CN113692545A - 用于观察微米颗粒和纳米颗粒的设备及方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种使用显微镜(1)获得颗粒集合的图像的方法，颗粒集合经由显微镜(1)与数码相机(3)共轭，颗粒集合包括未由显微镜(1)分辨出的纳米颗粒以及由显微镜(1)分辨出的微米颗粒，其中颗粒由光源(2)照射，其中光源(2)经由显微镜(1)照射数码相机(3)。该方法包括以下步骤：‑通过光源(2)使由数码相机(3)记录的图像过度曝光，以使得对于观察者而言，在所记录的图像中显示关于纳米颗粒的光强度变化；‑数字校正所记录的图像的过度曝光，以使得对于观察者而言，在所记录的图像中显示关于纳米颗粒的光强度变化的同时显示关于微米颗粒的光强度变化。

Description

用于观察微米颗粒和纳米颗粒的设备及方法

技术领域

本公开涉及应用于观察天然的颗粒混合物(在其未经过滤的意义上而言)的显微镜领域，所述天然混合物以不可预测的方式包含由光学显微镜分辨出的颗粒(或微米颗粒)以及未由光学显微镜分辨出的颗粒(或纳米颗粒)。

背景技术

更确切地说，本公开涉及经由显微镜和相机观察这种混合物，尤其是观察例如这些由形成相位物体的生物颗粒组成的混合物，所述生物颗粒特别在液体介质(特别是水性介质)中进行布朗运动。

本公开还涉及对包含振幅微米物体或纳米物体的混合物的观察，该振幅微米物体或纳米物体即尤其是在液体介质中进行布朗运动的情况下使其透射或反射或吸收的光衰减的微米物体或纳米物体，例如就像金微米颗粒和金纳米颗粒。

因此，本公开总体上涉及对相位物体或振幅物体的混合物的观察，所述相位物体或振幅物体尤其是在经历布朗运动时的微米物体或纳米物体，但本公开也涉及对具有任何尺寸并且可能不运动的颗粒的观察。

明场分辨光学显微镜在现有技术中是已知的，其使得可以使用由显微镜收集的照射光的光源(尤其是热光源、发光二极管、激光器等)来形成由显微镜分辨出的物体(即，横向尺寸大于显微镜的横向分辨率极限的物体)的强度图像。在该系统中，未分辨出的颗粒通常是不可见的，因此不能与分辨出的颗粒同时被观察到。

在现有技术中同样已知一种对非天然流体样品(因为被预先过滤而仅包含未分辨出的颗粒)中的纳米颗粒进行基于干涉的检测的光学方法和设备，例如从以编号FR3027107(BOCCARA)公开的文献中所知悉的。具体而言，该文献提到了一种经由显微镜和相机观察在水性介质中进行布朗运动的生物纳米颗粒的干涉测量方法。此外，在该文献中公开的明场干涉测量方法特别在该文献的第6页上所呈现的是在所有情况下都需要经过预先过滤并且仅包含小于几百纳米的颗粒的样品。鉴于该文献中使用的光学显微镜的可见光分辨率仅为几百纳米，因此该文献教导了所观察的样品必须仅包含未分辨出的颗粒。因此，在该系统中，预先通过物理过滤从待观察物体中除去的分辨出的颗粒原则上不存在于所观察的物体的任何图像中，因此不能与未分辨出的颗粒同时被观察到。

因此，在现有技术中，尤其在颗粒是在液体基质中进行布朗运动的相位物体的情况下，通过显微镜和相机在图像中观察由显微镜分辨出的颗粒和未由显微镜分辨出的颗粒的混合物(称为天然混合物)的技术问题是一个难题。

用于增加图像(尤其是分辨出的相位物体的图像，无论该相位物体是否处于布朗运动)的对比度的操作在现有技术中也是已知的。特别而言，用于增加图像对比度的这些操作包括对图像的直方图进行变换。在图像处理中，直方图变换通过独立处理每个像素来修改图像。这些变换几乎出现在任何图像处理和分析过程中。特别而言，这些变换通常应用于由相机拍摄的数字图像，其中相机以像素的形式记录图像，每个像素被分配一个灰度级或与颜色相关的多个灰度级，此过程发生在：已记录图像之前，在为了对图像进行归一化的预处理期间；或记录图像之后，在为了改善观察的后处理期间。

在本文件中，适用下列定义：

“图像的归一化”：在图像被记录之前或之后对其直方图的拉伸，使得该直方图包括在用于进行记录的传感器、用于观察的的显示器或观察者的眼睛的整个灰度级范围上拉伸的灰度级，以最大化人类观察者看到的对比度。

“布朗运动”：颗粒在液体或粘性介质中的自发运动，其由热扰动引起并防止颗粒在重力作用下沉降。

“频闪仪”：用于限制相机拍摄的图像的曝光时间并且可以使运动冻结的设备；“频闪图像”被理解为曝光时间短到足以冻结特定运动的图像。

“数字对比度增强”：由人类观察者或能够实施数字方法的系统尤其经由图像的归一化使图像中的可见细节数量增加并使数字图像中的过度曝光得到校正的一组数字方法。

发明内容

本公开涉及一种使用显微镜获得颗粒集合的图像的方法，所述颗粒集合经由所述显微镜与数码相机共轭，所述颗粒集合包括未由所述显微镜分辨出的纳米颗粒以及由所述显微镜分辨出的微米颗粒，其中所述颗粒由光源照射，并且其中所述光源经由所述显微镜照射所述数码相机。该方法包括以下步骤：

-通过所述光源使由所述数码相机记录的图像过度曝光，以在所记录的图像中向观察者显示关于所述纳米颗粒的光强度变化；

-数字校正所记录的图像的过度曝光，以在所记录的图像中向观察者显示关于纳米颗粒的光强度变化的同时显示关于微米颗粒的光强度变化。

作为变型，所述方法可以包括以下特征，这些特征可以单独实施或彼此组合实施(除将导致重大的技术不兼容的情况之外)：

所述纳米颗粒包括病毒，所述微米颗粒包括病毒聚集体；

所述过度曝光的数字校正经由所述图像的直方图的变换而得到；

所述图像的直方图的变换是所述图像的直方图的拉伸；

所述图像的直方图的变换是所述图像的直方图的平移；

所述图像的直方图的变换包括所述图像的直方图的平移以及所述图像的直方图的拉伸；

所述图像的直方图的拉伸是线性的；

所述图像的直方图的拉伸是非线性的。

本公开还涉及一种用于实施上述方法的设备，其中所述光源具有足以经由所述显微镜使由所述数码相机记录的图像过度曝光的光强度，从而呈现关于经由所述显微镜与所述数码相机共轭的纳米颗粒的光强度变化。所述设备包括用于校正由所述相机记录的图像的曝光的数字装置。本公开的教导适用于上述方法、变型和设备的任何组合。

通过阅读以下对设备以及对所提出的方法的实施例的详细描述，上述特征和优点以及其它特征和优点将变得显而易见。该详细描述参照附图进行。

附图说明

附图是示意性的，不一定按比例绘制。附图的目的首先是为了示出本发明的原理。

图1示出了用于观察颗粒的设备的示例。

具体实施方式

下面参照附图详细描述所提出的发明的实施例的示例。这些示例示出了本发明的特征和优点。然而，应记得本发明不限于这些示例。

图1的设备包括：显微镜1；照射显微镜视场的光源2；以及相机3。相机被放置在与显微镜1的物焦平面共轭的像平面中，并且经由显微镜收集直接从照射源2发出的光，从而形成明场图像。可以设置频闪仪(该图中未示出)或用于限制曝光时间的任何其它装置以及用于改善所获取图像的对比度的数字图像处理装置。设置明场配置，以在一方面收集由位于显微镜的视场中的分辨出的相位物体引起的强度变化，并在另一方面收集由也位于显微镜的视场中的未分辨出的相位物体散射的光。

分辨出的物体对直射光的调制被用于观察分辨出的物体，并且由与相机共轭的物焦平面附近的未分辨出的物体散射的光的干涉引起的调制被用于观察未分辨出的物体。

因此，所示出的设备使得可以在相同的图像中以及在相同的参考系中，观察位于自显微镜的物焦平面起在显微镜的景深范围内延伸的切片中的分辨出的和未分辨出的物体，或更一般而言，观察位于自通过显微镜与相机平面共轭的物平面起在显微镜的景深范围内延伸的切片中的分辨出的和未分辨出的物体。假设相机是平面的，但是可以设想相机符合显微镜的场曲而不脱离本公开的教导范围。

在由图1的示例所示的第一实施例中，所述设备包括显微镜1或光学系统、光源2或照射源或源以及相机3。因此，在所有实施例中，本发明包括由显微镜1和相机3收集的照射的光源2。待观察的物体被放置在显微镜1的物空间中，并因此受到照射且以明场模式成像在相机3上。

优选地，对由光源2提供的照射进行准直，以使针对与相机3共轭的纳米颗粒观察到的干涉信号的对比度最大化。

优选具有最高可能发光功率的光源2，或者在任何情况下优选功率足以在曝光时间内充满相机的阱容量或阱深度的光源。其可以是具有尽可能窄的波长带宽的光源2。

因此，可以使用发射波长以405nm为中心的可见光的发光二极管(例如参考编号为M405LP1的品蓝色Thorlabs LED)作为光源2。

然而，也可以使用具有更宽光谱的其它光源，只要这些光源使得可以因其允许实现的信噪比而检测给定尺寸的纳米颗粒。因此，在一个示例性实施例中，已使用白色发光二极管(例如参考编号为MWWHLP1的Thorlabs LED)来提供准直照射。尽管不如上述光谱更窄的蓝色LED合适，但是这种白色LED仍然可以使100nm的纳米颗粒(NP)被观察到(与此相比，蓝色LED可观察到10nm)。这种纳米颗粒在可见光中是无法分辨的。

优选高数值孔径(NA)的物镜，以最大程度地收集由纳米颗粒(NP)散射的光。

因此，可以使用配备有油浸物镜(例如Olympus x100物镜)的显微镜1。照射条件可以由光源在自由空间中的传播定义，或者由允许照射条件改变的聚光器定义(柯勒照射、临界照射或任何其它类型的照射，特别是准直照射)。

在所有实施例中，选择光学系统的放大率、相机3的像素尺寸以及相机3以每秒图像数为单位的采集速率，使得所采集或所记录的两个纳米颗粒图像之间的运动是可量化的。

在所有情况下，明场图像经由显微镜1成像在高动态范围(即，具有大的阱深度)的相机3上，例如Photon Focus公司生产的参考编号为PHF-MV-D1024E-160-CL-12的CMOS相机。如果对像素进行组合，则还可以使用具有更多像素且更浅的阱深度的另一相机。

优选地，相机3以像差的光学校正得到优化并且通常达到衍射极限的光学配置方式被放置在与显微镜1的物焦平面共轭的像平面中。

关于光源2的照射调节，确保显微镜1形成包括分辨出的颗粒和横向未分辨出的颗粒的样品(例如未过滤的天然样品)的明场图像。对于最小可见波长(即400nm)以及数值孔径等于1的物镜，如已知的，分辨率极限接近200nm。还可以使用其中存在不运动的分辨出的颗粒和未分辨出的颗粒的试样。

用本发明特别可以观察到由未过滤的天然水组成的样品，从理论上说该天然水包含形成相位物体群、尺寸在10nm和10μm之间的病毒和病毒聚集体。任何含有生物颗粒的液体样品都可以用本发明的设备和方法观察。总体而言，本发明特别适用于观察包括进行布朗运动的相位物体的天然介质。

在某些实施例中，一方面，可以定义大约每秒130个图像或更多的相机采集速率，另一方面，可以对由相机拍摄的每个图像或频闪图像应用对比度增强操作，该对比度增强操作适用于使用明场显微镜获得的过度曝光图像(即在不使图像饱和的情况下使其曝光最大化)。因此，在存在分辨出的物体的情况下，与给定信噪比兼容的相机采集速率的任何增加都有利于观察越来越小的未分辨出的物体。在所有情况下，采集速率都选择得尽可能高，以使得尽可能成功地跟踪颗粒的布朗运动，同时确保相机的阱被完全填充，以使散粒噪声最小化，该散粒噪声是某些实施例中的主要噪声源。

如果图像处理装置允许，则可以实时应用对比度增强操作，或者随后应用于存储在图像存储器中的频闪图像序列。

因此，可以使得在用单个设备获得的图像中向人眼显示由于直射光和由未被显微镜分辨出的颗粒散射的光之间的干涉而引起的对比度增强干涉图案以及由显微镜分辨出的颗粒的光学图像，其中所述图像具有高对比度并且包括人类观察者可见的细节而不饱和。

本发明的一个优点在于，两种类型的颗粒的表现形式(由干涉成像和强度成像生成)共享相同的空间参照系，因为这两种类型的颗粒严格地用相同的明场设备获得。如果显微镜和通过显微镜与相机共轭的物平面之间的距离在机械上稳定，则因此存在以切片方式对尺寸小于或大于显微镜的分辨率极限的颗粒进行成像的定量装置。

这尤其不仅可以观察在空间上演变的分辨出的颗粒或未分辨出的颗粒的集合(即其中一些颗粒被分辨出而一些颗粒未被分辨出的不同颗粒的集合)，而且可以观察在时间上演变的分辨出的颗粒或未分辨出的颗粒的集合(即相同颗粒的不同尺寸的集合，例如在尺寸从未分辨出的直径连续增加到分辨出的直径的气泡的各种尺寸的情况下)。在本申请中，在本发明的所有实施例中，表述“颗粒集合”至少覆盖可经历这两种演变的集合。

本发明的一个优点是能够用相同的仪器获得两种类型的成像，因此自然地，在相同的空间参照系中结合了由显微镜根据颗粒尺寸自动执行的两种类型的成像(散射光和直射光之间的干涉测量法和传统的强度成像)。

因此，通过上述实施例的方法，不仅可以可靠地测量两个分辨出的颗粒之间或两个未分辨出的颗粒之间的距离，而且可以测量分辨出的颗粒和未分辨出的颗粒之间的距离。

因此，该实施例使得可以获得在厚度等于显微镜景深的切片中的天然的分辨出的颗粒和未分辨出的颗粒的切片成像。

此外，可以同时应用获取和增加图像的光学对比度的步骤，以实现实时成像，或者以时间偏移的方式，在为了降低噪声而对图像进行时间处理之后获得非实时成像。

对于尺寸大于10nm的颗粒，可以选择短于或等于1/130秒的曝光时间。通常，可以选择该时间以冻结最快运动颗粒的布朗运动，即，以确保待成像的最小颗粒的运动在频闪图像的曝光时间中不被显微镜分辨出。

因此，对于最小曝光时间，可以计算出可利用该实施例的设备和方法成像的颗粒的最小尺寸，即，本发明的设备的干涉分辨能力。

在干涉图像和强度图像都不饱和的约束条件下，图像亮度的调整满足使亮背景最大化或过度曝光到最大的条件，这是显微镜中的常规调整。这种调整可以使人类观察者在显示器上观察到频闪图像。

在该明场设备中，照射源可以是任何类型的光源，例如灯型热光源、发光二极管(LED)或激光器。关于显微镜，所得到的照射可以是空间相干或不相干的，和/或时间相干或不相干的。

因此，该实施例的设备使得可以利用相同的明场显微镜联合实现干涉成像(经由散射光和直射光)和强度成像(经由衰减的直射光)。

为了提高频闪图像或其时间平均值的对比度，特别可以应用直方图的拉伸或扩展(也称为图像的归一化)，频闪图像由于其亮背景而特别地趋向白色饱和，并且通常不向肉眼显示任何可见的细节。因此，图像的直方图在图像的整个级别范围内的分布对于增加对比度而言是特别有效的方式。应当注意，在相位物体的常规或分辨显微镜中，这种情况对应于有缺陷的显微镜设置，其中没有优化照射条件，并且其中不需要相机有宽范围的最低灰度级。

利用仅包括明场显微镜的系统、使得可以通过频闪方式获取图像的系统(特别是相机)以及用于提高图像对比度的图像处理装置，因此获得了一种设备，当该设备应用于天然样品的观察时，能够生成进行布朗运动的相位物体的同步图像，而无需对颗粒进行依赖于尺寸的物理过滤。

应当注意，归一化操作提高了未分辨出的颗粒的干涉图案和分辨出的颗粒的强度图案的对比度。

许多变型实施例是可能的，特别是通过实现频闪图像的直方图的平移，尽管这会在处理之后导致较低对比度的频闪图像。

根据所观察到的颗粒的类型，还可以对频闪图像的直方图应用线性或非线性的归一化操作。特别而言，由于分辨出/未分辨出的颗粒的强度通常随样品而变化，所以每个非线性归一化可以是特定于样品的。

本发明也可以使用可以从频闪图像去除背景并提高其对比度的任何其它方法。

因此，在本发明的所有实施例中，处理过程将从通过以其最大功率使用的光源使相机经由显微镜记录的图像过度曝光开始，以期随后对该过度曝光进行数字校正。该方法使得可以在单个图像中获得关于未由显微镜分辨出的纳米颗粒的强度变化(人眼可见)，同时获得关于由显微镜分辨出的微米颗粒的强度变化(人眼可见)。换句话说，该方法使得可以在单个图像中获得与由观察介质中存在未分辨出的纳米颗粒导致的散射光的干涉相关的光强度变化，同时获得与相同介质中分辨出的微米颗粒的存在相关的光强度变化。

在颗粒群的每个颗粒的尺寸包括在10nm和10微米之间的情况下，或者在颗粒群包含未由在可见光下操作的光学显微镜分辨出的颗粒以及由该显微镜分辨出的颗粒的情况下，本发明特别适合于由观察者观察颗粒群。

在本发明的背景下，“直方图”被理解为数字图像中的光强度或“灰度级”的分布。

本发明可在工业上应用或可用于显微镜领域。

本公开中描述的实施例或实施例的示例已经通过说明的方式给出并且是非限制性的；根据本公开，本领域技术人员将能够容易地修改这些实施例或实施例的示例，或者设想其他实施例，同时仍维持在本发明的范围内。

特别而言，如果上述实施例或上述实施例的示例的一些特征单独足以实现本发明的优点之一，则本领域技术人员能够容易地设想仅包括这些特征的变型。此外，这些实施例或实施例的示例的不同特征可以单独使用或彼此组合使用。当组合时，这些特征可以如上所述或以其他方式进行组合，本发明不限于本说明书中描述的特定组合。特别而言，除非另有说明，关于一个实施例或实施例的示例描述的特征可以以类似的方式应用于另一个实施例或实施例的示例。

Claims (9)

1.一种使用显微镜(1)获得颗粒集合的图像的方法，所述颗粒集合经由所述显微镜(1)与数码相机(3)共轭，所述颗粒集合包括未由所述显微镜(1)分辨出的纳米颗粒以及由所述显微镜(1)分辨出的微米颗粒，其中，所述颗粒由光源(2)照射，并且其中，所述光源(2)经由所述显微镜(1)照射所述数码相机(3)，所述方法包括以下步骤：

通过所述光源(2)使由所述数码相机(3)记录的图像过度曝光，以在所记录的图像中向观察者显示关于所述纳米颗粒的光强度变化；并且

数字校正所记录的图像的过度曝光，以在所记录的图像中向所述观察者显示关于所述纳米颗粒的光强度变化的同时显示关于所述微米颗粒的光强度变化。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述纳米颗粒包括病毒，并且其中，所述微米颗粒包括病毒聚集体。

3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述过度曝光的数字校正经由所述图像的直方图的变换获得。

4.根据权利要求3所述的方法，其中，所述图像的直方图的变换是所述图像的直方图的拉伸。

5.根据权利要求3所述的方法，其中，所述图像的直方图的变换是所述图像的直方图的平移。

6.根据权利要求4所述的方法，其中，所述图像的直方图的拉伸是线性的。

7.根据权利要求4所述的方法，其中，所述图像的直方图的拉伸是非线性的。

8.根据权利要求3所述的方法，其中，所述图像的直方图的变换包括所述图像的直方图的拉伸以及所述图像的直方图的平移。

9.一种成像设备，包括显微镜(1)、光源(2)以及数码相机(3)，所述成像设备被配置为使用所述显微镜(1)获得颗粒集合的图像，所述颗粒集合经由所述显微镜(1)与所述数码相机(3)共轭，所述颗粒集合包括未由所述显微镜(1)分辨出的纳米颗粒以及由所述显微镜(1)分辨出的微米颗粒，

其中，所述颗粒由所述光源(2)照射，

其中，所述光源(2)经由所述显微镜(1)照射所述数码相机(3)，并且

其中，所述光源(2)具有的光强度足以使经由所述显微镜(1)由所述数码相机(3)记录的图像过度曝光并且导致在所记录的图像中向观察者显示关于经由所述显微镜(1)与所述数码相机(3)共轭的纳米颗粒的光强度变化，

所述设备还包括用于校正由所述相机(3)记录的图像的过度曝光的数字装置，以在所记录的图像中向所述观察者显示关于所述纳米颗粒的光强度变化的同时显示关于所述微米颗粒的光强度变化。

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