CN113698496A - 临近标记复合物、临近标记方法、分子间互作分析方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提出临近标记复合物、临近标记方法、分子间互作分析方法，其中，该临近标记复合物通过构建蛋白A和抗坏血酸过氧化物酶的融合表达蛋白，蛋白A可以特异性的与目标蛋白的抗体结合，通过特异性的抗体介导临近标记复合物与目标蛋白的紧密结合，不需要在细胞内构建抗坏血酸过氧化物酶与诱饵蛋白的融合蛋白，该临近标记复合物不受限于基因编辑，且能够应用于翻译后修饰的蛋白的问题，通过该临近标记复合物鉴定与目标蛋白相互作用的分子有效性高。

Description

临近标记复合物、临近标记方法、分子间互作分析方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及临近标记复合物、临近标记方法、分子间互作分析方法。
背景技术
许多生物过程是通过蛋白质和核酸的分子相互作用来执行和调节的，包括蛋白质-蛋白质相互作用、蛋白质-RNA相互作用和蛋白质-DNA相互作用。这些相互作用关系的失衡会导致人类各种疾病的发生，如癌症、免疫失调和神经退行性疾病等。因此，研究细胞中这些分子间的相互作用的方法对了解人类疾病的生物学过程及其治疗提供有利的工具。
临近标记技术常被用来研究生物分子间的相互作用，其是通过运用基因编辑将工程化酶，例如过氧化物酶APEX/APEX2和HRP或生物素连接酶BioID、BASU、TurboID和miniTurbo等，与诱饵蛋白在细胞内融合表达，再利用生物素来标记与诱饵蛋白结合的目标蛋白邻近的相互作用的蛋白质、DNA或RNA，然后通过生物信息学分析或质谱鉴定进一步了解与目标蛋白相互作用的分子。
其中，工程化抗坏血酸过氧化物酶(APEX2)是由源自植物的抗坏血酸过氧化物酶经工程改造而来。Ting等人研究证明，APEX2在活细胞内所有区域有活性，并可以利用生物素苯酚(Biotin-phenol,BP)催化生成活性强、半衰期短、膜不通透的活性分子，因此可以实现对特定亚细胞区域内或间隙中蛋白质组的标记。将细胞与生物素苯酚共同孵育30分钟后，添加过氧化氢(H2O2)可以激活酶促反应，生成生物素-苯氧自由基，这些自由基与富含电子的特定氨基酸(如Tyr、Trp、Cys和His)反应，使生物素被共价连接到蛋白质或核酸分子上，接着标记反应需要添加抑制剂来终止。由于苯氧自由基的半衰期很短(<1ms)，只有距离目标蛋白20nm以内的蛋白、DNA和RNA会被标记，1分钟内即可完成所需的标记。
生物素标记的分子通过偶联链霉亲和素的磁珠进行亲和富集，最后利用质谱技术、DNA-seq或RNA-seq或相对定量PCR(qPCR)对生物素修饰的分子进行鉴定，得到目标蛋白的邻近蛋白质组、DNA或RNA。
基于APEX2技术的临近标记主要有以下个优点：1)苯氧自由基的寿命很短，在1ms以内，所以理论上只能标记空间范围在20nm以内的蛋白，和标记范围是200-300nm的HRP方法相比，极大地降低了假阳性的结果。2)自由基的活性很高，反应速度极快，标记反应只需要1分钟，所以无论对于瞬时的生物过程还是长时程的生物过程，APEX2技术都能很好地实现临近标记。
但是这些方法具有一定的局限性：1)需要用工程化酶在细胞内表达外源融合蛋白，这限制了其在难以转染的细胞系、原代细胞、组织和病理样品中的应用；2)不能应用于翻译后修饰的蛋白(例如组蛋白修饰)；3)当在细胞中融合工程化酶时，可能会造成诱饵蛋白功能的丧失，以及与其相互作用蛋白的改变，从而造成假阳性。
发明内容
本发明的主要目的是提供一种临近标记复合物，旨在解决现有临近标记方法受限于基因编辑，且不能够应用于翻译后修饰的蛋白的问题，该临近标记复合物鉴定与目标蛋白相互作用的分子有效性高。
为实现上述目的，本发明提出一种临近标记复合物，包括蛋白A和抗坏血酸过氧化物酶的融合表达蛋白。
可选地，所述蛋白A的氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示。
本发明还提出一种试剂盒，包括上述的一种临近标记复合物。
可选地，所述试剂盒还包括生物素苯酚和过氧化氢。
本发明还提出一种临近标记方法，使用上述的一种临近标记复合物对与目标蛋白互作的蛋白、DNA和RNA分子进行生物素标记。
本发明还提出一种临近标记方法，使用上述的一种试剂盒对与目标蛋白互作的蛋白、DNA和RNA分子进行生物素标记。
可选地，所述临近标记复合物对与目标蛋白互作的蛋白、DNA和RNA分子进行生物素标记，具体包括：
向细胞中加入抗体孵育，使所述抗体与目标蛋白结合；
向细胞中加入所述临近标记复合物孵育，使所述临近标记复合物的蛋白A与所述抗体结合，使得所述细胞内形成抗坏血酸过氧化物酶-蛋白A-抗体-目标蛋白复合体；
向形成所述抗坏血酸过氧化物酶-蛋白A-抗体-目标蛋白复合体的细胞中加入生物素苯酚孵育；
加入过氧化氢激活所述抗坏血酸过氧化物酶利用所述生物素苯酚生成生物素-苯氧自由基对与所述目标蛋白互作的蛋白、DNA和RNA分子进行生物素标记。
可选地，所述临近标记复合物对与目标蛋白互作的蛋白、DNA和RNA分子进行生物素标记，具体包括：
将所述临近标记复合物与抗体孵育，使所述临近标记复合物的蛋白A与所述抗体结合，得到第一复合体；
向细胞中加入所述第一复合体孵育，使所述抗体与目标蛋白结合，使得所述细胞内形成抗坏血酸过氧化物酶-蛋白A-抗体-目标蛋白复合体；
向形成所述抗坏血酸过氧化物酶-蛋白A-抗体-目标蛋白复合体的细胞中加入生物素苯酚孵育；
加入过氧化氢激活所述抗坏血酸过氧化物酶利用所述生物素苯酚生成生物素-苯氧自由基对与所述目标蛋白互作的蛋白、DNA和RNA分子进行生物素标记。
可选地，所述目标蛋白为修饰的组蛋白。
可选地，所述生物素-苯氧自由基对所述目标蛋白20nm以内的蛋白、DNA和RNA分子进行生物素标记。
本发明最后还提出一种分子间互作分析方法，包括：
使用上述的一种临近标记复合物对与目标蛋白互作的蛋白、DNA和RNA分子进行生物素标记；
使用偶联链霉亲和素的磁珠对生物素标记的蛋白、DNA和RNA分子进行富集；
通过LC-MS/MS、DNA-seq或RNA-seq或相对定量PCR方法将富集到的生物素标记的蛋白、DNA和RNA分子进行分析鉴定。
本发明技术方案的临近标记复合物通过构建蛋白A和抗坏血酸过氧化物酶的融合表达蛋白，蛋白A可以特异性的与目标蛋白的抗体结合，通过特异性的抗体介导临近标记复合物与目标蛋白的紧密结合，不需要在细胞内构建抗坏血酸过氧化物酶与诱饵蛋白的融合蛋白，该临近标记复合物不受限于基因编辑，且能够应用于翻译后修饰的蛋白的问题，通过该临近标记复合物鉴定与目标蛋白相互作用的分子有效性高。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图示出的结构获得其他的附图。
图1为本发明的临近标记复合物的基因结构设计图；
图2为本发明的临近标记复合物标记与目标蛋白互作的分子的原理示意图；
图3为本发明的分子间互作分析方法的过程示意图；
图4为3XFlag-pA-Tn5-F1质粒图谱；
图5为3XFlag-pA-APEX2质粒图谱；
图6为本发明的临近标记复合物分析与组蛋白修饰相关蛋白分子的实验结果图；
图7为本发明的临近标记复合物分析与组蛋白修饰相关DNA分子的特异性位点；
图8为本发明的临近标记复合物分析与组蛋白修饰相关RNA分子的特异性位点。
本发明目的的实现、功能特点及优点将结合实施例，参照附图做进一步说明。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明提出一种临近标记复合物，请参阅图1，包括蛋白A和抗坏血酸过氧化物酶的融合表达蛋白。
具体的，蛋白A(Protein A)是金黄色葡萄球菌的一个株系的细胞壁蛋白，它通过Fc区与哺乳动物的IgG结合，具有不在抗原结合位点而与免疫球蛋白结合的性质，能形成含有蛋白A、抗体、抗原的复合物。更具体的，本发明实施例的蛋白A的氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示。
具体的，抗坏血酸过氧化物酶(APEX2)是由源自植物的抗坏血酸酶经工程改造而来，本发明实施例的抗坏血酸过氧化物酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。APEX2在活细胞内所有区域有活性，并可以利用生物素苯酚(Biotin-phenol,BP)催化生成活性强、半衰期短、膜不通透的活性分子，因此可以实现对特定亚细胞区域内或间隙中蛋白质组的标记。
将细胞与生物素-苯酚共同孵育30分钟后，添加过氧化氢(H2O2)可以激活酶促反应，生成生物素-苯氧自由基，这些自由基与富含电子的特定氨基酸(如Tyr、Trp、Cys和His)反应，使生物素被共价连接到蛋白、DNA和RNA上，接着标记反应需要添加抑制剂来终止。由于苯氧自由基的半衰期很短小于1ms，只有距离目标蛋白20nm以内的蛋白、DNA和RNA会被标记，1分钟内即可完成所需的标记。
具体的，蛋白A可以连接在抗坏血酸过氧化物酶(APEX2)的C端或N端，得到的融合表达蛋白具有蛋白A与抗体特异性结合的特点，也具有抗坏血酸过氧化物酶的特点。APEX2在过氧化氢的催化下可将生物素标记在目标蛋白邻近20nm以内所有可标记的蛋白、DNA和RNA分子上，具体的，标记原理示意图如图2所示。然后采用链霉亲和素磁珠对生物素化的分子进行富集，并通过LC-MS/MS方法将富集到的生物素标记的蛋白分子进行质谱鉴定，通过qPCR对富集到的生物素标记的DNA和RNA分子的特异位点进行检测。
本发明技术方案的临近标记复合物通过构建蛋白A和抗坏血酸过氧化物酶的融合表达蛋白，蛋白A可以特异性的与目标蛋白的抗体结合，通过特异性的抗体介导临近标记复合物与目标蛋白的紧密结合，不需要在细胞内构建抗坏血酸过氧化物酶与诱饵蛋白的融合蛋白，该临近标记复合物不受限于基因编辑，且能够应用于翻译后修饰的蛋白的问题，通过该临近标记复合物鉴定与目标蛋白相互作用的分子有效性高。
可选地，所述临近标记复合物带有Flag标签。
Flag标签可以连接在蛋白A，也可以连接在APEX2，表达得到的临近标记复合物融合蛋白带有Flag标签，本发明实施例中，Flag标签连接在蛋白A上。后续检测主要通过Flag-tag这段肽链形成的免疫决定簇与其单克隆抗体的特异性结合来实现。检测手段有免疫荧光(immunofluorescence)，免疫印记(Western Blotting)等。更具体的，Flag标签为3XFlag标签，3X Flag标签的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
进一步地，请继续参阅图1，所述临近标记复合物还包括内含肽(MXe GyrAintein)和几丁质结合蛋白(CBD)。CBD用于在纯化融合蛋白过程中与几丁质树脂结合固定融合蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。内含肽是蛋白质自剪接元件，用于将纯化后的融合蛋白进行剪切，使3X Flag-pA-APEX2与树脂剥离，达到纯化效果。在一实施例中，内含肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。
更进一步地，3X Flag-pA-APEX2与内含肽和几丁质结合蛋白之间有连接肽，以防止内含肽剪切到3X Flag-pA-APEX2，影响临近标记复合物的功能。所述连接肽的氨基酸序列例如可以为SEQ ID NO.6所示。
本发明还提出一种试剂盒，包括上述的一种临近标记复合物。可选地，所述试剂盒还包括生物素苯酚和过氧化氢。
本发明还提出一种临近标记方法，使用上述的一种临近标记复合物对与目标蛋白互作的蛋白、DNA和RNA分子进行生物素标记。
本发明还提出一种临近标记方法，使用上述的一种试剂盒对与目标蛋白互作的蛋白、DNA和RNA分子进行生物素标记。
可选地，所述临近标记复合物对与目标蛋白互作的蛋白、DNA和RNA分子进行生物素标记，具体包括：
向细胞中加入抗体孵育，使所述抗体与目标蛋白结合；
向细胞中加入所述临近标记复合物孵育，使所述临近标记复合物的蛋白A与所述抗体结合，使得所述细胞内形成抗坏血酸过氧化物酶-蛋白A-抗体-目标蛋白复合体；
向形成所述抗坏血酸过氧化物酶-蛋白A-抗体-目标蛋白复合体的细胞中加入生物素苯酚孵育；
加入过氧化氢激活所述抗坏血酸过氧化物酶利用所述生物素苯酚生成生物素-苯氧自由基对与所述目标蛋白互作的蛋白、DNA和RNA分子进行生物素标记。
可选地，所述临近标记复合物对与目标蛋白互作的蛋白、DNA和RNA分子进行生物素标记，具体包括：
将所述临近标记复合物与抗体孵育，使所述临近标记复合物的蛋白A与所述抗体结合，得到第一复合体；
向细胞中加入所述第一复合体孵育，使所述抗体与目标蛋白结合，使得所述细胞内形成抗坏血酸过氧化物酶-蛋白A-抗体-目标蛋白复合体；
向形成所述抗坏血酸过氧化物酶-蛋白A-抗体-目标蛋白复合体的细胞中加入生物素苯酚孵育；
加入过氧化氢激活所述抗坏血酸过氧化物酶利用所述生物素苯酚生成生物素-苯氧自由基对与所述目标蛋白互作的蛋白、DNA和RNA分子进行生物素标记。
可选地，所述目标蛋白为修饰的组蛋白。
可选地，所述生物素-苯氧自由基对所述目标蛋白20nm以内的蛋白、DNA和RNA分子进行生物素标记。
本发明最后还提出一种分子间互作分析方法，请参阅图3，包括：
使用上述的一种临近标记复合物对与目标蛋白互作的蛋白、DNA和RNA分子进行生物素标记；
使用偶联链霉亲和素的磁珠对生物素标记的蛋白、DNA和RNA分子进行富集；
通过LC-MS/MS方法将富集到的生物素标记的蛋白分子进行质谱鉴定；
通过qPCR对富集到的生物素标记的DNA和RNA分子的特异位点进行检测。
下面将结合具体实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例1pA-APEX2融合蛋白的得到
1.1质粒构建
pA-APEX2是3X Flag-pA-APEX2的简写，是带有Flag标签的蛋白A(Protein A)与过氧化物酶APEX2融合表达后纯化得到的蛋白A-APEX2复合物。
使用3X Flag-pA-Tn5-F1质粒(Addgene plasmid#124601)，质粒图谱如图4所示，作为构建3XFlag-pA-APEX2的骨架。APEX2基因序列通过聚合酶链反应从GFP-APEX2-NIK3x质粒(Addgene plasmid#129274)扩增得到，扩增引物序列分别为上游引物aggaggaggcggttcccatatgggaaagtcttacccaactgtgag(SEQ ID NO.7)和下游引物ccctcgggtagggcaactagtgcatctcccgtgatgcaggcatcagcaaacccaagct(SEQ ID NO.8)。将3X Flag-pA-Tn5-F1质粒序列中的Tn5序列用NdeI和SpeI内切酶剪切并用APEX2序列替代，得到3X Flag-pA-APEX2质粒，质粒图谱如图5所示。
1.2表达纯化
将表达的3X Flag-pA-APEX2质粒转入C3013感受态细胞37℃过夜培养。第二天挑取单克隆细胞于3mL 2xYT培养基(含氨苄抗生素)于37℃培养4h，随后将3mL菌液转至400mL2x YT培养基(含氨苄抗生素)进行大体系培养至O.D.～0.6，将培养好的400mL菌液放置冰上降温至10℃，加入终浓度为0.25mM的IPTG过夜培养(16℃、200rpm)。第三天将菌液在4℃6000g离心30min收取细菌沉淀。
收取细菌沉淀后用40mL的HEGX Buffer(20mM HEPES-KOH pH 7.2、1M NaCl、1mMEDTA、10％glycerol、0.2％Triton X-100和蛋白酶抑制剂)裂解细菌重悬，冰上裂解15min，超声破碎后用4℃离心机16000g离心30min，小心收取蛋白上清。向蛋白上清液中加入4mL的几丁质树脂4℃孵育1h。然后转至两个20mL的重力纯化柱并用HEGX Buffer洗两遍。用含有终浓度为100mM DTT的HEGX Buffer进行剪切，DTT可将intein CBD结构切掉，使3XFlag-pA-APEX2与树脂剥离，达到纯化效果。最终经透析和浓缩得到较高纯度的3XFlag-pA-APEX2于-20℃保存。
实施例2pA-APEX2融合蛋白标记小鼠细胞组蛋白
pA-APEX2临近标记过程：1)小鼠成纤维细胞(MEF)用终浓度为0.1％甲醛对细胞进行轻度交联并用0.05％洋地黄皂苷对细胞膜进行通透；2)加入抗体(H3K27me3)4℃过夜孵育，使抗体与目标蛋白结合；3)加入pA-APEX2室温孵育1小时，蛋白A与抗体结合，使得APEX2通过抗体与目标蛋白结合在一起；4)用Wash buffer(20mM HEPES pH 7.5、150mM NaCl、0.5mM亚精胺、RNA酶抑制剂和不含EDTA的蛋白酶抑制剂)洗涤两遍，加入终浓度为500μM的底物生物素苯酚(biotin-phenol)在室温下孵育30分钟；5)随后用1mM H2O2标记1分钟，APEX2在H2O2的催化下可将生物素标记在靶向修饰的组蛋白H3K27me3邻近20nm以内所有可标记的蛋白、DNA或RNA分子上，最后用还原剂淬灭反应，标记终止；6)裂解细胞，分别提取总蛋白、DNA或RNA，通过链霉亲和素标记的磁珠和亲和纯化方法将含有生物素标记的蛋白质、DNA或RNA进行富集，通过质谱分析，获得与组蛋白修饰相关的蛋白质组学信息，通过qPCR对富集的DNA和RNA的特异位点进行检测。
对比例1不加H2O2对照组
与实施例2相比，对比例1的区别仅在于不加H2O2催化，为阴性对照组，记为-H2O2。
对比例2IgG对照组
与实施例2相比，对比例2的区别在于向细胞中加入的是IgG抗体，而不是H3K27me3抗体，为阴性对照。
本方案通过特异性的抗体介导pA-APEX2与目标蛋白紧密结合，为了排除非特异性结合产生的背景，设置IgG阴性对照组，因为IgG并不能特异性的与目标蛋白结合，那么IgG所介导pA-APEX2临近标记的蛋白、DNA或RNA都是非特异性的与IgG结合的分子，得到的结果就是背景。所以通过设置IgG阴性对照组排除背景，得到真实标记的目标分子。
结果分析
为了测试pA-APEX2是否可用于鉴定与组蛋白修饰相关的蛋白质、DNA和RNA，通过LC-MS/MS方法将富集到的生物素标记的蛋白分子进行质谱鉴定。结果表明，与IgG阴性对照组和不加H2O2的阴性对照组比较，加H2O2处理组可精准鉴定出MEF细胞中组蛋白修饰H3K27me3相关PRC1和PRC2亚基复合物，其结果与已有两种方法BAC-GFP和ChromID的鉴定结果相比较，鉴定范围和准确度有较大提升，结果如图6所示，其中BAC-GFP方法的参考文献为：
Vermeulen,M.et al.Quantitative interaction proteomics and genome-wideprofiling of epigenetic histone marks and their readers.142,967-980(2010)。ChromID方法的参考文献为：Villasenor,R.et al.ChromID identifies the proteininteractome at chromatin marks.Nat Biotechnol 38,728-736,doi:10.1038/s41587-020-0434-2(2020)。
通过qPCR方法将富集到的生物素标记的DNA和RNA分子特异位点进行分析。结果表明，与IgG阴性对照组和不加H2O2的阴性对照组比较，加H2O2处理组可富集到H3K27me3特异性DNA位点Hoxc11(图7)，使用的qPCR引物为Hoxc11_F：GGCAGGAGAAGAGAACGAT；Hoxc11_R：TGGGCAGATAGAGG TTGGA。
与IgG阴性对照组和不加H2O2的阴性对照组比较，加H2O2处理组可富集到H3K27me3特异性RNA位点MALAT1(图8)，使用的qPCR引物为Malat1_F：CCTAACGACTAGCATTGGCA；Malat1_R：GCACTCTTTCCTGGGCTATC。
以上所述仅为本发明的可选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是在本发明的发明构思下，利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构变换，或直接/间接运用在其他相关的技术领域均包括在本发明的专利保护范围内。
SEQUENCE LISTING
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<213> 人工序列
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Met Thr Met Ile Thr Pro Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala
1 5 10 15
Asn Leu Leu Ser Glu Ala Lys Lys Leu Asn Glu Ser Gln Ala Pro Lys
20 25 30
Ala Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile
35 40 45
Leu His Leu Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln
50 55 60
Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala
65 70 75 80
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Ala Asp Asn Lys Phe Asn
85 90 95
Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu
100 105 110
Thr Glu Glu Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro
115 120 125
Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala
130 135 140
Gln Ala Pro Lys Asp Asp Asp Lys Glu
145 150
<210> 2
<211> 251
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 2
Phe Met Gly Lys Ser Tyr Pro Thr Val Ser Ala Asp Tyr Gln Asp Ala
1 5 10 15
Val Glu Lys Ala Lys Lys Lys Leu Arg Gly Phe Ile Ala Glu Lys Arg
20 25 30
Cys Ala Pro Leu Met Leu Arg Leu Ala Phe His Ser Ala Gly Thr Phe
35 40 45
Asp Lys Gly Thr Lys Thr Gly Gly Pro Phe Gly Thr Ile Lys His Pro
50 55 60
Ala Glu Leu Ala His Ser Ala Asn Asn Gly Leu Asp Ile Ala Val Arg
65 70 75 80
Leu Leu Glu Pro Leu Lys Ala Glu Phe Pro Ile Leu Ser Tyr Ala Asp
85 90 95
Phe Tyr Gln Leu Ala Gly Val Val Ala Val Glu Val Thr Gly Gly Pro
100 105 110
Lys Val Pro Phe His Pro Gly Arg Glu Asp Lys Pro Glu Pro Pro Pro
115 120 125
Glu Gly Arg Leu Pro Asp Pro Thr Lys Gly Ser Asp His Leu Arg Asp
130 135 140
Val Phe Gly Lys Ala Met Gly Leu Thr Asp Gln Asp Ile Val Ala Leu
145 150 155 160
Ser Gly Gly His Thr Ile Gly Ala Ala His Lys Glu Arg Ser Gly Phe
165 170 175
Glu Gly Pro Trp Thr Ser Asn Pro Leu Ile Phe Asp Asn Ser Tyr Phe
180 185 190
Thr Glu Leu Leu Ser Gly Glu Lys Glu Gly Leu Leu Gln Leu Pro Ser
195 200 205
Asp Lys Ala Leu Leu Ser Asp Pro Val Phe Arg Pro Leu Val Asp Lys
210 215 220
Tyr Ala Ala Asp Glu Asp Ala Phe Phe Ala Asp Tyr Ala Glu Ala His
225 230 235 240
Gln Lys Leu Ser Glu Leu Gly Phe Ala Asp Ala
245 250
<210> 3
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 3
Asp Tyr Lys Asp His Asp Gly Asp Tyr Lys Asp His Asp Ile Asp Tyr
1 5 10 15
Lys Asp Asp Asp Asp Lys
20
<210> 4
<211> 52
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 4
Thr Thr Asn Pro Gly Val Ser Ala Trp Gln Val Asn Thr Ala Tyr Thr
1 5 10 15
Ala Gly Gln Leu Val Thr Tyr Asn Gly Lys Thr Tyr Lys Cys Leu Gln
20 25 30
Pro His Thr Ser Leu Ala Gly Trp Glu Pro Ser Asn Val Pro Ala Leu
35 40 45
Trp Gln Leu Gln
50
<210> 5
<211> 198
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 5
Cys Ile Thr Gly Asp Ala Leu Val Ala Leu Pro Glu Gly Glu Ser Val
1 5 10 15
Arg Ile Ala Asp Ile Val Pro Gly Ala Arg Pro Asn Ser Asp Asn Ala
20 25 30
Ile Asp Leu Lys Val Leu Asp Arg His Gly Asn Pro Val Leu Ala Asp
35 40 45
Arg Leu Phe His Ser Gly Glu His Pro Val Tyr Thr Val Arg Thr Val
50 55 60
Glu Gly Leu Arg Val Thr Gly Thr Ala Asn His Pro Leu Leu Cys Leu
65 70 75 80
Val Asp Val Ala Gly Val Pro Thr Leu Leu Trp Lys Leu Ile Asp Glu
85 90 95
Ile Lys Pro Gly Asp Tyr Ala Val Ile Gln Arg Ser Ala Phe Ser Val
100 105 110
Asp Cys Ala Gly Phe Ala Arg Gly Lys Pro Glu Phe Ala Pro Thr Thr
115 120 125
Tyr Thr Val Gly Val Pro Gly Leu Val Arg Phe Leu Glu Ala His His
130 135 140
Arg Asp Pro Asp Ala Gln Ala Ile Ala Asp Glu Leu Thr Asp Gly Arg
145 150 155 160
Phe Tyr Tyr Ala Lys Val Ala Ser Val Thr Asp Ala Gly Val Gln Pro
165 170 175
Val Tyr Ser Leu Arg Val Asp Thr Ala Asp His Ala Phe Ile Thr Asn
180 185 190
Gly Phe Val Ser His Ala
195
<210> 6
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 6
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser
20
<210> 7
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
aggaggaggc ggttcccata tgggaaagtc ttacccaact gtgag 45
<210> 8
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
ccctcgggta gggcaactag tgcatctccc gtgatgcagg catcagcaaa cccaagct 58

Claims (11)

1.一种临近标记复合物，其特征在于，包括蛋白A和抗坏血酸过氧化物酶的融合表达蛋白。
2.如权利要求1所述的一种临近标记复合物，其特征在于，所述蛋白A的氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示。
3.一种试剂盒，其特征在于，包括权利要求1或2所述的一种临近标记复合物。
4.如权利要求3所述的一种试剂盒，其特征在于，还包括生物素苯酚和过氧化氢。
5.一种临近标记方法，其特征在于，使用权利要求1或2所述的一种临近标记复合物对与目标蛋白互作的蛋白、DNA和RNA分子进行生物素标记。
6.一种临近标记方法，其特征在于，使用权利要求3或4所述的一种试剂盒对与目标蛋白互作的蛋白、DNA和RNA分子进行生物素标记。
7.如权利要求5所述的一种临近标记方法，其特征在于，所述临近标记复合物对与目标蛋白互作的蛋白、DNA和RNA分子进行生物素标记，具体包括：
向细胞中加入抗体孵育，使所述抗体与目标蛋白结合；
向细胞中加入所述临近标记复合物孵育，使所述临近标记复合物的蛋白A与所述抗体结合，使得所述细胞内形成抗坏血酸过氧化物酶-蛋白A-抗体-目标蛋白复合体；
向形成所述抗坏血酸过氧化物酶-蛋白A-抗体-目标蛋白复合体的细胞中加入生物素酚孵育；
加入过氧化氢激活所述抗坏血酸过氧化物酶利用所述生物素苯酚生成生物素-苯氧自由基对与所述目标蛋白互作的蛋白、DNA和RNA分子进行生物素标记。
8.如权利要求5所述的一种临近标记方法，其特征在于，所述临近标记复合物对与目标蛋白互作的蛋白、DNA和RNA分子进行生物素标记，具体包括：
将所述临近标记复合物与抗体孵育，使所述临近标记复合物的蛋白A与所述抗体结合，得到第一复合体；
向细胞中加入所述第一复合体孵育，使所述抗体与目标蛋白结合，使得所述细胞内形成抗坏血酸过氧化物酶-蛋白A-抗体-目标蛋白复合体；
向形成所述抗坏血酸过氧化物酶-蛋白A-抗体-目标蛋白复合体的细胞中加入生物素苯酚孵育；
加入过氧化氢激活所述抗坏血酸过氧化物酶利用所述生物素苯酚生成生物素-苯氧自由基对与所述目标蛋白互作的蛋白、DNA和RNA分子进行生物素标记。
9.如权利要求7或8所述的一种临近标记方法，其特征在于，所述目标蛋白为修饰的组蛋白。
10.如权利要求9所述的一种临近标记方法，其特征在于，所述生物素-苯氧自由基对所述目标蛋白20nm以内的蛋白、DNA和RNA分子进行生物素标记。
11.一种分子间互作分析方法，其特征在于，包括：
使用权利要求1或2所述的一种临近标记复合物对与目标蛋白互作的蛋白、DNA和RNA分子进行生物素标记；
使用偶联链霉亲和素的磁珠对生物素标记的蛋白、DNA和RNA分子进行富集；
通过LC-MS/MS、DNA-seq或RNA-seq或相对定量PCR方法将富集到的生物素标记的蛋白、DNA和RNA分子进行分析鉴定。
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