糖，铁，锌等多种有益元素，中医《本草纲木》等记载其具有补脾养胃，补肺益肾等功效，久服可耳聪目明，因此其深受人们爱戴，自上世纪80年代，日本应用淮山制造高档糕点以来，人类就开启了淮山的精深产业化加工道路，淮山薯片，淮山粉等深受市场欢迎。但在加工过程中产生了大量的淮山皮，而淮山皮同样具有很好的营养价值，目前淮山皮由于没有适合的淮山皮加工利用技术，基本被企业直接丢弃，造成资源的极大浪费。
为解决上述问题，本申请人致力于筛选出能以豆清水或淮山皮为原料发酵生产豆清酒或淮山酒的酿酒酵母菌株，以充分利用豆清水或淮山皮资源，为豆清酒或淮山酒的酿造生产及开发提供新的发酵菌源。
发明内容
本发明的目的在于提供一株酿酒酵母，所述菌株为酿酒酵母 MX2（Saccharomyces cerevisiae MX2），酿酒酵母 MX2（Saccharomyces cerevisiae MX2）于2020年7月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC NO. 20378。以豆清水为原料发酵生产豆清酒，以淮山皮为原料发酵生产淮山酒，为豆清酒、淮山酒生产及开发提供新的发酵菌源。
本发明是通过以下技术方案解决上述技术问题的 ：
取南平农家传统家酿老红酒酒糟10ml，向其中加入200g淮山皮原料28℃驯化发酵，以7天为一个周期，连续更替3次至有酒香味，再将驯化的淮山发酵液加入传统豆腐加工获得的豆清水中，发酵驯化7天，至豆清水散发出明显的酒香味，将经过驯化的发酵混合料稀释至10-4、10-5，各取0.1ml上述浓度梯度的稀释液涂布于酵母固体培养基的平板上，28℃倒置培养24h，挑选出菌落形态相似的疑似酵母菌的单菌落5株，在酵母固体平板上划线纯化培养3次，同时将各单菌落分别接种于豆清水培养基和淮山培养基中28℃静置培养72h，测定分析所得到的豆清酒和淮山酒的酒精含量，品尝其风味口感；最终挑选出一株能同时发酵淮山皮和豆清水生产出淮山酒和豆清酒的菌种，保存并命名为MX2。通过对菌株进行形态学观察以及18S rDNA基因序列测定及系统发育树同源性分析，最终鉴定为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。
进一步地，酿酒酵母MX2（Saccharomyces cerevisiae MX2）具有以下特征：
a. 菌落圆，在酵母培养基上呈乳白色、光滑，不透明；菌体椭圆，宽1.8-3.4μm,长2.1-3.8μm；
b. 对数生长期为4-12小时，发酵到90小时仍然处于稳定生长期；
c. 可在pH值为2.5的条件下存活，在pH值为3.0的条件下实现生长繁殖。
酿酒酵母MX2（Saccharomyces cerevisiae MX2）能以豆清水或淮山为原料，进行发酵，生产出口感极佳的豆清酒和淮山酒。豆清酒发酵方法具体为：制备豆清水培养基，接种1%（v:v）的酵母菌MX2发酵液，28℃静置发酵培养15天。淮山酒发酵方法具体为：制备淮山皮培养基，接种1%（v:v）的酵母菌MX2发酵液，28℃静置发酵培养15天。
上述豆清水培养基为：传统酸浆豆腐加工工艺获得豆清水，根据(w/v):15:100的比例加入蔗糖，115℃高压灭菌20 min。
上述淮山皮培养基为：淮山皮洗净，放入冷水中加热煮沸5min，捞出淮山皮，按淮山皮:白糖:水=2:1:7的比例混合，于121℃灭菌20min。
上述酵母菌MX2发酵液为：将酵母菌株MX2单菌落接种入200mL酵母培养基中28℃恒温培养72h，从而获得酵母菌MX2发酵液。
本发明的有益效果在于：酿酒酵母MX2（Saccharomyces cerevisiae MX2）可以以豆清水为原料酿造豆清酒，还能以淮山皮为原料酿造淮山酒。生产出的豆清酒中含有总氨基酸241.5mg/100ml、多糖1.53mg/ml、异黄酮0.81%，酒精度6度，生产出的淮山酒中含有总氨基酸31mg/100ml、多糖0.3mg/ml、铁4.7mg/kg、锌0.3 mg/kg，酒精度6度。酿酒酵母MX2（Saccharomyces cerevisiae MX2）能够作为发酵菌种应用于豆清酒及淮山酒的酿造生产中，为豆清酒及淮山酒的发酵生产及开发提供新的发酵菌源。
附图说明
图1：酿酒酵母MX2的菌落形态图。
图2：酿酒酵母MX2的扫描电镜图。
图3：目的片段扩增结果。
图4：酿酒酵母MX2的18S rDNA基因的系统发育树图谱。
图5：酿酒酵母MX2的生长曲线。
图6：酿酒酵母MX2的最适发酵pH值。
具体实施方式
为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明，但是下述的实例仅仅是本发明其中的例子而已，并不代表本发明所限定的权利保护范围，本发明的权利保护范围以权利要求书为准。
本发明酿酒酵母MX2（Saccharomyces cerevisiae MX2）是从南平农家传统家酿老红酒的酒糟中分离获得的。
以下实施例中各培养基的配方如下：
酵母培养基（1L）：蛋白胨5.0g、麦芽提取物 3.0g、酵母提取物3.0g、 葡萄糖3.0g，(将上述成分加入蒸馏水中，定容到1000mL，加热溶解，调节pH至6.2，分装后121℃高压灭菌20min。（注：固体培养基在此培养基基础上加20g/L琼脂粉）
豆清水培养基：传统酸浆豆腐加工工艺获得豆清水，根据(w/v):15:100的比例加入蔗糖， 115℃高压灭菌20 min。
淮山皮培养基：淮山皮洗净，放入冷水中加热煮沸5min，捞出淮山皮，按淮山皮:白糖:水=2:1:7的比例混合，于121℃灭菌20min。
实施例1 菌的驯化筛选分离
取南平农家传统家酿老红酒酒糟10ml，向其中加入200g淮山皮，在28℃下驯化发酵，以7天为一个周期，连续更替3次至有酒香味；将10mL驯化的淮山发酵液加入200mL传统豆腐加工获得的豆清水中，发酵驯化7天，至豆清水散发出明显的酒香味；将经过驯化的发酵混合料分别稀释至10-4、10-5，各取0.1ml上述浓度梯度的稀释液分别涂布于酵母固体培养基的平板上，28℃倒置培养24h，挑选出菌落形态相似的疑似酵母菌的单菌落5株，在酵母固体平板上划线纯化培养3次；将经过驯化分离获得的5株疑似酵母菌进行淮山酒和豆清酒的酿造，具体为分别将各单菌落接种入200mL酵母培养基中28℃恒温培养72h获得酵母菌发酵液，将酵母菌发酵液按照5%（v/v）的比例分别接种入豆清水培养基和淮山皮培养基中，经过28℃、72小时发酵后，测定淮山酒和豆清酒的pH和酒精度数，同时感官评价淮山酒和豆清酒的风味口感。结果如表1和表2所示，菌落2对淮山皮和豆清水分别进行发酵获得的淮山酒和豆清酒的口感最好，酒精度分别为3.39和3.1，对应产品的pH值分别为3.39和4.1，将菌落2命名为MX2，进行后续特性研究。
表1 不同菌落对淮山酒酿造效果
表2 不同菌落对豆清酒的酿造效果
实施例2 菌种的鉴定
2.1 MX2菌的形态观察
MX2的菌落形态如图1所示，菌体形态如图2所示。MX2的主要形态特征如下：菌落圆，在酵母培养基上呈乳白色、光滑，不透明；菌体椭圆，宽1.8-3.4μm，长2.1-3.8μm。
2.2 MX2菌的碳源利用分析
配置培养基（每1升培养基中含有蛋白胨10g、牛肉粉3g、氯化钠5g和溴甲酚紫0.04wt%,将培养基以10mL/管分装至试管中，每管分别加入1wt%的葡萄糖、半乳糖、麦芽糖、蔗糖、乳糖、淀粉、果糖、木糖、阿拉伯糖和海藻糖，倒扣放入德汉氏小管，每种糖各3支，121℃灭菌20min）,按照1%（v/v）的接种量接实施例1所获得的酵母菌MX2发酵液，30℃放置发酵，产酸则培养基变成橙黄色（培养基原先为深紫色），产气则德汉氏小管中有气体，结果见表3，可知MX2可发酵利用葡萄糖、半乳糖、麦芽糖、蔗糖和果糖，不能发酵利用乳糖、淀粉、木糖、阿拉伯糖和海藻糖。
表3 SF1对糖类的利用情况
注：“+”为实验阳性，“-”为实验阴性。
2.3 MX2的分子生物学鉴定
①MX2菌基因组DNA的提取：采用TIANGEN公司的酵母菌基因组DNA提取试剂盒提取。
②18S rDNA序列的PCR扩增：扩增18S rDNA基因序列，所用引物为：
Au2-F（SEQ ID NO.1）：5’-TTTCGATGGTAGGATAGDGG -3’；
Au4-R（SEQ ID NO.2）：5’-RTCTCACTAAGCCATTC -3’。
PCR反应体系：2*Mix 12.5 μL，引物及DNA各1 μL，ddH20 9.5 μL。
PCR扩增程序：93℃预变性4min；然后94℃变性30s，50℃退火60s，72℃延伸90s，共35个循环；最后72℃充分延伸10min，4 ℃保存。
③PCR产物检测及测序分析：取5 μL的PCR产物，在加入EB的1.0%的琼脂糖中凝胶电泳分离检验，扩增得到18S rDNA目的片段长为1267 bp（图3）。将含有目标片段的产物委托铂尚生物技术(上海)有限公司完成测序，得到的实际有效核苷酸序列为18SrDNA其核苷酸序列见SEQ ID NO.3，大小为1267bp。
④系统发育分析：在NCBI数据中对各18S rRNA序列进行Blast比对分析，得到序列与Saccharomyces cerevisiae的Per.Ident为99.69%，Query Cover为100%，采用MEGA 4.1中的Maximum Parsimony进行发育树的构建分析，最终确定MX2与Saccharomyces cerevisiae （NR132207.1）在同一发育分支上（结果见图4）。结合MX2菌的形态观察、细菌生理生化试验以及DNA系统发育树中的同源性分析，确定MX2菌为酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）菌种。
实施例3 酿酒酵母MX2（Saccharomyces cerevisiaeMX2）的生长曲线测定
采用紫外分光光度计法测定MX2的生长曲线，具体为将实施例1所获得的酵母菌MX2发酵液按照1%（v/v）接种量接种入酵母培养基中，于不同时间内收集菌体各5mL，8000r/min离心收集菌体，向菌体中加入超纯水并定容至5mL，600nm下测定OD值，通过对菌MX2不同发酵时间内菌体OD值的检测，确定该菌的对数生长期为4-12h，12h后进入稳定生长期，发酵到90h仍然处于稳定生长期，说明该菌有较长的稳定生长期（图5）。
实施例4 酿酒酵母MX2（Saccharomyces cerevisiaeMX2）对酸的耐受水平
将酵母发酵培养基的pH分别调整至1.5至3.5后，按1%（v/v）的接种量接种实施例1所获得的酵母菌MX2发酵液，于28℃、150r/min条件下分别培养2h、6h，各取1ml菌悬液进行菌落计数，结果见表4，可知菌MX2可在pH值为2.5的条件下存活2h，在pH值为3.0的条件下可实现生长，在培养2h时MX2菌落数生长至原值的158.75%，6h时继续生长原值的225.42%；调节酵母培养基至pH为4-8之间，进行菌体吸光值检测分析，确定MX2最佳发酵pH值为6.0（图6）。
表 4 MX2对酸的耐受力分析
实施例5 酿酒酵母MX2（Saccharomyces cerevisiae MX2）的应用研究
采用酸浆水法获取豆清水，制备豆清水培养基，以1%（v:v）的接种量接种实施例1所获得的酵母菌MX2发酵液，28℃恒温酿造15天。如表5所示，可知获得的豆清酒中氨基酸总量为241.5mg/L,总蛋白质0.34%，多糖含量为1.53%，异黄酮含量为0.81%，酒精度为6度，口感极佳。同时制备淮山皮培养基，采用淮山皮培养基进行淮山酒的酿造，以1%（v:v）的接种量接种实施例1所获得的酵母菌MX2发酵液，28℃恒温酿造 15天。如表5所示，可知获得的淮山酒酒精度为6度，其铁含量为4.5 mg/kg，锌含量为0.88 mg/kg，口感极佳。
表5淮山酒和豆清酒产品参数检测
SEQUENCE LISTING
<110> 福建省农业科学院农业工程技术研究所
<120> 一株酿酒酵母
<130>
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
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<211> 1267
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ggtacgggca tagggttcga ttccggagag ggagcctgag aaacggctac cacatccaag 60
gaaggcagca ggcgcgcaaa ttacccaatc ctaattcagg gaggtagtga caataaataa 120
cgatacaggg cccattcggg tcttgtaatt ggaatgagta caatgtaaat accttaacga 180
ggaacaattg gagggcaagt ctggtgccag cagccgcggt aattccagct ccaatagcgt 240
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ttacgagaaa tcaaagtctt tgggttctgg ggggagtatg gtcgcaaggc tgaaacttaa 780
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attgctcttc aacgaggaat tcctagtaag cgcaagtcat cagcttgcgt tgattacgtc 1260
cctgccc 1267
Claims (3)
1.一株酿酒酵母菌，其特征在于：所述菌株为酿酒酵母MX2（Saccharomyces cerevisiae MX2）；所述菌株于2020年7月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC NO.20378。
2.如权利要求1所述的酿酒酵母菌株在制备豆清酒酿制中的应用。
3.如权利要求1所述的酿酒酵母菌株在淮山酒酿制中的应用。
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2021
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| GR01 | Patent grant | ||
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