CN113698282A - 一种提高甘草中查尔酮a含量的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种提高甘草查尔酮A的方法，包括以下步骤：将甘草根或甘草种子苗置于含组蛋白去乙酰化酶抑制剂的培养基中培养，收集根部，提取甘草查尔酮A。本发明通过研究首次发现，使用组蛋白去乙酰化酶抑制剂处理甘草根或甘草种子苗，能有效提高甘草根部查尔酮A的含量。本发明提供的方法具有简单、快速、高效和成本低等优点，在医药等领域具有广阔的应用空间。

Description

一种提高甘草中查尔酮A含量的方法

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种提高甘草中查尔酮A含量的方法。

背景技术

甘草作为一种历史悠久的中药材，从古至今都在疾病的治疗中发挥了重要的作用。甘草的主要成分为三萜皂苷类(主要是甘草酸)、黄酮类、香豆素类、生物碱类、多糖类和氨基酸等，三萜皂苷类(含量4％～24％)和黄酮类(含量1％～5％)是其主要活性成分。甘草查尔酮A(Licochalcone A,LCA)是存在于甘草中的一种酚类查尔酮化合物，被视为胀果甘草的特征性成分，至今在甘草中分离鉴定出的查尔酮类化合物中LCA的含量最高，因此对LCA的研究更具实际应用价值。然而，LCA在胀果甘草中的积累调控机制尚不清晰。

表观遗传修饰是调节参与植物次生代谢物的基因表达的关键因素，但是关于利用表观遗传的修饰调控植物次生代谢的报道却很少。组蛋白修饰是表观遗传中一种重要的修饰方式，其中组蛋白去乙酰化酶(Histone deacetylase,HDAC)可催化组蛋白和非组蛋白的赖氨酸残基的去乙酰化，导致多种基因表达的抑制，是转录抑制的重要表观遗传调控因子。相反，组蛋白去乙酰化酶抑制剂(HDAC抑制剂，HDAC inhibitor,HDACI)可以通过结合HDAC抑制其活性，提高组蛋白和其他靶蛋白的乙酰化作用，从而促进特定基因的转录激活。根据与酵母中组蛋白的同源性，植物中HDAC家族可以分为三类：I类是RPD3/HDA1家族，在信号转导过程中穿梭于细胞核与细胞质之间；II类是HD2家族，只存在于细胞核中；III类是SIR2家族，与前两类有很大的区别，其活性不是依赖Zn²⁺，而是依赖辅酶Ⅰ(NAD)，与酵母的Sir2同源，至少有7种亚型，它不能被I、II类HDAC抑制剂所抑制。相应地，组蛋白去乙酰化酶抑制剂也可分为三个类型：短链脂肪酸类，异羟肟酸类，氨基苯甲酰胺类。

因此通过表观抑制剂来探究对LCA积累的影响，可以为LCA的利用提供参考，提供有效提高胀果甘草中LCA含量的方法，为更好的开发甘草的临床应用奠定一定的基础。

发明内容

基于此，本发明的目的在于提供一种提高甘草查尔酮A的方法，能有效提高胀果甘草查尔酮A的含量。

具体技术方案为：

一种提高甘草查尔酮A的方法，包括以下步骤：将甘草根或甘草种子苗置于含有组蛋白去乙酰化酶抑制剂的培养基中培养，收集根部，提取甘草查尔酮A。

本发明所述甘草根包括但不限于甘草毛状根及甘草种子苗的根。

在其中一些实施例中，所述甘草根为甘草毛状根。

在其中一些实施例中，所述甘草根为甘草种子苗的根。

在其中一些实施例中，所述组蛋白去乙酰化酶抑制剂选自伏立诺他、烟酰胺和丁酸钠中的至少一种。伏立诺他(Vorinostat,SAHA)和丁酸钠(Sodium butyrate,NaB)都是广谱型HDAC抑制剂，可以抑制RPD3/HDA1家族和HD2家族的HDAC活性；烟酰胺(Nicotinamide,NIC)是一种HDAC抑制剂的特异形式，是SIR2家族的抑制剂。

优选地，所述组蛋白去乙酰化酶抑制剂为伏立诺他。

在其中一些实施例中，所述伏立诺他在培养体系中的浓度为80～120μM；和/或烟酰胺在培养体系中的浓度为0.5～2mM；和/或丁酸钠在培养体系中的浓度为0.5～2mM。

优选地，所述伏立诺他在培养体系中的浓度为95～105μM；和/或烟酰胺在培养体系中的浓度为0.8～1.2mM；和/或丁酸钠在培养体系中的浓度为0.8～1.2mM。

更优选地，所述伏立诺他在培养体系中的浓度为100μM；和/或烟酰胺在培养体系中的浓度为1mM；和/或丁酸钠在培养体系中的浓度为1mM。

在其中一些实施例中，所述组蛋白去乙酰化酶抑制剂为伏立诺他和烟酰胺。

在其中一些实施例中，所述含组蛋白去乙酰化酶抑制剂的培养基中还含有DNA甲基转移酶抑制剂；所述DNA甲基转移酶抑制剂为5-氮杂胞苷(5-azacytidine，5-azaC)，5-azaC在培养基中的浓度为30μM。

在其中一些实施例中，所述培养时间为至少3天。

在其中一些实施例中，所述培养时间为3天。

进一步地，所述培养时间为5天。

更进一步地，所述培养时间为7天。

在其中一些实施例中，针对甘草毛状根，所述培养基为液体1/2MS培养基，其成分为：2.215±0.05g/L MS培养基(Murashige & Skoog Basal Medium with Vitamins)、20±0.2g/L蔗糖、0.5±0.01g/L吗啉乙磺酸、250±2mg/L头孢羟氨苄(cef)，pH5.7～6.0。

在其中一些实施例中，所述培养基为MS固体培养基，其包含以下浓度的组分：4.43±0.05g/L MS培养基、20±0.2g/L蔗糖、0.5±0.01g/L吗啉乙磺酸，pH5.7～6.0，pH5.7～6.0。

在其中一些实施例中，所述提取甘草查尔酮A的方法包括以下步骤：

(1)将收集到的培养物的根用液氮研磨并冻干，获得样品；

(2)按照料液比为10：(0.8～1.2)mg/ml向步骤(1)获得的样品中加入甲醇进行超声提取，吸取上清液，过滤，蒸干浓缩，得到甘草查尔酮A。

在其中一些实施例中，步骤(2)所述超声提取次数为1～2次，吸取上清液过滤后，合并滤液。

在其中一些实施例中，所述提取甘草查尔酮A的方法还包括以下步骤：

(3)将步骤(2)蒸干浓度产物用甲醇重悬，过滤，收集滤液，得到甘草查尔酮A。

本发明的另一目的在于提供组蛋白去乙酰化酶抑制剂在提高甘草查尔酮A含量中的应用。

在其中一些实施例中，所述甘草为胀果甘草。

在其中一些实施例中，所述组蛋白去乙酰化酶抑制剂选自伏立诺他、烟酰胺和丁酸钠中的至少一种。

在其中一些实施例中，所述伏立诺的终浓度为80～120μM；和/或烟酰胺的终浓度为0.5～2mM；和/或丁酸钠的终浓度为0.5～2mM。

优选地，所述伏立诺他的终浓度为95～105μM；和/或烟酰胺的终浓度为0.8～1.2mM；和/或丁酸钠的终浓度为0.8～1.2mM。

更优选地，所述伏立诺他的终浓度为100μM；和/或烟酰胺的终浓度为1mM；和/或丁酸钠的终浓度为1mM。

本发明通过研究首次发现，使用组蛋白去乙酰化酶抑制剂处理甘草毛状根或种子苗，能有效提高甘草根部查尔酮A的含量，尤其是使用组蛋白去乙酰化酶抑制剂伏立诺他时，查尔酮A的含量可提高30倍以上，效果显著。本发明提供的方法具有简单、快速、高效和成本低等优点，在医药等领域具有广阔的应用空间。

附图说明

图1为在含有100μM SAHA的MS培养基上培养7d的胀果甘草种子苗(左)，以及培养7d的胀果甘草种子苗中LCA的含量检测结果(右)。

图2为在含有1mM NIC的MS培养基上培养7d的胀果甘草种子苗(左)，以及培养7d的胀果甘草种子苗中LCA的含量检测结果(右)。

图3为在含有1mM NIC的1/2MS液体培养基上培养7d的胀果甘草毛状根(左)，以及培养7d的胀果甘草毛状根中LCA的含量检测结果(右)。

图4为在含有1mM NIC的MS培养基上培养3d、5d、7d的胀果甘草种子苗(上)，以及培养3d、5d、7d的胀果甘草种子苗中LCA的含量检测结果(下)。

图5为在含有1mM NaB的MS培养基上培养7d的胀果甘草种子苗(左)，以及培养7d的胀果甘草种子苗中LCA的含量检测结果(右)。

图6为在含有30μM 5-azaC、100μM SAHA+1mM NIC和100μM SAHA+1mM NIC+30μM 5-azaC的MS培养基上培养7d的胀果甘草种子苗(上)，以及培养7d的胀果甘草种子苗中LCA的含量检测结果(下)。

具体实施方式

本发明下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。

除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。

本发明的术语“包括”和“具有”以及它们任何变形，意图在于覆盖不排他的包含。例如包含了一系列步骤的过程、方法、装置、产品或设备没有限定于已列出的步骤或模块，而是可选地还包括没有列出的步骤，或可选地还包括对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤。

在本发明中提及的“多个”是指两个或两个以上。“和/或”，描述关联对象的关联关系，表示可以存在三种关系，例如，A和/或B，可以表示：单独存在A，同时存在A和B，单独存在B这三种情况。字符“/”一般表示前后关联对象是一种“或”的关系。

本发明中所用材料如下：

固体MS培养基，包括如下组分：4.43g/L MS培养基(Murashige & Skoog 15 BasalMedium with Vitamins)、20g/L sucrose(蔗糖)、0.5g/L MES(吗啉乙磺酸)，调pH至5.7～6.0。

液体1/2MS培养基，包括如下组分：2.215g/L MS培养基(Murashige & SkoogBasal Medium with Vitamins)、20g/L sucrose(蔗糖)、0.5g/L MES(吗啉乙磺酸)，调pH至5.7～6.0。

SAHA母液配制包括以下步骤：称取6.61mg SAHA粉末，于1ml DMSO溶解，即得。

NIC母液配制包括以下步骤：称取39.7mg NIC粉末，于1.3ml无菌去离子水溶解，并通过0.22μm滤膜过滤除菌，即得。

NaB母液配制包括以下步骤：称取35.8mg NaB粉末，于1.3ml无菌去离子水溶解，并通过0.22μm滤膜过滤除菌，即得。

5-azaC母液配制包括以下步骤：称取2.38mg 5-azaC粉末，于1.3ml无菌去离子水溶解，并通过0.22μm滤膜过滤除菌，即得。

含有HDAC抑制剂、DNA甲基转移酶抑制剂的固体MS培养基，配制包括以下步骤：将固体MS培养基高压灭菌，冷却凝固前加入SAHA、NIC、NaB、5-azaC母液至终浓度为100μM、1mM、1mM、30μM。

实施例1

1.胀果甘草种子苗的种植

取300粒胀果甘草种子，置于50ml离心管中，加入10ml浓硫酸，浸泡15-20分钟。吸出浓硫酸，纯水快速冲洗5次，每次15ml，直至没有浓硫酸残留。加入20ml 2％NaClO，消毒15-20分钟。然后再倒出NaClO，用15ml无菌纯水清洗5次，每次静置10min。清洗完之后加入20ml无菌纯水，28℃、200rpm条件下震荡培养24h，甘草种子开始萌发，获得刚萌发的甘草种子苗。

2.胀果甘草毛状根诱导

用外植体浸染法浸染甘草外植体：在MS固体培养基上萌发8天的胀果甘草种子苗，在无菌超净工作台内将其下胚轴和子叶切下来，用于发根农杆菌浸染。浸染后的甘草外植体置于含有250mg/L头孢的1/2MS的培养基上，待胀果胀果甘草毛状根从外植体长出3-5cm后，切下胀果甘草毛状根转移到含有250mg/L头孢的1/2MS培养基上。挑选能够在上述培养基上快速生长的胀果甘草毛状根转移到含有250mg/L头孢的1/2MS培养基中悬浮培养。取上述悬浮培养的一部分胀果甘草毛状根，提取DNA，通过PCR筛选阳性毛根。将生长快速的一株胀果甘草毛状根，继代成多株胀果甘草毛状根。

3.HDAC抑制剂处理胀果甘草种子苗或毛状根

胀果甘草种子苗在MS培养基上萌芽2天后，转移到新的MS培养基上垂直培养，恢复3天，再转移到分别含有HDAC抑制剂SAHA(终浓度为100μM)、NIC(终浓度为1mM)、NaB(终浓度为1mM)和不含HDAC抑制剂(对照组Control)的MS培养基上培养7天，然后收集胀果甘草种子苗的根部。

选取多瓶来自同一株系且生长状态一致的胀果甘草毛状根，转移至液体1/2MS培养基，两天后往1/2MS培养基中加入NIC母液，加入至终浓度为1mM。部分培养基中不添加任何组蛋白去乙酰化酶抑制(对照组Control)，分别培养七天，然后收集胀果甘草毛状根。

4.甘草查尔酮A的提取

(1)将各组培养获得的胀果甘草种子苗的根部或胀果甘草毛状根使用液氮研磨并冻干，获得样品。

(2)纯甲醇提取：在每10mg样品中加入1ml甲醇，超声1小时，同时准备新的离心管，做好标记，超声结束后用移液枪吸取上清液至新的离心管；样品中再次加入1ml纯甲醇，超声1小时，两次合并滤液，蒸干浓缩。

(3)溶解：吸取300μl纯甲醇重悬提取的化合物，所得的提取液用0.22μm滤膜过滤，收集滤液(含LCA)。

4.甘草查尔酮A的含量测定

(1)色谱系统：采用C18柱(150mm×4.6mm,5μm,Shimadzu,Kyoto,Japan)，柱温40℃，流速1ml/min，进样量10μl；流动相A：乙腈，流动相B：0.1％甲酸水；梯度洗脱：t＝0min,30％A；t＝25min,55％A；t＝27min,95％A；t＝30min,95％A；t＝31min,30％A；t＝35min,30％A.LCA的检测波长为370nm。理论板数按LCA峰计算，应不少于8000。

(2)LCA含量计算：通过用不同浓度的LCA标品在HPLC上检测峰面积，建立浓度与峰面积之间的标准曲线，标品质量浓度与吸收值强度间具有良好线性。

结果参见图1～图5。本实施例以胀果甘草种子苗或毛状根为实验材料，使用3种类型HDAC抑制剂(SAHA、NIC、NaB)进行处理，处理时间为7天，然后检测培养物根部LCA的含量。如用100μM SAHA处理胀果甘草种子苗7天的样品中LCA的检测结果为：峰面积分别为307941、317790、315485。根据LCA浓度与峰面积之间的标准曲线得到浓度的计算公式为：y＝2E-08x。利用上述公式计算得到100μM SAHA处理7天的胀果甘草种子苗中LCA的浓度分别为：157.92ng/mg干重、174.93ng/mg干重、131.45ng/mg干重。

如图1所示，与未使用抑制剂处理的对照组相比，100μM SAHA处理胀果甘草种子苗7天，提高LCA含量约31倍。

如图2所示，与未使用抑制剂处理的对照组相比，1mM NIC处理胀果甘草种子苗7天，提高LCA含量约4倍。

如图3所示，与未使用抑制剂处理的对照组相比，1mM NIC处理胀果甘草毛状根7天，提高LCA含量约2倍。

如图4所示，与未使用抑制剂处理的对照组相比，1mM NIC处理胀果甘草种子苗3d、5d、7d，分别提高LCA含量约2、3、5倍。

如图5所示，与未使用抑制剂处理的对照组相比，1mM NaB处理胀果甘草种子苗7天，提高LCA含量约5倍。

组蛋白去乙酰化酶抑制剂(HDAC抑制剂)可以通过抑制组蛋白去乙酰化酶活性，提高蛋白乙酰化作用，从而促进特定基因的转录激活。上述结果表明，使用含有HDAC抑制剂的培养基培养胀果甘草种子苗或毛状根，能提高胀果甘草种子苗或毛状根的组蛋白和非组蛋白的乙酰化程度，进而促进与甘草查尔酮A积累有关的基因表达，从而快速有效地促进甘草查尔酮A的积累。

实施例2

1.胀果甘草种子苗的种植

方法同实施例1

2.HDAC抑制剂和DNA甲基转移酶抑制剂处理胀果甘草种子苗

胀果甘草种子苗在MS培养基上萌芽2天后，转移到新的MS培养基上垂直培养，恢复3天，再转移到含有以下抑制剂的MS培养基(以下浓度为抑制剂在培养基中的终浓度)上培养：30μM 5-azaC,100μM SAHA+1mM NIC,100μM SAHA+1mM NIC+30μM 5-azaC，同时设置不使用抑制剂处理的对照组(Control)，各组培养7天后收集胀果甘草种子苗的根部。

3.甘草查尔酮A的提取

方法同实施例1

4.甘草查尔酮A的含量测定

方法同实施例1

结果如图6所示，与未使用抑制剂处理的对照组相比，30μM 5-azaC处理7天，提高LCA含量约5倍；100μM SAHA+1mM NIC处理7天，提高LCA含量约32倍；100μM SAHA+1mM NIC+30μM 5-azaC处理7天，提高LCA含量约35倍。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对以上实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种提高甘草查尔酮A的方法，其特征在于，包括以下步骤：将甘草根或甘草种子苗置于含组蛋白去乙酰化酶抑制剂的培养基中培养，收集根部，提取甘草查尔酮A。

2.根据权利要求1所述的提高甘草查尔酮A的方法，其特征在于，所述组蛋白去乙酰化酶抑制剂选自伏立诺他、烟酰胺和丁酸钠中的至少一种。

3.根据权利要求2所述的提高甘草查尔酮A的方法，其特征在于，所述伏立诺他在培养体系中的浓度为80～120μM；和/或烟酰胺在培养体系中的浓度为0.5～2mM；和/或丁酸钠在培养体系中的浓度为0.5～2mM。

4.根据权利要求3所述的提高甘草查尔酮A的方法，其特征在于，所述伏立诺他在培养体系中的浓度为95～105μM；和/或烟酰胺在培养体系中的浓度为0.8～1.2mM；和/或丁酸钠在培养体系中的浓度为0.8～1.2mM。

5.根据权利要求1～4所述的提高甘草查尔酮A的方法，其特征在于，所述培养时间为至少3天。

6.根据权利要求1所述的提高甘草查尔酮A的方法，其特征在于，所述培养基为MS培养基，其包含以下浓度的组分：4.43±0.05g/L MS培养基、20±0.2g/L蔗糖、0.5±0.01g/L吗啉乙磺酸，pH5.7～6.0。

7.根据权利要求1所述的提高甘草查尔酮A的方法，其特征在于，所述提取甘草查尔酮A的方法包括以下步骤：

(1)将收集到的培养物的根用液氮研磨并冻干，获得样品；

(2)按照料液比为10：(0.8～1.2)mg/ml向步骤(1)获得的样品中加入甲醇进行超声提取，吸取上清液，过滤，蒸干浓缩，得到甘草查尔酮A。

8.组蛋白去乙酰化酶抑制剂在提高甘草查尔酮A含量中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述组蛋白去乙酰化酶抑制剂选自伏立诺他、烟酰胺和丁酸钠中的至少一种。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述伏立诺他的终浓度为80～120μM；烟酰胺的终浓度为0.5～2mM；丁酸钠的终浓度为0.5～2mM；

优选地，所述伏立诺他的终浓度为95～105μM；烟酰胺的终浓度为0.8～1.2mM；丁酸钠的终浓度为0.8～1.2mM。

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